CN111560483B

CN111560483B - 用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系及方法和用途

Info

Publication number: CN111560483B
Application number: CN202010666436.XA
Authority: CN
Inventors: 王伟伟; 李潇桐; 李晓爽; 孙雪; 田埂
Original assignee: Geneis Beijing Co ltd
Current assignee: Beijing Yuanma Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-07-13
Filing date: 2020-07-13
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-07-13
Also published as: CN111560483A

Abstract

本发明公开用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系及方法和用途。本发明使将等温扩增反应和PCR扩增反应在同一反应体系中进行，避免的两者之间的相互影响，实现了检测低丰度核酸的目的。比单独PCR检测方法下限要低一个数量级以上，进一步增加了检测的灵敏度和特异性，稳定检出率的同时，通过qPCR扩增曲线CT值进行病毒载量的定量分析。通过整合两组反应的特异性信号放大和高灵敏度荧光检测的一管法设计，缩短检测时间到半小时内，比常规检测缩短3倍以上，从而达到快速稳定检测极低丰度病原的目的，防止微量病原样品检测中的漏检问题。

Description

用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系及方法和用途

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂领域，具体地涉及用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系及方法和用途。

背景技术

目前核酸检测是诊断新型冠状病毒感染的最准确、最方便的方式。虽然已开发针对核酸检测的各种方法，但是仍然不能避免出现各种假阴性，这些假阴性病例，对于这种传染性极强的疾病的防控带来了非常不利的影响，严重影响防控、防治。

发明内容

针对现有技术中存在的至少部分技术问题，本发明提供一管法检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，其包括溶解于缓冲液中的引物组和反应酶组，其中：

所述引物组包含第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，当扩增模板从5’端至3’依次包括B3区、B2区、B1区、F1c区、F2c区和F3c区，且F1区为与F1c区互补的区域，F2区为与F2c区互补的区域，F3区为与F3c区互补的区域，B1c区为与B1区互补的区域，B2c区为与B2区互补的区域，B3c区为与B3区互补的区域时，所述第一引物对的正向引物由F3区组成，反向引物由B3区组成，第二引物对的正向引物由F1c区和F2区组成，反向引物由B1c和B2区组成，所述第三引物对的正向引物对应于F1c区和F2c区之间的序列，反向引物对应于B2和B1区之间的序列，所述第四引物对用于扩增B2区和F2c区之间的片段；所述反应酶组包含低温聚合酶和热启动聚合酶。

根据本发明所述的用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，优选地，所述第一引物对、第二引物对和第三引物对的摩尔比为5:(20-40):(10-20)，且各引物对中两种引用的摩尔数相同。

根据本发明所述的用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，优选地，进一步包括能够靶向第四引物对之间的序列的区域的荧光探针。

根据本发明所述的用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，优选地，所述引物组通过下述方式加入反应体系：

(1) 在第一引物对中分别取0.5μl浓度为8-12μM的正反引物，在第二引物对中分别取1μl浓度为18-22μM的正反引物，在第三引物对中分别取1μl浓度为8-12μM的正反引物，然后将各引物混合得到第一引物预混物，将第一引物预混物稀释100-1000倍后以1:25的体积比加入反应体系；

(2) 使第四引物组和探针以1:1的摩尔比混合得到8-12μM的第二引物预混物，将第二引物预混物以1:25的体积比加入反应体系。

根据本发明所述的用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，优选地，所述反应体系进一步包含dNTP混合物。

本发明的第二方面，一种用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，包括以下步骤：

(1) 将样本添加至反应体系进行混合，在62-67℃下扩增4-6分钟，然后在90-98℃下处理足以使低温聚合酶灭活同时激活热启动聚合酶的时间；

(2) 使反应体系在90-96℃下进行预变性，接下来进行95℃10秒，60℃30秒的循环扩增反应，最后于60℃末收集荧光信号；

(3) 由荧光信号得到扩增曲线，如果扩增曲线为S型或不完全S型，则为阳性，如果扩增曲线为水平型，则为阴性；

其中，所述反应体系为根据权利要求1-5任一项所述的反应体系。

根据本发明所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，优选地，所述循环数为15-25。

根据本发明所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，优选地，所述低丰度是指每个反应体系中含10个拷贝数以下，或在100ng/500ng人基因组DNA背景下为10个拷贝以下。

根据本发明所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，优选地，所述第一引物对的序列如SEQ ID No:1-2所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID No:3-4所示，所述第三引物对的序列如SEQ ID No:5-6所示，所述第四引物对的序列如SEQ ID No:7-8所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID No:9所示，且荧光探针的发光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明的第三方面，提供反应体系在制备用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的试剂盒中用途。

本发明针对新型冠状病毒产生的原因进行了深入分析，发现其中一部分假阴性的产生原因在于样本中病毒核酸的浓度较低，例如当在100ng或500ng人基因组DNA背景下浓度低于10拷贝时，qPCR就不能对病毒进行有效检测。虽然加大样本采集的量可以在一定程度上减少此类假阴性的产生，但是这增加了受试者的负担，同时对于提取纯化手段也提出了要求。与此不同，本发明通过设计四对引物，并通过进一步优化反应条件实现了检测低丰度核酸的目的。比单独的PCR检测方法下限要低一个数量级以上，进一步提高了检测的灵敏度和特异性，以及检测的可重复性和稳定性，从而达到检测极低丰度病原的目的，防止微量病原样品检测中的漏检问题。

本发明能够将等温扩增与定量PCR两个独立反应过程在同一个反应体系中依次进行，通过优化设计避免两个反应之间的影响。这些优化包括对反应试剂和反应条件的修改和优化，包括单不仅限于对引物序列和浓度的设计，反应时间的调整，缓冲液比例和酶浓度的优化。本发明在一次加入待检测样品后，不需再次开盖转运反应液，减少交叉污染发生概率，缩短全流程反应时间至半小时内，检测灵敏度下限为10拷贝一下，比单独等温扩增和定量PCR低一到两个数量级。本发明的待检测样品可以是RNA，反应在一管内进行，其间不需要开盖，30分钟内即可出结果。通过新的检测反应流程设计，实现高灵敏度，快速，准确，定量，减少交叉污染的目的。本发明在稳定检出率的同时，通过qPCR扩增曲线CT值进行病毒载量的定量分析。通过整合两组反应的特异性信号放大和高灵敏度荧光检测的一管法设计，缩短检测时间到半小时内，比常规检测缩短3倍以上。

附图说明

图1 第一扩增反应的最适温度的凝胶电泳图。最适温度测试，1-3分别是60度，62度和64度的扩增结果，综合考虑特异性和产量，最终确定64度为该组LAMP引物最适反应温度。

图2 不同模板浓度的恒温扩增凝胶电泳图。图2A中，M为DNA ladder，1-4分别为10、10²、10³、10⁴拷贝目标在100ng gDNA背景下的恒温扩增实验结果，从胶图分析，10²、10³、10⁴拷贝数检测呈阳性，10¹拷贝数的阴阳性不能确定；图2B中，M为DNA ladder，1-4分别为10、10²、10³、10⁴拷贝目标在500ng gDNA背景下的恒温扩增实验结果，从胶图分析，10²、10³、10⁴拷贝数检测呈阳性，10¹拷贝数的阴阳性不能确定。

图3 第二扩增反应荧光信号结果判读示例图。其中，（1）复孔A和B曲线为10¹拷贝数的等温扩增产物的qPCR荧光信号扩增曲线图；（2）复孔C和D曲线为10²拷贝数的等温扩增产物的qPCR荧光信号扩增曲线图；（3）复孔E和F曲线为10³拷贝数的等温扩增产物的qPCR荧光信号图；（4）复孔G和H曲线为10⁴拷贝数的等温扩增产物的qPCR荧光信号图。（5）为阴性对照复孔，无扩增曲线。

图4 本发明一种示例性引物位置的图。

图5为一管法反应的结果图。图5A为以水作为阴性对照的结果图；图5B为阴性样本1的结果图；图5C为阴性样本2的结果图；图5D为阳性样本1(100-1000拷贝病毒)的结果图；图5E为阳性样本2(5-50拷贝病毒)的结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。

用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系]

本发明的第一方面，提供一种用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，本文有时简称“本发明的反应体系”，其用于使等温扩增反应和PCR扩增反应两者在同一体系进行反应，即一管法反应。本发明中等温扩增反应也称作第一扩增反应，PCR或定量PCR(qRCR)也称作第二扩增反应。

本发明的反应体系包含溶解于优化缓冲液中的引物组和反应酶组。引物组和反应酶组分别为两种以上成分的混合物，不包括各成分单独存在的情况。

本发明的引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对。其中，每种引物对分别能够扩增得到特定的片段或扩增片段。第一引物对的扩增产物长度小于第二引物对的扩增产物。一般而言，第一引物对、第二引物对和第三引物对以混合物使用，用于进行第一扩增反应，其通常为恒温扩增反应。而第四引物对单独使用，或进一步与荧光探针组合使用，用于进行第二扩增反应，其通常为基于聚合酶的链式反应。

本发明的第一引物对、第二引物对和第三引物对具有特殊的设计，为说明方便，假定第一扩增反应的模板从5’端至3’依次包括B3区、B2区、B1区、F1c区、F2c区和F3c区，其中F1区为与F1c区互补的区域，F2区为与F2c区互补的区域，F3区为与F3c区互补的区域，B1c区为与B1区互补的区域，B2c区为与B2区互补的区域，B3c区为与B3区互补的区域。在此假定条件下，第一引物对的正向引物由F1c区和F2区组成，其反向引物由B1c和B2区组成。第二引物对的正向引物由F3区组成，反向引物由B3区组成。第三引物对的正向引物对应于F1c区和F2c区之间的序列，反向引物对应于B2和B1区之间的序列。第四引物对用于扩增B2区和F2c区之间的片段。

为了实现本发明的目的，需将第一引物对、第二引物对和第三引物对设计为能够得到三者摩尔比为5:(20-40):(10-20)的形式，第一引物对、第二引物对和第三引物对三者的摩尔比优选为5:(25-35):(12-16)，更优选5:(26-30):(14-18)。发明人发现在上述范围内使得到的扩增产物更有利于用作第二扩增反应的模板，从而提高检测灵敏度。三种引物对可以单独存放，在使用时配制为上述摩尔比的混合物或直接配制成用于第一扩增反应的体系，或三对引物预先以上述摩尔比混合。每对引物中，两条引物的摩尔比一般而言为等量，即基本上为1:1。

本发明的反应酶组包含低温聚合酶和热启动聚合酶。两者同时存在于反应体系中。本发明的低温聚合酶或低温DNA聚合酶是指在70℃以下，例如50-68℃，优选60-65℃具有DNA聚合酶活性，而在高于70℃，例如95℃或98℃时酶活性丧失的酶。本发明的热启动聚合酶是指在经过高温处理或激活之前没有DNA聚合酶活性，而经过高温处理或激活后启动了DNA聚合活性的酶。此处的高温是指高于70℃，例如95℃或98℃。

本发明的优化缓冲液是指基于Tris-HCl的缓冲液，其一般包含Tris-HCl、硫酸镁、硫酸铵、氯化钾、氯化镁和吐温及DMSO。优选地，本发明的优化缓冲液包括将Bst聚合酶缓冲液和qPCR缓冲液两种缓冲液按特定比例混合得到，例如以1:8-12的比例混合Bst聚合酶缓冲液和qPCR缓冲液。优选地，控制反应体系中镁离子浓度至5mM以上至7mM以下，优选5.5-6.5mM。镁离子浓度过高，PCR反应的特异性降低。镁离子浓度过低，则等温反应效果下降。

用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的方法，本文简称“本发明的方法”。本发明的方法包括诊断方法，也包括非诊断方法，非诊断方法的实例包括但不限于科学研究、临床中间数据的获取等。

本发明的方法包括以下步骤：

(3) 由荧光信号得到扩增曲线，如果扩增曲线为S型或不完全S型，则为阳性，如果扩增曲线为水平型，则为阴性。

本发明中，步骤(1)中，在将样本添加至反应体系后，优选直接进行62-67℃下，例如63、64或65℃的扩增，而无需首先在95-98℃的高温热处理。该高温热处理步骤在传统方法中是必要。62-67℃下的扩增时间一般为6分钟以下，优选5分钟以下，还优选2分钟以上，更优选4分钟以上。在扩增之后，本发明需要进行高温处理步骤。一般在90-98℃下处理足以使低温聚合酶灭活同时激活热启动聚合酶的时间。例如，95℃下处理4-6分钟，例如5分钟。

本发明的反应体系中优选地进一步包含特定的成分，用于避免第一扩增反应与第二扩增反应之间的影响，提高效率。这些特定成分的实例包含DMSO等。特定成分的含量一般为10%以下，优选2-8%，更优选3-5%。

用于检测低丰度新型冠状病毒的试剂盒]

本发明的第二方面，提供一种用于检测低丰度新型冠状病毒的试剂盒。与一般试剂盒不同本发明能够检测样本中低丰度的新型冠状病毒，例如，每5μl样本中含10个拷贝数以下的浓度，在100ng(对于血液样品而言)或500ng(对于组织样品而言)人基因组DNA背景下为10个拷贝以下的浓度。本发明的试剂盒主要通过组合四种不同引物对，和可选的荧光探针而实现该效果。关于四种引物对参见上述说明，在此不再赘述。下述说明荧光探针。

本发明的荧光探针是指含有荧光基团和淬灭基团的探针。其中，荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、 TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素；基于罗丹明的荧光团，例如ROX (6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5。其中，淬灭基团的实例TAMRA、Iowa Black^TM、BlackBerry^TM、Quencher 650(BBQ-650)。

除了上述引物和探针之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，探针或引物)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。

实施例

1. 根据新冠病毒的基因组序列信息(从国家基因库生命大数据平台(CNGBdb)中下载病毒完整reference genome序列(GWHABKF00000000、GWHABKG00000000、GWHABKH00000000、GWHABKI00000000、GWHABKJ00000000等)，靶点设计参考多新冠病毒基因组的N基因一致序列区段)设计第一扩增反应的引物和第二扩增反应(qPCR)的引物/探针。其中第一扩增反应的引物包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)和两条环引物(LF、LB)，引物的具体序列见下表，引物的位置关系参见图4。

表1-核苷酸引物序列表

引物/探针名	序列	SEQ ID No:
			qPCR-F	GGGGAACTTCTCCTGCTAG	7
qPCR-R	CAGACATTTTGCTCTCAAG	8
			qPCR-P	TTGCTGCTGCTTGACAG	9
F3引物	AGCCTCTTCTCGTTCCTC	3
			B3引物	AGTGACAGTTTGGCCTTG	4
FIP引物	GCCAGCCATTCTAGCAGGAGAACACGTAGTCGCAACAGT	1
			BIP引物	GCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGTTGGCCTTTACCAG	2
LF引物	CTGCTGCCTGGAGTTGAAT	5
			LB引物	TTGCTGCTGCTTGACAGAT	6

2. 模板的制备，将带有新冠病毒N基因的质粒溶于水后，测定质粒的浓度值，根据质粒的浓度和质粒的全长进行拷贝数的换算，并稀释至每5μl的体积里含有10¹-10⁴拷贝数的一系列梯度，制备成不同拷贝数的模板DNA。

3.针对模板和引物的Mix 1进行热变性，1-2μl FIP引物和BIP引物(20μM)，0.5μlF3引物和B3引物(10μM)，1-2μl LF引物和LB引物(10μM)，得到等温扩增引物组的混合物。如表2所示。

表2

第一扩增反应体系1组分	体积(μl)
		FIP引物(20μM)	1-2
BIP引物(20μM)	1-2
		F3引物(10μM)	0.5
B3引物(10μM)	0.5
		LF引物(10μM)	1-2
LB引物(10μM)	1-2
		DNA	5

4. 2.5μl Bst聚合酶缓冲液，1μl Bst聚合酶，3.5-7μl dNTP Mix，1.5-3μl MgSO₄(100 mM)，5μl DNA，补水至25μl。混匀离心，60-64℃孵育0.5-1小时，80℃ 5分钟终止反应。用琼脂糖凝胶电泳对恒温扩增反应产物进行检测，出现弥散的条带初步定为阳性，没有出现弥散的条带初步定为阴性。反应体系如表3所示。其中，Bst聚合酶缓冲液含200 mM Tris-HCl pH 8.8，100 mM KCl，100 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM MgSO₄，1% Triton X-100。

表3

等温扩增体系	体积(μl)
		Bst聚合酶缓冲液	2.5
Bst聚合酶	1
		dNTP Mix	3.5-7
MgSO<sub>4</sub> (100 mM)	1.5-3
		第一扩增反应体系1组分	10
补水至	25

5. 最适温度的测试

根据表2和表3的体系，对第一扩增反应的最适温度进行测试，分别测试60-64℃，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行判断。如图1所示，64℃为该引物组扩增最适温度。

6. 不同梯度拷贝数的测试

将质粒稀释至每5μl的体积里含有10¹-10⁴拷贝数在100ng或500ng gDNA背景的一系列梯度模拟DNA样品。用表2的体系进行恒温扩增，反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳进行判断，结果如图2所示。10²、10³、10⁴拷贝数检测呈阳性，10¹拷贝数的阴阳性不能确定，单纯从胶图分析，存在假阴性结果。

7. 荧光定量PCR。12.5μl qPCR法缓冲液，1μl 引物(qPCR-F和qPCR-R)，0.8μl 探针(qPCR-P)，1μl酶预混液，用5μl 稀释缓冲液稀释第一扩增产物100倍，设置反应温度为预变性95℃ 30秒，扩增反应95℃10秒，60℃30秒，45个循环，于60℃末收集荧光信号。发光基团选择FAM，荧光淬灭基团选择TAMRA。反应结果通过软件生成的扩增曲线进行判断。阴阳性判断标准：扩增曲线是S型或者不完全S型的，为阳性；扩增曲线是水平的，为阴性。结果如图3所示，由图3可判断四个样品的检测结果都是阳性。

8. 基于上述3-7步骤，设计一管法反应体系如下：

表4

反应体系组分	体积(μl)
		Bst聚合酶缓冲液	2.5
Bst聚合酶（10-100倍稀释）	1.0
		dNTP Mix （10mM）	3.0
MgSO<sub>4</sub> (100 mM)	1.5
		等温扩增引物组（100-1000倍稀释）	1.0
2XqPCR缓冲液	12.0
		qPCR热启动聚合酶	1.0
qPCR引物和探针（10uM）	1.0
		RNA/DNA样品	2.0
总体积	25.0

接下来进行如下反应：65℃ 5分钟等温扩增，95℃ 5分钟，灭活等温扩增酶同时热启动PCR聚合酶，进入定量PCR流程，预变性95℃30秒，扩增反应95℃10秒，60℃30秒，20个循环，于60℃末收集荧光信号。反应结果如图5所示。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 元码基因科技（北京）股份有限公司

<120> 用于检测低丰度新型冠状病毒的反应体系及方法和用途

<130> BH2000191-1

<141> 2020-07-10

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gccagccatt ctagcaggag aacacgtagt cgcaacagt 39

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcggtgatgc tgctcttgct ttgttggcct ttaccag 37

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agcctcttct cgttcctc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agtgacagtt tggccttg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctgctgcctg gagttgaat 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ttgctgctgc ttgacagat 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggggaacttc tcctgctag 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cagacatttt gctctcaag 19

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ttgctgctgc ttgacag 17

Claims

1.一种用于一管法检测低丰度新型冠状病毒的反应体系，其特征在于，包括溶解于缓冲液中的引物组、反应酶组和荧光探针，其中：

所述引物组包含能够与新型冠状病毒的N基因中的部分连续序列互补的第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对，其中，第一引物对、第二引物对和第三引物对为用于等温扩增的引物，当扩增模板从5’端至3’依次包括B3区、B2区、B1区、F1c区、F2c区和F3c区，且F1区为与F1c区互补的区域，F2区为与F2c区互补的区域，F3区为与F3c区互补的区域，B1c区为与B1区互补的区域，B2c区为与B2区互补的区域，B3c区为与B3区互补的区域时，所述第一引物对的正向引物由F3区组成，反向引物由B3区组成，第二引物对的正向引物由F1c区和F2区组成，反向引物由B1c和B2区组成，所述第三引物对的正向引物对应于F1c区和F2c区之间的序列，反向引物对应于B2和B1区之间的序列，其中所述第一引物对、第二引物对和第三引物对的摩尔比为5:(20-40):(10-20)，且各引物对中两种引物的摩尔数相同；

所述第四引物对和所述荧光探针用于聚合酶链式扩增反应，所述第四引物对位于B2区和F2c区之间的片段，且所述荧光探针包含发光基团和荧光淬灭基团，并能够靶向第四引物对之间的序列，所述第四引物和荧光探针在反应体系中的总浓度为0.3-0.5μM；

所述反应酶组包含Bst聚合酶、热启动聚合酶和逆转录酶，其中Bst聚合酶在50-68℃具有DNA聚合酶活性，而在高于70℃时酶活性丧失，热启动聚合酶在经过高于70℃的高温处理或激活之前没有DNA聚合酶活性，而经过高于70℃的高温处理或激活后启动DNA聚合活性；

所述缓冲液由体积比为1:8-12的等温扩增缓冲液和qPCR缓冲液混合得到，且控制反应体系中镁离子浓度为5mM至7mM；

所述第一引物对的序列如SEQ ID No:1-2所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID No:3-4所示，所述第三引物对的序列如SEQ ID No:5-6所示，所述第四引物对的序列如SEQ IDNo:7-8所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID No:9所示。

2.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述引物组通过下述方式加入反应体系：

3.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系进一步包含dNTP混合物。

4.一种用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 将样本添加至反应体系进行混合，在62-67℃下扩增4-6分钟，然后在90-98℃下处理足以使Bst聚合酶灭活同时激活热启动聚合酶的时间；

其中，所述反应体系为根据权利要求1-3任一项所述的反应体系。

5.根据权利要求4所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，其特征在于，循环次数为15-25。

6.根据权利要求4所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，其特征在于，所述低丰度是指每个反应体系中含10个拷贝数以下，或在100ng/500ng人基因组DNA背景下为10个拷贝以下。

7.根据权利要求4所述的用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的非诊断方法，其特征在于，荧光探针的发光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA。

8.根据权利要求1-3任一项所述的反应体系在制备用于检测样本中低丰度新型冠状病毒的试剂盒中的用途。