CN113136454B - 一种用于检测多种流感病毒的多重lamp引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合及其应用，其通过将传统的6区域2对引物改良成8区域4对引物，增加F4和B4引物，缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，且引物之间不会造成假阳性。本发明提供的用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，可检测是否感染甲型流感H1N1、甲型流感H3N2或乙型流感，高效快速，利于推广。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合及其应用。
背景技术
流行性感冒病毒(influenza virus)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒，其分为甲型流感病毒(如甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2病毒等)、乙型流感病毒和丙型流感病毒三种，其中甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。
环介导等温扩增技术(1oop-mediated isothermal amplification)是一种简单、快速、特异性强、耗费低的核酸扩增技术，可以在等温条件下一步完成，该方法于2000年由Notomi等建立，现已被广泛应用于病原微生物、胚胎性别鉴定、转基因相关检测等方面。
传统的LAMP是由4条特异性引物分别识别靶基因序列两侧各3段6个不同核酸位点序列，通过一种具有链置换特性的DNA聚合酶-Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列。6个不同核酸位点为：5'-B2c-Blc靶片段Flc-F2c-F3c-3'，4条引物分别是：FIP和BIP、F3和B3，FIP为forward inner prime的简称，包含与目的片段F2c互补的F2以及与F1互补的Flc，Flc与F2间可由多聚T(TTTT)连接。BIP为backward inner prime的简称，包含与目的片段B2c互补的B2，以及与B1互补的B1c，B1c和B2间也可由多聚T连接。F3和B3分别为FIP和BIP外侧的引物，与目的片段上的F3c和B3c互补。
现有的流感病毒多重LAMP检测存在引物之间容易造成假阳性，反应速度和灵敏度有待进一步改善的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合及其应用，其可以克服现有技术的缺陷，一次性检测出多种类型流感或者是流感亚型，通过将传统的6区域2对引物改良成8区域4对引物，缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，且引物之间不会造成假阳性。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组及第三引物组；
所述第一引物组用于检测流感病毒H1N1，其由以下引物组成：
M1-F3：GGTCGAAACGTACGTTCTT
M1-B3：GTCTACGCTGCAGTCCTC
M1-FIP：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT-CTATCATCCCGTCAGGCC
M1-BIP：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTA-GAGCGTGAACACAAATCCT
M1-LF：CTCCCTTCTTGATCCC
M1-LB：AGTGGTACCGAGATATGCA
M1-F4：TGAGTCTTCTAACCGAGGT
M1-B4：ACTGCTCTATCCATGTTGTT；
所述第二引物组用于检测流感病毒H3N2，其由以下引物组成：
M2-F3：CCCAATGACAAACCATTCCA
M2-B3：CCCTCAGAATTTTGATGCCT
M2-FIP：CGCATTCCTGTTGCCAATTTCACAGGATCACATACGGGGC
M2-BIP：TTGGCGCAATAGCGGGTTTCCGTACCAACCATCCACCA
M2-LF：CTATGCTTAACATATCTGGGACAG
M2-LB：ATAGAAAATGGTTGGGAGGGA
M2-F4：AGTCTGAATGCATCACTCCA
M2-B4：TGAGTGCTTTTGAGATCTG；
所述第三引物组用于检测乙型流感病毒，其由以下引物组成：
M3-F3：CTTTGTGCGAAAAACAAGCA
M3-B3：CTTGCCCCAAGGGATCTC
M3-FIP：CTGCATTTCCCGTCTCACTCCACATTCACACAGGGCTCA
M3-BIP：GGTCTCAGCTATGAACACAGCATGCAGTTCTTCTGCCAGT
M3-LF：TGGCACTGAAGATCTCGC
M3-LB：CAATGAATGGAATGGGAAAAGGAG
M3-F4：GTAAAACTAGGAACGCTCTG
M3-B4：AGAATGGGGAAGGAATTGCA。
进一步地，所述第一引物组中，M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP、M-LF、M-LB、M-F4、M-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4:3:3。
本发明还提供了上述多重LAMP引物组合在制备检测多种流感病毒的试剂或试剂盒的应用，所述试剂或试剂盒用于：
鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者
检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者
检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒或甲型H3N2流感病毒或乙型流感病毒。
本发明还提供了一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP试剂盒，所述试剂盒包含上述的多重LAMP引物组合。
进一步地，所述的用于检测多种流感病毒的多重LAMP试剂盒，还包含缓冲液和酚红指示剂。
本发明还提供了一种多重LAMP检测方法，其包括以下步骤:
S1、设计并合成上述的引物组合，配制引物混合液；
S2、配制LAMP反应体系，利用步骤S1得到的引物混合液将待测样本中的DNA模板进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化。
进一步的，所述检测方法还包括步骤S0：采集待测样本，将多个待测样本混合进行混检。
进一步地，所述多个待测样本为5个或10个或20个。
进一步地，所述反应体系包括10X等温扩增缓冲液2.5μL，10mM dNTPs 3.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL,耐热逆转录酶0.5μL，LAMP Primer Mix(10X)2.5μL，酚红指示剂1μL，待测样本DNA模板1-9μL，用dH2O补齐至25μL。
进一步地，所述环介导等温扩增反应的温度为65℃，反应时间为15-30min。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括以下：
1、本发明提供的用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，可检测甲型流感H1N1、甲型流感H3N2及乙型流感三个项目，通过将传统的6区域2对引物改良成8区域4对引物，增加F4和B4引物，缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度，且引物之间不会造成假阳性；
2、本发明提供的多重LAMP检测方法与传统的PCR检测方法相比，灵敏度高(比传统的PCR方法高2个数量级，即高100倍)；反应时间短(RNA病毒的反转录过程和置换扩增过程在同一反应体系中进行，15min就能完成反应，常规PCR检测需要1.5小时)；结果判定简单(颜色变化，可视化)；实验设备简单(恒温金属浴)；
3、本发明提供的多重LAMP检测方法由于灵敏度高，与混检会降低样品浓度的特性互补，从而十分适宜与混检联用，两者联用用于大规模流感病毒的筛查可将检测速度提升10-20倍。
附图说明
图1：本发明中Target DNA的示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种检测快速高效、灵敏度高、特异性好的用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合及其应用。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。若无特别说明，本发明选用的原料、试剂或设备均为市售所得。
实施例1：
本实施例提供了一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，参照图1所示，本实施例在传统的F3和B3的外围增加一对引物F4和B4，以提高反应速度和灵敏度。增加一对引物的难度主要在于引物设计，引物过多容易引起引物二聚体。本实施例最终设计筛选得到多重LAMP引物组合的引物序列见表1。
表1实施例1的多重LAMP引物组合的引物序列
注：M1,M2，M3是为了便于区分第一引物组、第二引物组及第三引物组加入的前缀，不改变引物的类型。
人工合成表1中各引物组的引物，备用。第一引物组中，M1-F3、M1-B3、M1-FIP、M1-BIP、M1-LF、M1-LB、M1-F4、M1-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4:3:3。第二引物组及第三引物组中F3、B3、FIP、BIP、LF、LB、F4、B4引物的比例与第一引物组相同。
本实施例中的用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合可以应用于制备多种流感病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒可用于：鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒或甲型H3N2流感病毒或乙型流感病毒。上述试剂盒除了包含该多重LAMP引物组合外，还可以包含缓冲液和酚红指示剂。
实施例2:
本实施例提供了一种多重LAMP检测方法，其利用实施例1的引物组合进行LAMP检测或者先设计并合成得到实施例1的多重LAMP引物组合。
在得到实施例1的多重LAMP引物组合后，进行多种流感病毒检测多重LAMP检测方法具体包括以下步骤：
将该多重LAMP引物组合配成引物MIX，所述引物MIX中，FIP，BIP浓度为1.6μM，B3和F3浓度为0.2μM，LF和LB浓度为0.4μM,F4和B4浓度为0.3μM；此处μM是行业内常用的μmol/L的缩写。
S2、配制反应体系进行环介导等温扩增反应，本实施例中，将待测样本的检测作为试验组，其反应体系中包含待测样本的DNA模板，所述试验组的反应体系总体积为25μL，其由10X等温扩增缓冲液2.5μL，10mM dNTPs 3.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL,耐热逆转录酶0.5μL，LAMP Primer Mix(10X)2.5μL，酚红指示剂1μL，待测样本DNA模板1-9μL，用dH2O补齐至25μL。
本实施例还以未添加待测样本DNA模板作为对照组(又称NTC组)。酚红指示剂在LAMP的反应过程中，DNA聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变酚红指示剂值，使粉红色/红色反应液变成黄色，整个反应过程快速，颜色改变清晰，肉眼可见。在其他实施例中，预混液也可以根据需要选择其他商业化产品。
将引物MIX和反应体系加入反应管中，然后将该反应管置于65℃金属浴加热15-30min，通过肉眼观察反应管颜色变化(阳性样本红变黄)即判断检测结果。本实施例中，本方法或者试剂盒可以是混合联检的方式，即反应体系中包含第一引物组、第二引物组和第三引物组混合液，若反应管内的液体由红色/粉色变成黄色，则表明甲型流感H1N1、甲型流感H3N2或乙型流感阳性，这时候患者需要进一步确诊和治疗。在其他实施例中，本方法或者试剂盒也可以是单一分开检测，只需将第一引物组、第二引物组及第三引物组分别配制反应体系，分开检测即可。
本实施例进行了不同质粒浓度的梯度试验，也即以反应体系中待测样本DNA模板1μL中的质粒浓度进行梯度实验。检测结果见表2。
表2不同质粒浓度LAMP反应颜色变化对比
由表2可以看出，当质粒浓度≥103时，15分钟即可完成检测，也即15分钟内的检测限为103copies/μL；当质粒浓度≥104时，10分钟即可完成检测。
本实施例还进行了三对引物与四对引物的LAMP检测对比实验，三对引物试验组的引物组中包含F3、B3、FIP、BIP、LF、LB引物；四对引物试验组的引物组相对三对引物试验组还包含B4、F4引物对。该对比实验中，质粒浓度是102copies/μL；检测结果见表3。
表3三对引物与四对引物LAMP对比实验反应颜色变化对比
由表3可以看出，四对引物试验组比三对引物试验组检测更为快速。
实施例3:
本实施例提供了一种多重LAMP检测方法，其在实施例2的步骤基础上，增加了样本采集混检步骤。该步骤具体为：采集待测样本，将多个待测样本混合进行混检。所述多个待测样本为5个或10个。
混合检测是用来减少检测次数的常见方式，常配合PCR(Polymerase ChainReaction,聚合酶链式反应)检测使用。但是混合检测的缺点是：将样品混合会降低待测样品的浓度，可能低于PCR检测下限；导致混合检测效果不理想；但是LAMP灵敏度(检测下限)比常规PCR高100倍，所以混合检测对LAMP检测结果的影响远小于PCR检测。
本实施例中，将混合检测与多重LAMP结合，这样一方面有助于降低大规模检测费用(节省时间)。另一方面，混合检测样本(降低核酸浓度)非常适合LAMP的高灵敏度。
具体的操作步骤可以如下：
S01、采样：待检测者可将搜集有自己待测样本的采集瓶交给采集人员，从而避免医院采样的感染风险和减少采集人员工作量。样本类型可以是鼻咽拭子、唾液等。每个采集管中有2mL灭活型的采样保存液；
S02、样品混合：将采集的样本集中编号，分别从10个样品各取200uL进行混合，充分震荡形成混合待测样本。
S03、核酸检测：核酸检测过程按实施例2中检测流程进行。
S04、实验结果
(a)假如混合样本显示阴性结果，说明待测人员为健康人；
(b)假如混合样本显示样性结果，需要按常规方法重新检测每个样品。
核酸混检特别适用于大人群样本的初步筛查，减少医疗患者工作量。稀释混样检测结果不作为最终确诊依据。
本方法通过减少检测次数来降低费用和节约时间。具体而言如下：
假设1000个人中有一个(或者N个)阳性，其他均为阴性。常规检测方法需要检测1000次样本量。但是混合样本，10个人为1组，存在阳性样本的混合液体为阳性。第一轮：只需检测1000/10＝100次；若混合样本结果显示阴性，可不必进行第二轮；若混合样本结果显示阴性，可必须进行第二轮第二轮：需要按常规方法重新检测每个一个样品，所有只需10次。所有总共筛选次数为110次，远远低于常规的1000次，速度提高接近10倍。当我们检测方法足够灵敏的时候，我们可以将每组筛选人数扩大到20个/组或者100个/组，那么检测效率会进一步提升；而多重LAMP检测的灵敏度则可以进一步扩大到20个/组，这样检测速度提高近20倍。
本实施例中，混合的待测样本也可以是5个，5和10是现有混检的常用选择，也可根据需要选择其他数量进行混合。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
序列表
<110> 厦门健康工程与创新研究院
<120> 一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggtcgaaacg tacgttctt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtctacgctg cagtcctc 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcctgcaaag acactttcca gtctatcatc ccgtcaggcc 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tgaggctctc atggaatggc tagagcgtga acacaaatcc t 41
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tctcccttct tgatccc 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tagtggtacc gagatatgca 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tgagtcttct aaccgaggt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
actgctctat ccatgttgtt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
cccaatgaca aaccattcca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ccctcagaat tttgatgcct 20
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cgcattcctg ttgccaattt cacaggatca catacggggc 40
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ttggcgcaat agcgggtttc cgtaccaacc atccacca 38
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ctatgcttaa catatctggg acag 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
atagaaaatg gttgggaggg a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
agtctgaatg catcactcca 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
tgagtgcttt tgagatctg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
ctttgtgcga aaaacaagca 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
cttgccccaa gggatctc 18
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
ctgcatttcc cgtctcactc cacattcaca cagggctca 39
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ggtctcagct atgaacacag catgcagttc ttctgccagt 40
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
tggcactgaa gatctcgc 18
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
caatgaatgg aatgggaaaa ggag 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
gtaaaactag gaacgctctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
agaatgggga aggaattgca 20
Claims (10)
1.一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，其特征在于：所述引物组合包括第一引物组、第二引物组及第三引物组；
所述第一引物组用于检测流感病毒H1N1，其由以下引物组成：
M1-F3：GGTCGAAACGTACGTTCTT
M1-B3：GTCTACGCTGCAGTCCTC
M1-FIP：TCCTGCAAAGACACTTTCCAGT-CTATCATCCCGTCAGGCC
M1-BIP：TGAGGCTCTCATGGAATGGCTA-GAGCGTGAACACAAATCCT
M1-LF：CTCCCTTCTTGATCCC
M1-LB：AGTGGTACCGAGATATGCA
M1-F4：TGAGTCTTCTAACCGAGGT
M1-B4：ACTGCTCTATCCATGTTGTT；
所述第二引物组用于检测流感病毒H3N2，其由以下引物组成：
M2-F3：CCCAATGACAAACCATTCCA
M2-B3：CCCTCAGAATTTTGATGCCT
M2-FIP：CGCATTCCTGTTGCCAATTTCACAGGATCACATACGGGGC
M2-BIP：TTGGCGCAATAGCGGGTTTCCGTACCAACCATCCACCA
M2-LF：CTATGCTTAACATATCTGGGACAG
M2-LB：ATAGAAAATGGTTGGGAGGGA
M2-F4：AGTCTGAATGCATCACTCCA
M2-B4：TGAGTGCTTTTGAGATCTG；
所述第三引物组用于检测乙型流感病毒，其由以下引物组成：
M3-F3：CTTTGTGCGAAAAACAAGCA
M3-B3：CTTGCCCCAAGGGATCTC
M3-FIP：CTGCATTTCCCGTCTCACTCCACATTCACACAGGGCTCA
M3-BIP：GGTCTCAGCTATGAACACAGCATGCAGTTCTTCTGCCAGT
M3-LF：TGGCACTGAAGATCTCGC
M3-LB：CAATGAATGGAATGGGAAAAGGAG
M3-F4：GTAAAACTAGGAACGCTCTG
M3-B4：AGAATGGGGAAGGAATTGCA。
2.如权利要求1所述的用于检测多种流感病毒的多重LAMP引物组合，其特征在于：所述第一引物组中，M1-F3、M1-B3、M1-FIP、M1-BIP、M1-LF、M1-LB、M1-F4、M1-B4的摩尔比为2:2:16:16:4:4:3:3。
3.如权利要求1或2所述的多重LAMP引物组合在制备检测多种流感病毒的试剂或试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒用于：
鉴定甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者
检测待测样本中是否含有甲型H1N1流感病毒和/或甲型H3N2流感病毒和/或乙型流感病毒；或者
检测待测病毒是否为甲型H1N1流感病毒或甲型H3N2流感病毒或乙型流感病毒。
4.一种用于检测多种流感病毒的多重LAMP试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如权利要求1所述的多重LAMP引物组合。
5.根据权利要求4所述的用于检测多种流感病毒的多重LAMP试剂盒，其特征在于：还包含缓冲液和酚红指示剂。
6.一种多重LAMP检测方法，其特征在于：包括以下步骤:
S1、设计并合成如权利要求1或2所述的引物组合，配制引物混合液；
S2、配制LAMP反应体系，利用步骤S1得到的引物混合液将待测样本中的DNA模板进行环介导等温扩增反应，观察反应体系的颜色变化。
7.如权利要求6所述的多重LAMP检测方法，其特征在于：还包括步骤S0：采集待测样本，将多个待测样本混合进行混检。
8.如权利要求7所述的多重LAMP检测方法，其特征在于：所述多个待测样本为5个或10个或20个。
9.如权利要求6所述的多重LAMP检测方法，其特征在于：所述反应体系包括10X等温扩增缓冲液2.5μL，10mM dNTPs 3.5μL，100mM MgSO4 1.5μL，Bst DNA聚合酶(8U/μL)1μL,耐热逆转录酶0.5μL，LAMP Primer Mix(10X)2.5μL，酚红指示剂1μL，待测样本DNA模板1-9μL，用dH2O补齐至25μL。
10.如权利要求6所述的多重LAMP检测方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的温度为65℃，反应时间为15-30min。
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