CN111500782A - 一种新型hiv-1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及应用 - Google Patents

一种新型hiv-1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型HIV‑1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及应用。本发明提供了用于HIV RT耐药检测的引物组，由SEQ ID No.1‑6所示六条引物，以及分别在SEQ ID No.7至SEQ ID No.10的5’末端连接Barcode序列后所示四条引物组成。本发明中RT的cDNA合成和巢式PCR第一轮扩增在同一反应体系中完成；巢式PCR第二轮扩增中在引物的首尾加上Barcode序列；第二轮扩增产物纯化后进行高通量测序，从而获得HIV‑1 RT区基因突变信息。本发明建立的新型HIV‑1逆转录酶区基因变异检测方法，低成本、产出高。本发明对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。

Description

一种新型HIV-1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种新型HIV-1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及应用。
背景技术
随着ART的广泛应用，HIV耐药性问题逐步凸显，已经成为艾滋病防控和治疗领 域的关键问题。HIV耐药性是病毒、药物和宿主共同作用的结果。在药物选择压力下， HIV耐药毒株被筛选出来并逐渐发展成为优势毒株，临床表现为药物敏感性降低和/ 或病毒学反应不理想，最终影响ART的治疗效果。耐药导致ART失败的报道层出不 穷，如在某些开展ART地区进行的耐药监测显示，约有50％患者经历免疫学失败，继 而HIV耐药性毒株出现并快速流行；某些地区，针对一线药物的耐药性毒株的流行率 已超过50％，并且新诊断人群传播性耐药亦呈快速上升趋势。HIV耐药毒株的传播与 流行为艾滋病的防控也带来了前所未有的困难。
越来越多的证据表明，HIV-1感染者体内存在的劣势耐药毒株对抗病毒治疗效果有显著的影响，并且劣势耐药毒株常常是传播的原发耐药毒株的存在形式。习惯上我 们将基于群体测序(population-based sequencing)未能检测到的、携带有导致对药物 敏感性下降的突变位点的变异/突变毒株称之为劣势耐药毒株(Minor HIV-1 Drug ResistanceStrains)，这些毒株在体内庞杂的HIV-1准种家族中所占比例往往不到20％， 而这些少量存在的劣势耐药毒株在药物选择压力与趋利避害进化过程中发展成为优势 毒株，最终导致抗病毒治疗的失败。如何在抗病毒治疗前了解患者本底耐药情况、体 内劣势耐药毒株存在情况，对指导后期的抗病毒治疗具有重要的指导意义；如何为抗 病毒治疗失败患者选择切实可行的后期治疗方案，劣势耐药毒株的检测对方案的选择 也是大有裨益。检测艾滋病患者体内劣势耐药毒株并将这一检测结果应用于艾滋病的 防控已成为全球共识。在抗病毒治疗领域，发现未治疗人群中存在的劣势耐药毒株会 增加治疗失败的风险，即使劣势耐药毒株所占份额不足1％，它也会使得病毒学抑制 失败的风险增加2.5倍左右；越来越多的数据证明，多数抗病毒治疗的失败与基线水 平存在的劣势耐药毒株有关。通过对传播性耐药(transmitted drug-resistance,TDR) 的研究，多数TDR传给未经抗病毒治疗的个体时以劣势毒株形式存在，而常规方法往 往又无法检测到这一低水平的劣势耐药毒株，这为TDR的防控带来了困难。此外， HIV劣势耐药毒株亦是HIV-1准种家族的一份子，该毒株在患者体内如何进化也是一 个备受关注的问题。
HIV-1耐药性突变位点是HIV-1多态性位点的一种表现形式，目前多数检测检测方法也是通过检测某些多态性位点来分析HIV-1耐药发生情况的，如目前使用最为广 泛的Sanger测序法、杂交法等。当前应用于HIV-1劣势耐药毒株检测方法很多，这些 方法在检测劣势耐药毒株都有一定的优势，可将劣势耐药毒株抽丝剥茧般筛查出来并 获得所占比例，使得在后续治疗中有的放矢，积极推动了艾滋病的防控。虽说上述方 法对艾滋病的防控起到了一定作用，但由于方法的局限性使得HIV劣势耐药毒株的检 测没有得到全面推广，如一些方法检测位点过于单一、不能很好区分多态性位点(如 ASPCR、OLA、GeneChipTM)、检测费用高昂及耗时费力(如SGS)、检测范围过窄 (TyHRT、LiPA)等因素限制了方法的推广使用。因此来说，尽管劣势耐药毒株在艾 滋病防控中的重要意义大家有所共识，但由于检测方法学问题其应用实施缓慢。
21世纪以来，以Roche公司的454、Illumina公司的Solexa和ABI公司 的Solid为代表的高通量测序技术相继诞生并迅速发展，使得生物测序技术进入了一 个日新月异的时代。高通量测序技术又称二代测序技术(next generation sequencing， NGS)，该技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定 DNA的序列，具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖面广以及产出巨大等特点， 目前应用较为广泛的技术平台包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer 和Applied Biosystems SOLIDsystem，三个技术平台各有优点，其中Illumina/SOLID由 于测序准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94％，从而准确度可以达到99.999％， 是目前第二代测序技术中准确度最高的。在有限的艾滋病抗病毒治疗药物中，RTIs是 应用最早且最为广泛的一类药物，因此在抗病毒治疗中发挥着举足轻重的作用，但耐 药问题也是一个不容忽视的大问题。如何将深度测序技术应用于HIV-1耐药检测，尤 其应用于针对HIV-1 RTIs的劣势耐药毒株的检测具有重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于深度测序的适用于HIV-1逆转录酶耐药突变位点的检测，尤其是针对逆转录酶区劣势耐药突变位点的检测方法。
本发明基于前期已有的HIV-1耐药检测平台基础上，对引物序列进行重新组合、优化检测条件，实现对HIV-1逆转录酶区(RT)耐药性突变位点的检测。
第一方面，本发明要求保护用于HIV RT耐药检测的引物组。
本发明所要求保护的用于HIV RT耐药检测的引物组，由如下组成：
引物1：如SEQ ID No.1所示单链DNA；
引物2：如SEQ ID No.2所示单链DNA；
引物3：如SEQ ID No.3所示单链DNA；
引物4：如SEQ ID No.4所示单链DNA；
引物5：如SEQ ID No.5所示单链DNA；
引物6：如SEQ ID No.6所示单链DNA；
引物7：在SEQ ID No.7的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物8：在SEQ ID No.8的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物9：在SEQ ID No.9的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物10：在SEQ ID No.10的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA。
本发明所提供的引物组配合高通量测序使用，其中所述引物7、所述引物8、所 述引物9和所述引物10上连接的Barcode序列用于标记区分同批次不同样本。同批次 不同样本上的四条引物上连接的Barcode序列不同。
在所述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物 5和所述引物6的摩尔比可为1:1:1:1:2:2。
第二方面，本发明要求保护用于HIV RT耐药检测的试剂盒。
本发明所要求保护的用于HIV RT耐药检测的试剂盒，可含有前文所述引物组和如下中至少一种：逆转录酶、DNA聚合酶和dNTP。
第三方面，本发明要求保护前文所述引物组或前文所述试剂盒在如下任一中的应用：
(a1)制备用于检测针对HIV-1 RTIs的耐药毒株(尤其是劣势耐药毒株)的产品，或检测针对HIV-1 RTIs的耐药毒株(尤其是劣势耐药毒株)；
(a2)制备用于检测HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的产品，或检测HIV-1逆转 录酶区耐药基因变异。
在本发明中，所述HIV-1逆转录酶区耐药基因变异包括在待测者身上发生频率在20％以下的HIV-1逆转录酶区劣势耐药基因变异。进一步如在待测者身上发生频率在 1％-10％的HIV-1逆转录酶区劣势耐药基因变异。
所述应用为非疾病诊断治疗性应用，不以获得诊断结果或健康状况为直接目的。
第四方面，本发明要求保护如下方法A1或方法A2：
方法A1：一种用于提高针对HIV-1 RTIs的耐药毒株(尤其是劣势耐药毒株)的 检测效率的样品前处理方法。
方法A2：一种用于提高HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的检测效率的样品前处 理方法。
所述方法A1和所述方法A2，均可包括如下步骤：
(b1)从待测样本中提取RNA作为模板，将前文所述引物1、所述引物2、所述 引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6配伍形成引物组合，进行cDNA的合 成和巢式PCR的第一轮扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
(b2)以所述第一轮PCR扩增产物为模板，分如下两个体系进行巢式PCR的第 二轮扩增：体系一以前文所述引物7和所述引物8进行巢式PCR的第二轮扩增，得到 第二轮PCR扩增产物1；体系二以前文中所述引物9和所述引物10进行巢式PCR的 第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物2；所述第二轮PCR扩增产物1和所述第二轮 PCR扩增产物2即为处理后样本。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。可间接用于艾滋病抗病毒治疗效果评估/预测、可用于HIV准种分析或者是仅仅为了服务于HIV药物开发等不以获得诊断结果或健康 状况为直接目的的应用。
第五方面，本发明要求保护如下方法B1或方法B2：
方法B1：一种检测针对HIV-1 RTIs的耐药毒株(尤其是劣势耐药毒株)的方法。
方法B2：一种检测HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的方法。
所述方法B1和所述方法B2，均可包括如下步骤：
(b1)从待测样本中提取RNA作为模板，将前文所述引物1、所述引物2、所述 引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6配伍形成引物组合，进行cDNA的合 成和巢式PCR的第一轮扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
(b2)以所述第一轮PCR扩增产物为模板，分如下两个体系进行巢式PCR的第 二轮扩增：体系一以前文所述引物7和所述引物8进行巢式PCR的第二轮扩增，得到 第二轮PCR扩增产物1；体系二以前文中所述引物9和所述引物10进行巢式PCR的 第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物2；
(b3)将所述第二轮PCR扩增产物1和所述第二轮PCR扩增产物2进行高通量 测序，从测序结果中获得针对HIV-1 RTIs的耐药毒株(尤其是劣势耐药毒株)信息或 HIV-1逆转录酶区耐药基因变异信息。
所述方法为非疾病诊断治疗方法。可间接用于艾滋病抗病毒治疗效果评估/预测、可用于HIV准种分析或者是仅仅为了服务于HIV药物开发等不以获得诊断结果或健康 状况为直接目的的应用。
在第四方面和第五方面的(b1)中，进行所述cDNA的合成和巢式PCR的第一 轮扩增时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引 物6的摩尔比为1:1:1:1:2:2。
进一步地，进行所述cDNA的合成和巢式PCR的第一轮扩增时，所述引物1、所 述引物2、所述引物3、所述引物4在反应体系中的终浓度均为0.1μM，所述引物5和 所述引物6在反应体系中的终浓度均为0.2μM。
在本发明的具体实施方式中，所述反应体系如下：PrimeScript 1 Step EnzymeMix 1μL；2×1 Step Buffer 12.5μL；所述引物组合1μL；所述RNA 10μL；H2O 0.5μL。
在第四方面和第五方面的(b1)中，进行所述cDNA的合成和巢式PCR的第一 轮扩增时，退火温度可为52℃。
在本发明的具体实施方式中，反应程序为：50℃32min；94℃2min；94℃15s， 52℃20s，72℃1min40s，30个循环；72℃10min。
在第四方面和第五方面的(b2)中，进行所述巢式PCR的第二轮扩增时，所述引 物7和所述引物8在所述体系一中的终浓度均可为0.4μM。进行所述巢式PCR的第二 轮扩增时，所述引物9和所述引物10在所述体系二中的终浓度均可为0.4μM。
在本发明的具体实施方式中，所述体系一和所述体系二如下：Ex Taq PremixMixture 25μL；所述引物7和所述引物8各1μL(或所述引物9和所述引物10各1μL)； 所述第一轮PCR扩增产物3μL；H2O 20μL。
在第四方面和第五方面的(b2)中，进行所述巢式PCR的第二轮扩增时，退火温 度可为55℃。
在本发明的具体实施方式中，反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃10min。
在第五方面的(b3)中，进行所述高通量测序所用平台可为Illumina HiSeqPE250。
在第五方面的(b3)中，可通过SnpEff生物学分析软件对测序结果进行序列分析，统计分析出已知的HIV-1逆转录酶区关键位点发生耐药突变的频次，从而获得针对 HIV-1RTIs的劣势耐药毒株信息(如劣势耐药毒株在患者体内构成比)或HIV-1逆转 录酶区耐药基因变异信息。
在第五方面的(b2)和(b3)之间还包括：从所述第二轮PCR扩增产物1中分离 纯化长度为484bp的基因片段的步骤，和/或从所述第二轮PCR扩增产物2中分离纯 化长度为475bp的基因片段的步骤。具体的，长度为484bp(或475bp)的基因片段可 使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行片段分离，然后进行目的片段切割纯化。
在第四方面和第五方面中，所述待测样本具体可为HIV患者血浆或血清(离体)。更优地，所述HIV患者血浆或血清中HIV病毒载量≥1000Compies/ml。
第六方面，本发明要求保护前文所述的引物组或试剂盒或方法在如下任一中的应用：
(c1)HIV准种分析；
(c2)HIV耐药分析；
(c3)用于艾滋病抗病毒治疗效果评估和/或预测。
所述应用为非疾病诊断治疗性应用，不以获得诊断结果或健康状况为直接目的。
本发明通过对前期使用的HIV-1耐药检测方法改进，对以往检测引物进行优化组合，重新形成新的HIV-1 RT耐药检测引物体系。主要策略是优化已有检测方法，使得 RT的cDNA合成和巢式PCR的第一轮扩增在同一反应体系中完成，这样可避免传统 方法中反复吸取核酸时可能造成的核酸污染；巢式PCR第二轮扩增以第一轮扩增产物 为模板DNA，分2个区段(2个区段之间具有163bp的Overlapping序列)对RT目的 基因序列进行扩增，此轮检测中对2个区段的常规使用检测引物的首尾加上用于后续 分析的Barcode序列，进行第二轮扩增反应。扩增出来的目的基因产物进行纯化定量， 进行多样本混合(标准混合样本为96个样本)，然后将混合好的样本进行序列测定， 使用平台为Illumina HiSeq PE250，该平台可实现双末端测序、首尾至少可测得250bp， 通过首尾序列连接可形成完整的RT基因序列，最终获得的序列数可达2300～30000 条/样品。根据斯坦福大学公布的Major HIV-1 DrugResistance Mutations(来源： http://hivdb.stanford.edu/)中与HIV-1耐药相关的RT基因区突变位点，使用SnpEff生 物学分析软件，统计分析出RT基因区与耐药相关的关键位点发生频次，从而可获得 耐药毒株及劣势耐药毒株在患者体内构成比。
本发明以中国当前HIV-1毒株耐药检测方法基础，结合深度测序技术，建立起新型针对HIV-1 RT区与RTIs相关的基因变异株检测方法，优点在于：①HIV耐药检测 成本大大降低。当前检测中，根据Barcode不重复原则，每个反应管中可以混合96个 样品；加之检测引物的不同，又可以将更多样本进行混合，这样就使得一次反应可以 产出多个不同样品结果，从而将测序成本大大降低；②单个样品可产出3000条以上 序列，这就为分析HIV-1耐药相关的基因变异提供了充足的数据资源，可为后续抗病 毒治疗提供有力指导。此外，作为副产出，充裕的数据资源也可进行HIV-1准种复杂 性分析。本发明建立的新型HIV-1逆转录酶区基因突变检测方法，使得HIV-1耐药检 测成为一种低成本、高产出的方法，对于艾滋病防治和公共卫生具有重大影响。
附图说明
图1为深度测序使用引物检测HIV-1 RT区基因琼脂糖凝胶电泳图。其中“+”表 示检测结果为阳性，“—”为阴性对照，其模板为实验使用的双蒸水(ddH2O)；1、2、 3……23代表样品编号。
具体实施方式
本发明技术方案主要包括如下：
(1)拟用于深度测序的引物的合成
筛选前期用于HIV RT耐药检测的引物，引物RT1-PLA、RT2-PLA、RT3-PLA、 RT4-PLA可满足对RT区所有已知的与HIV-1耐药相关的氨基酸密码子的检测，长度 为1-230位氨基酸密码子，检测引物序列构成如表1所示。将RT1-PLA、RT2-PLA、 RT3-PLA、RT4-PLA与商业化的、用于深度测序的Barcode序列相耦连，形成完整的 可用于RT关键耐药位点检测的深度测序引物组合(序列如表2、表3、表4、表5所 示)，将序列提交至华大科技进行序列合成。合成好的基因序列-20℃保持备用。
表1 常规HIV-1 RT耐药检测使用引物碱基构成
引物名称 序列组成(5→3') 位置(HXB2) 方向
RT1-PLA GTTGACTCAGATTGGTTG CAC(SEQ ID No.7) 2519→2539 F
RT2-PLA CTGGTGTYTCATTRTTKRTACTAGGT(SEQ ID No.8) 2945→2970 R
RT3-PLA TTYTGGGARGTYCARYTAGGRATACC(SEQ ID No.9) 2808→2833 F
RT4-PLA AGTTCATAACCCATCCAAAG(SEQ ID No.10) 3231→3250 R
注：引物序列中Y表示T或C；R表示G或A；K表示G或T。
表2 RT1-PLA与不同Barcode耦连形成的引物组合体系(引物7)
Figure BDA0002497936810000071
Figure BDA0002497936810000081
Figure BDA0002497936810000091
表3 RT2-PLA与不同Barcode耦连形成的引物组合体系(引物8)
Figure BDA0002497936810000092
Figure BDA0002497936810000101
Figure BDA0002497936810000111
注：引物序列中Y表示T或C；R表示G或A；K表示G或T。
表4 RT3-PLA与不同Barcode耦连形成的引物组合体系(引物9)
Figure BDA0002497936810000112
Figure BDA0002497936810000121
Figure BDA0002497936810000131
注：引物序列中Y表示T或C；R表示G或A；K表示G或T。
表5 RT4-PLA与不同Barcode耦连形成的引物组合体系(引物10)
Figure BDA0002497936810000141
Figure BDA0002497936810000151
Figure BDA0002497936810000161
(2)以待测病毒的总RNA为模板，用表6的所示引物按比例进行配伍，形成引 物组合-Ⅳ，然后进行cDNA的合成与巢式PCR的第一轮扩增，得到第一轮PCR扩增 产物。
表6 HIV-1耐药检测第一轮RT-PCR使用引物碱基构成
引物名称 序列组成(5→3') 位置(HXB2) 方向 配伍比例
DR1-1-CNB TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC(SEQ ID No.1) 2028-2050 F 1/8
DR2-1-CNBC TGGAAATGTGGAAAAGAAGGAC(SEQ ID No.2) 2029-2050 F 1/8
PRTM-F1a TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT(SEQ ID No.3) 2057-2085 F 1/8
PRTM-F1b ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG(SEQ ID No.4) 2068-2092 F 1/8
DR1-2-CNB CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG(SEQ ID No.5) 3509-3539 R 1/4
DR2-2-CNBC CTGTATTTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGGG(SEQ ID No.6) 3509-3539 R 1/4
注：引物序列中R表示G或A；I表示次黄嘌呤核苷酸(在序列表中用n表示)，它可以与A、G、C、T中的任何1 个配对；Y表示T或C。
(3)将合成好的表2、表3中的引物稀释至使用浓度20μM，对表2、表3相对 应位置的上下游引物进行等体积混合，命名为PR-deep Primer1，按上述方法将表4、 表5引物也同样混合，命名为RT-deep Primer2，然后进行目的基因的扩增。其中引物 RT1-PLA、RT2-PLA检测片段预计长度为452bp，表2中Barcode序列长度为16bp， 表3中Barcode序列长度为16bp，即RT-deep Primer1检测目的基因有效长度为484bp； 同理RT-deep Primer2检测目的基因有效长度为475bp。以第一轮PCR扩增产物为模板， 分别以RT-deep Primer1、RT-deepPrimer2为检测引物进行巢式PCR第二轮扩增，如果 巢式PCR第二轮PCR扩增产物中分别出现484bp和475bp的特异DNA片段，则说明 特异性目的基因片段得到有效扩增。
(4)目的基因片段的纯化回收：对长度为484bp和475bp的基因片段使用1.5％ 的琼脂糖凝胶电泳进行片段分离，然后进行目的片段切割纯化。纯化完毕进行核酸定 量，然后对检测引物为RT-deep Primer1的核酸量以3μg/样品为标准进行混合待用， 标注为管1；同样对RT-deep Primer2的核酸进行混合，标注为管2。
(5)将混合好的管1、管2样品交于诺赛基因采用Illumina HiSeq PE250测序平 台进行序列测定。RT-deep Primer1和RT-deep Primer2所获得序列间具有163bp的交叉 重复序列，因此RT区关键位点在检测中将不会遗漏。根据斯坦福大学公布的Major HIV-1 DrugResistance Mutations，将获得的结果使用SnpEff生物学分析软件进行序列 分析，统计分析出RT关键位点与耐药发生相关的突变发生的频次，从而分析出优势 和劣势耐药毒株在患者体内构成比。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、适用于HIV-1 RT耐药检测的深度测序方法的建立
1、引物组合
(1)第一轮RT-PCR使用引物的准备
取合成好的引物DR1-1-CNB、DR2-1-CNBC、PRTM-F1a、PRTM-F1b、DR1-2-CNB 和DR2-2-CNBC(表6)，使用ddH2O依次稀释成浓度为20μM的溶液。对稀释好的引 物进行混合，其中DR1-1-CNB、DR2-1-CNBC、PRTM-F1a、PRTM-F1b分别按照总体 积的1/8进行混合，DR1-2-CNB、DR2-2-CNBC分别按照总体积的1/4进行混合，混 合好后充分混匀备用，命名为引物组合-Ⅳ。
(2)第二轮检测拟用于深度测序使用引物的准备
将表2、表3中的引物均使用ddH2O稀释成浓度为20μM的溶液，按照引物名称 中A01、B01、C01……的编号将表2、表3中的引物等体积进行混合，然后将混合好 的引物溶液加至96孔板中对应孔中，如A01混合液加至96孔板A01孔、B01混合液 加至96孔板B01孔、C01混合液加至96孔板C01孔……，将混合分装好的96孔板 中，命名为RT-deep Primer1；同样将表4、表5中的引物进行混合，命名为RT-deep Primer2。混合好的引物-20℃保存备用。
(3)目的基因检测反应体系及条件
①cDNA合成及巢式PCR第一轮扩增体系和反应条件如表7所示。使用试剂盒 为TaKaRa公司产品PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Code No.RR055A)。
表7 RT-PCR反应体系及程序
Figure BDA0002497936810000171
Figure BDA0002497936810000181
②巢式PCR第二轮扩增体系及条件如表8所示,使用试剂为TaKaRa公司产品Premix TaqTM(Code No.RR902A)。
表8巢式第二轮PCR反应体系及程序
Figure BDA0002497936810000182
(4)目的基因片段的检测、纯化、定量和序列的测定
使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对第二轮PCR产物进行鉴定，其中RT-deep Primer1检测目的基因片段大小约为484bp，RT-deep Primer2检测目的基因片段大小约为 475bp。对RT-deep Primer1检测阳性的样品进行切胶纯化，并对纯化回收的核酸进行 定量，以3μg/样品的核酸量进行混合，命名为管1；RT-deep Primer2检测阳性的样品 定量后进行混匀，命名为管2。将混匀的管1、管2核酸样品交由诺赛基因进行序列测 定，使用测序平台为Illumina HiSeq PE250。其中RT-deep Primer1和RT-deep Primer2 检测片段具有163bp的交叉重复序列，两套检测引物共计可检测到RT区1-250位氨基 酸密码子位点的突变，涵盖了RT区所有已知的关键性突变位点。产生的批量序列数 据使用SnpEff生物学分析软件进行序列分析，根据斯坦福大学公布的Major HIV-1 Drug Resistance Mutations(来源：http://hivdb.stanford.edu/)中与HIV-1耐药相关的RT基 因区突变位点，分析出RT关键位点发生耐药突变的频次，从而分析出患者体内耐药 发生情况及劣势耐药毒株在患者体内存在情况。
实施例2、HIV-1 RT区突变位点检测方法敏感性评估
一、实验样本
使用临床新确诊的、即将接受抗病毒治疗的72例HIV感染者(均签署知情同意 书)的血浆样本作为实验样本，其中感染者病毒载量≥1000Compies/ml。
二、利用建立的深度测序方法对HIV-1感染者RT区基因进行耐药检测
分别将步骤一的各个患者的血浆进行如下实验：
1、对待检血浆样本进行核酸纯化
所有步骤按照Roche公司核酸纯化试剂盒MagNA Pure LC Total Nucleic AcidIsolation Kit(Code No.3038505001)说明书执行，此处不做赘述。
2、深度测序样本的准备
(1)以步骤1的总RNA为模板，进行cDNA合成及巢式PCR第一轮的扩增， 扩增体系和反应条件如表7所示。
(2)巢式PCR第二轮扩增：以步骤(1)所得第一轮扩增产物为模板，进行巢式 PCR第二轮扩增，扩增体系和反应条件如表8所示。
实验同时设置阳性对照，模板RNA来自本实验室分离获得的CNHN24野生型毒 株和本实验室诱导获得的3TC耐药毒株(专利名称：HIV-1耐药性毒株及其应用，专 利号：ZL200410048077.2)混合物。根据病毒载量测定结果，将CNHN24与3TC耐 药毒株(含突变M184V)按照体积9:1的比例(野生型RT区和M184V突变型RT区 核酸摩尔比约为9:1)进行混匀待用。其中毒株CNHN24与3TC耐药毒株，公众按照 国家生物安全的有关规定可以从军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所获 得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；参考文献： 李珏等.HIV-1拉米夫定(3TC)耐药毒株的体外诱导培育和鉴定.中华微生物学和免 疫学杂志,2006年3月第26卷第3期。
3、目的基因的鉴定及纯化
在本反应体系中，RT-deep Primer1检测目的基因片段大小约为484bp，RT-deepPrimer2检测目的基因片段大小约为475bp，因此在两轮扩增之后，取5μL PCR产物， 使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，如果在DL2000 Marker 500bp位置之前出现略小 于500bp的特异性目的基因条带，则说明扩增出目的基因片段，反之则为阴性。72例 样本中，RT-deep Primer1核酸检测阳性的样品有69例，检测阳性率为95.8％；RT-deep Primer2核酸检测阳性的样品有71例，检测阳性率为98.6％(部分样本的鉴定结果如 图1所示)，说明该检测体系对病毒载量≥1000Copies/mL的样品具有很好的敏感性。 对鉴定为阳性的样品和阳性对照分别进行切胶纯化回收，回收后的产物使用微量核酸 定量仪进行核酸定量，定量后的核算样品以3μg/样品分别进行混合，其中RT-deep Primer1的混合物标记为管1，RT-deepPrimer2的混合物标记为管2，混匀后备用。
4、序列测定及序列分析
将步骤3混匀的核酸样品混合物，混合样品交由诺赛基因进行序列测定，使用测序平台为Illumina HiSeq PE250。
在序列产出中，每个样品产出序列数都在3000条以上(详见表9)，而且以单样 本获得序列数＞10000条以上的为主，10％以上的序列数在20000条以上。产出序列 数完全满足HIV-1 RT区多态性分析，其中与HIV-1耐药相关的劣势变异位点发生频率 详见表10，从表中可以明显看出，常规In-house方法对斯坦福大学公布的已知HIV-1 耐药突变检测中，2例样本检测出与耐药密切相关的突变位点(K103N)，通过深度测 序及后续分析得出，该突变发生频次在88.00％以上，即In-house方法对占绝对优势(≥ 80％)的变异是可以检出的，但对劣势变异(≤20％)，即使接近30％，该方法也是不 能检测出该变异的；但本发明中建立的针对劣势变异的深度测序及分析方法，对发生 频次在2.00％左右的劣势变异也可以有效检出，因此可以看出，本发明中建立的针对 劣势耐药变异检测的方法优于传统检测方法。
表9 HIV-1 RT区多态性位点检测方法序列产出一览表
Figure BDA0002497936810000201
表10深度测序检出耐药突变发生频率一览表
Figure BDA0002497936810000202
*注：In-house耐药检测方法为国内当前使用最为广泛的实验室使用方法，具体操作方法可见参考文献 Hanping Li,Shujia Liang,Wei Guo,Daomin Zhuang,Lin Li,Yongjian Liu,Zuoyi Bao,Siyang Liu,Xiaolin Wang,Tianyi Li,Wei Liu,JingyunLi.Comparison between an in-house method and the ViroSeqTM method fordetermining mutations for drug resistance in the HIV-1 CRF01 AE subtypecirculating in China.Journal of Virological Methods 205(2014)17–23.此处作为本发明深度测序 检测方法的对照。“编号”为HIV感染者的编号，不同编号对应不同个体。阳性对照样本深度测序检测结 果显示M184V突变发生频率为9.3，实际检测值略低于理论值，可能是实验误差所致，但基本与实际情况 相符，因此证明表中结果可靠。
实施例3、检测体系特异性检测
为了验证所建立检测体系对相似病毒是否存在检测交叉阳性的情况，取实验室所存HBV样本(代表人乙型肝炎病毒，26份)、HCV(代表人丙型肝炎病毒，40份)， 使用上述检测流程对样本进行检测。HCV样本检测完全遵循上述检测反应体系和程 序；HBV在第一轮检测中略去50℃反转录32min，检测体系及程序均同前。检测结果 显示，阳性对照CNHN24检测结果特异性良好，HBV、HCV检测样本和阴性对照(以 ddH2O为模板)均无特异性目的条带出现，即检测结果为阴性。特异性检测结果证实， 所建立检测体系对相似病毒HBV、HCV无交叉反应。
上述结果表明，本发明提供的基于深度测序的适用于HIV-1 RT区突变位点检测的方法体系可以很好的检测HIV RT基因的突变，从而可以很好分析出与HIV-1耐药相 关的突变的构成比，从而可以更好地分析患者体内劣势毒株构成比，该方法简便易行、 检测成本低。
本发明重点在于对以往常规HIV-1耐药检测方法的优化调整，形成一个成本低廉、高效产出的新型耐药检测方法，该方法在后期测序中，不需要使用传统Sanger测序方 法单独对每一个样品进行序列测定，而是将使用不同Barcode标识的样品混合，使用 二代测序方法同时对多个样品进行序列测定，大大降低了序列测定成本；此外，该方 法的最大优点是单个样品可产出批量数据结果，该结果一方面可以进行HIV多态性检 测，分析出HIV-1中与耐药相关的多态性位点，从而可掌握优势耐药毒株发生情况， 又可明了劣势耐药毒株在患者体内所占比例，另一方面又可针对HIV这一特殊病毒进 行准种分析，从而实现事半功倍的效果。
(a)该体系利用样品标记Barcode的不同，实现一个反应管内多个样本(≥96) 的测序反应，克服了以往Sanger测序单次反应只可完成一个样品检测的局限性，使得 测序效率大大提高，测序成本大大降低。
(b)该体系就单一样品而言，一次测序即可产出批量序列，每个样品可产出3000条以上序列，对HIV这一特殊病原体而言，产出的大批序列结果可用于多个用途，如 HIV准种分析、耐药分析等，实现了最小投入最大产出的效果。
总之，本发明公开了一种是适用于HIV逆转录酶区突变位点检测、分析的方法， 该方法相比较传统检测方法，使得检测成本大大降低，而产出数据又是以往数据产出 的数千倍以上，不失为一种全新的HIV检测分析的方法。数据的产出即可进行HIV 耐药的分析，又可进行HIV准种的分析，尤其是在HIV RT基因区劣势耐药毒株检测 方面具有得天独厚的优势。此外，该方法中所涉及测序方法与分析方法都是基于国内 成熟的技术平台，具有很好的推广实用性，因此本发明对我国艾滋病的防控具有重要 的指导意义，为实现WHO提出的三个“90％”目标添力。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种新型HIV-1逆转录酶耐药突变位点检测方法的建立及应用
<130> GNCLN201222
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ttggaaatgt ggaaaggaag gac 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tggaaatgtg gaaaagaagg ac 22
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgaargantg yactgaragr caggctaat 29
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
actgaragrc aggctaattt tttag 25
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ctgtatttca gctatcaagt cttttgatgg g 31
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gttgactcag attggttgca c 21
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ctggtgtytc attrttkrta ctaggt 26
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ttytgggarg tycarytagg ratacc 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
agttcataac ccatccaaag 20

Claims (10)

1.用于HIV RT耐药检测的引物组，由如下组成：
引物1：如SEQ ID No.1所示单链DNA；
引物2：如SEQ ID No.2所示单链DNA；
引物3：如SEQ ID No.3所示单链DNA；
引物4：如SEQ ID No.4所示单链DNA；
引物5：如SEQ ID No.5所示单链DNA；
引物6：如SEQ ID No.6所示单链DNA；
引物7：在SEQ ID No.7的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物8：在SEQ ID No.8的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物9：在SEQ ID No.9的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA；
引物10：在SEQ ID No.10的5’末端连接Barcode序列后所示单链DNA。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：在所述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为1:1:1:1:2:2。
3.用于HIV RT耐药检测的试剂盒，含有权利要求1或2所述引物组和如下中至少一种：逆转录酶、DNA聚合酶和dNTP。
4.权利要求1或2所述引物组或权利要求3所述试剂盒在如下任一中的应用：
(a1)制备用于检测针对HIV-1RTIs的耐药毒株的产品，或检测针对HIV-1RTIs的耐药毒株；
(a2)制备用于检测HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的产品，或检测HIV-1逆转录酶区耐药基因变异。
5.如下方法A1或方法A2：
方法A1：一种用于提高针对HIV-1RTIs的耐药毒株的检测效率的样品前处理方法；
方法A2：一种用于提高HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的检测效率的样品前处理方法；
所述方法A1和所述方法A2，均包括如下步骤：
(b1)从待测样本中提取RNA作为模板，将权利要求1中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6配伍形成引物组合，进行cDNA的合成和巢式PCR的第一轮扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
(b2)以所述第一轮PCR扩增产物为模板，分如下两个体系进行巢式PCR的第二轮扩增：体系一以权利要求1中所述引物7和所述引物8进行巢式PCR的第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物1；体系二以权利要求1中所述引物9和所述引物10 进行巢式PCR的第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物2；所述第二轮PCR扩增产物1和所述第二轮PCR扩增产物2即为处理后样本。
6.如下方法B1或方法B2：
方法B1：一种检测针对HIV-1RTIs的耐药毒株的方法；
方法B2：一种检测HIV-1逆转录酶区耐药基因变异的方法；
所述方法B1和所述方法B2，均包括如下步骤：
(b1)从待测样本中提取RNA作为模板，将权利要求1中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6配伍形成引物组合，进行cDNA的合成和巢式PCR的第一轮扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
(b2)以所述第一轮PCR扩增产物为模板，分如下两个体系进行巢式PCR的第二轮扩增：体系一以权利要求1中所述引物7和所述引物8进行巢式PCR的第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物1；体系二以权利要求1中所述引物9和所述引物10进行巢式PCR的第二轮扩增，得到第二轮PCR扩增产物2；
(b3)将所述第二轮PCR扩增产物1和所述第二轮PCR扩增产物2进行高通量测序，从测序结果中获得针对HIV-1RTIs的耐药毒株信息或HIV-1逆转录酶区耐药基因变异信息。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在步骤(b1)中，进行所述cDNA的合成和巢式PCR的第一轮扩增时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比为1:1:1:1:2:2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(b1)中，进行所述cDNA的合成和巢式PCR的第一轮扩增时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4在反应体系中的终浓度均为0.1μM；所述引物5和所述引物6在所述反应体系中的终浓度均为0.2μM。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：在步骤(b2)中，进行所述巢式PCR的第二轮扩增时，所述引物7和所述引物8在所述体系一中的终浓度均为0.4μM；和/或
进行所述巢式PCR的第二轮扩增时，所述引物9和所述引物10在所述体系二中的终浓度均为0.4μM。
10.权利要求1-9中任一所述的引物组或试剂盒或方法在如下任一中的应用：
(c1)HIV准种分析；
(c2)HIV耐药分析；
(c3)用于艾滋病抗病毒治疗效果评估和/或预测。
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