CN111270011A - 一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒 - Google Patents

一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒。本发明所述引物组包含第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物和第六引物。本发明还提供一种包含所述引物组的用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述6条特异性寡核苷酸引物，使用阴性和阳性对照作为参照，并采用环介导等温扩增反应，针对新型冠状病毒特异性RNA能够进行准确检测，并同时优化了核酸提取方法。本发明所述引物和试剂盒具有高特异性，大大缩减了检测使用时间，实现了病毒的现场检测；无需额外的逆转录试验，提高了检测效率；所述试剂盒可适用于多个检测平台，降低了试剂盒的使用要求。

Description

一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测新型冠状病毒的引 物组和检测试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。 冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS) 和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人 体中发现的冠状病毒新毒株。
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困 难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚 至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。因此，建立一种 快速、准确、灵敏、操作简单的检测方法对我国的新型冠状病毒防控工作具有 重要的意义。
环介导等温扩增技术(LAMP)是新型分子诊断技术，其反应过程在恒温条 件下进行，通过添加有特殊链置换活性及具有逆转录活性的DNA聚合酶和针对 目标基因特异性片段设计的引物组使核酸在恒温条件下完成，有快速，灵敏和 特异的优点。实时荧光法与LAMP技术相结合的检测方式则使得检测更加准确和 直观，核酸复制扩增反应结束后可对产物做退火溶解曲线分析，溶解曲线可进 一步坚定该核酸扩增产物是否是特异性扩增。近年来被越来越多的实验者应用 到实际检测中，准确、高效、简单、快速、特异，非常适合新型冠状病毒快速 检测。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒 的引物组和检测试剂盒。本发明设计了6条特异性寡核苷酸引物，并使用环介 导等温扩增方法针对新型冠状病毒特异性RNA进行准确检测，优化了核酸提取 方法，使用阴阳性对照品作为参照，开发了一种快速、准确、灵敏、操作简单 的检测是否感新型冠状病毒的试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：
一种用于检测新型冠状病毒的引物组，所述引物组包括；
第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；
第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；
第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示： AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；
第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示： AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；
第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；
第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。
一种所述引物组在检测新型冠状病毒中的应用。
一种所述引物组在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
一种用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含如权利要 求1中所述第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六引物， 以及反应浓缩液、阴性对照和阳性对照。
进一步地，所述第一引物和第二引物的浓度为40uM，第三引物和第四引物 的浓度为5uM、第五引物和第六引物的浓度为20uM；所述阴性对照为不含新型 冠状病毒ORF1ab基因片段的空质粒，所述阴性对照浓度为10ng/ml；所述阳性 对照为含新型冠状病毒ORF1ab基因片段的重组质粒，所述阳性对照浓度为 10ng/ml；所述反应浓缩液包含DNA聚合酶、硫酸镁、甜菜碱、荧光染料、dNTPs。
进一步地，所述反应浓缩液中的DNA聚合酶的浓度为8U/ul，所述硫酸镁 的浓度为50mM，所述甜菜碱的浓度为5M，所述荧光染料的浓度为0.1mM，所述 dNTPs的浓度为10mM。
一种所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本中的病毒RNA，得到待检测核酸样本；
(2)将所述第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六 引物等体积混匀，得到引物混合体系；
(3)环介导等温扩增反应：将反应浓缩液、所述引物混合体系和待检测核 酸样本混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，之后进行PCR扩增反应，得 到反应的扩增曲线和溶解曲线；
(4)根据所述扩增曲线和溶解曲线判定所述样本检测结果，既完成了所述 样本的检测。
进一步地，步骤(1)中，提取样本中的病毒RNA使用的为磁珠法核酸提取 试剂盒。
进一步地，步骤(3)中，所述环介导等温扩增反应体系为：反应浓缩液 15ul，引物混合体系6ul,待检验核酸样本4ul；
所述PCR扩增反应使用定量PCR仪或恒温荧光PCR仪：使用定量PCR仪时， 直接设置80个循环，每个循环30s且在FAM通道采集荧光，68℃恒温，设置 98-80℃产物退火程序,循环完成后加溶解曲线分析；使用恒温荧光PCR仪，设 置为68℃，40分钟，完成后加溶解曲线分析。
进一步地，步骤(4)中，所述样本检测结果包含以下情况：扩增曲线具有 明显“S”型曲线，且溶解曲线峰型单一且尖锐，则判定样本检测结果为阳性结 果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定样本检测结果为阴性结果；扩 增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一，判定为非特异性扩增，非 特异性扩增视为阴性结果。
本发明的有益效果为：
本发明所述用于检测新型冠状病毒的引物组包含第一引物、第二引物、第 三引物、第四引物、第五引物和第六引物，基因序列依次分别如SEQ ID NO：1、 SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6 所示。本发明还提供一种包含本发明所述引物组且用于检测新型冠状病毒的检 测试剂盒，所述试剂盒包括上述6条特异性寡核苷酸引物，并且使用阴性和阳 性对照品作为参照，针对新型冠状病毒特异性RNA能够进行准确检测，并同时 优化了核酸提取方法。本发明所述用于检测新冠病毒的引物组和试剂盒具有以 下优势：(1)本发明所述六条特异性寡核苷酸引物对应目标序列的8个特异区 域进行准确识别，保证了检测的高度特异性；(2)本发明所述试剂盒可以直接 使用RNA样本作为反应模板，不需要额外的逆转录试验；(3)本发明所述试剂 盒使用了环介导等温扩增方法，大大缩减了检测使用时间，实现了新型冠状病 毒的现场检测；(4)简化了病毒检测过程，降低了对操作人员的专业要求，使 得非专业人员可以顺利完成检测工作；(5)本发明试剂盒可用于多个检测平台 上，不仅可以用在等温扩增荧光检测仪和定量PCR仪，也可以用在其他可以提 供恒定温度的设备上，如金属浴等，降低了试剂盒的使用要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例3所得等温扩增荧光检测仪S型阳性扩增曲线；
图2是本发明实施例3所得等温扩增荧光检测仪特异性产物溶解曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本发明提供一种用于检测新型冠状病毒的引物组，包括；
第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；
第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；
第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示： AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；
第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示： AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；
第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；
第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。
实施例2
本发明提供一种用于检测新冠病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第 一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六引物，以及反应浓 缩液、阴性对照和阳性对照；
第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；
第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；
第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示： AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；
第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示： AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；
第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；
第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。
所述第一引物和第二引物的浓度为40uM，第三引物和第四引物的浓度为5uM、第五引物和第六引物的浓度为20uM；所述阴性对照为不含新型冠状病毒 ORF1ab基因片段的空质粒，所述阴性对照浓度为10ng/ml；所述阳性对照为含 新型冠状病毒ORF1ab基因片段的重组质粒，所述阳性对照浓度为10ng/ml；所 述反应浓缩液包含浓度为8U/ul的聚合酶、浓度为50mM的硫酸镁、浓度为5M 的甜菜碱、浓度为0.1mM的荧光染料、浓度为10mM的dNTPs。
实施例3
本实施例提供一种用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒 包含第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六引物，以及 反应浓缩液、阴性对照和阳性对照；
第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；
第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；
第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示： AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；
第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示： AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；
第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；
第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。
所述第一引物和第二引物的浓度为40uM，第三引物和第四引物的浓度为 5uM、第五引物和第六引物的浓度为20uM；所述阴性对照为不含新型冠状病毒 ORF1ab基因片段的空质粒，所述阴性对照浓度为10ng/ml；所述阳性对照为含 新型冠状病毒ORF1ab基因片段的重组质粒，所述阳性对照浓度为10ng/ml；所 述反应浓缩液包含浓度为8U/ul的聚合酶、浓度为50mM的硫酸镁、浓度为5M 的甜菜碱、浓度为0.1mM的荧光染料、浓度为10mM的dNTPs；
本实施例还提供一种用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒的使用方法：
(1)病毒RNA提取：从感染新型冠状病毒的血清样本中提取感染血清样本， 使用磁珠法核酸提取试剂盒(Genesig Easy DNA/RNA Extraction Kit)提取样 本核酸；
(2)将所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物和第六 引物等体积混匀，得到引物混合体系；
(3)环介导等温扩增反应：将反应浓缩液15ul、所述引物混合体系6ul 和样本核酸4ul混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，之后使用等温扩增 荧光检测仪进行PCR扩增反应，设置为68℃，40分钟，完成后加溶解曲线分析， 得到反应的扩增曲线和溶解曲线；
(4)根据所述扩增曲线和溶解曲线判定所述样本检测结果：扩增曲线具 有明显“S”型曲线(如图1所示)，且溶解曲线峰型单一且尖锐(如图2所示)， 则判定样本检测结果为阳性结果。反应模板的扩增曲线起峰时间越早，则起始 浓度越高，起峰时间越晚则起始浓度越低；溶解曲线则起到判定扩增产物特异 性的作用，无论浓度高低只要样本为阳性对照均应具有相近的溶解曲线，其差 异与标准样品应在正负1.0℃以内，否则判定为非特异性扩增。
实施例4
本实施例与实施例3的不同之处仅在于第(3)步骤中使用的为定量PCR 仪进行PCR扩增反应，直接设置80个循环，每个循环30S且在FAM通道采集荧 光，68℃恒温，设置98-80℃产物退火程序，循环完成后加溶解曲线分析；根 据所述扩增曲线和溶解曲线判定所述样本检测结果：扩增曲线没有出现明显“S” 型曲线，则判定样本检测结果为阴性结果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。
Figure BDA0002399643410000081
Figure BDA0002399643410000091
Figure BDA0002399643410000101
SEQUENCE LISTING
<110> 云南瑞栢泰生物科技有限公司
<120> 一种用于检测新型冠状病毒的引物组和检测试剂盒
<130> 2010
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacacagtct gtaccgtct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttcttggaag cgacaacaa 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agctgactga agcatgggtt cgcggtatgt ggaaaggtta t 41
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacgggtttg cggtgtaagt agccctgtat acgacatca 39
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcggagttga tcacaactac a 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cggcacaggc actagtac 18

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括；
第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：AACACAGTCTGTACCGTCT；
第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：TTCTTGGAAGCGACAACAA；
第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：AGCTGACTGAAGCATGGGTTCGCGGTATGTGGAAAGGTTAT；
第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示：AACGGGTTTGCGGTGTAAGTAGCCCTGTATACGACATCA；
第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示：GCGGAGTTGATCACAACTACA；
第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示：CGGCACAGGCACTAGTAC。
2.一种如权利要求1所述的引物组在检测新型冠状病毒中的应用。
3.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。
4.一种用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含如权利要求1中所述第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六引物，以及反应浓缩液、阴性对照和阳性对照。
5.根据权利要求4所述用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述第一引物和第二引物的浓度为40uM，第三引物和第四引物的浓度为5uM、第五引物和第六引物的浓度为20uM；所述阴性对照为不含新型冠状病毒ORF1ab基因片段的空质粒，所述阴性对照浓度为10ng/ml；所述阳性对照为含新型冠状病毒ORF1ab基因片段的重组质粒，所述阳性对照浓度为10ng/ml；所述反应浓缩液包含DNA聚合酶、硫酸镁、甜菜碱、荧光染料、dNTPs。
6.根据权利要求5所述用于检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述反应浓缩液中的DNA聚合酶的浓度为8U/ul，所述硫酸镁的浓度为50mM，所述甜菜碱的浓度为5M，所述荧光染料的浓度为0.1mM，所述dNTPs的浓度为10mM。
7.一种权利要求4-6任一项所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样本中的病毒RNA，得到待检测核酸样本；
(2)将所述第一引物和第二引物、第三引物和第四引物、第五引物和第六引物等体积混匀，得到引物混合体系；
(3)环介导等温扩增反应：将反应浓缩液、所述引物混合体系和所述待检测核酸样本混合均匀，同时设置阳性对照和阴性对照，之后进行PCR扩增反应，得到反应的扩增曲线和溶解曲线；
(4)根据所述扩增曲线和溶解曲线判定所述样本检测结果，既完成了所述样本的检测。
8.根据权利要求7所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(1)中，提取样本中的病毒RNA使用的为磁珠法核酸提取试剂盒。
9.根据权利要求7所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(3)中，所述环介导等温扩增反应体系为：反应浓缩液15ul，引物混合体系6ul,待检验核酸样本4ul；
所述PCR扩增反应使用定量PCR仪或恒温荧光PCR仪：使用定量PCR仪时，直接设置80个循环，每个循环30s且在FAM通道采集荧光，68℃恒温，设置98-80℃产物退火程序,循环完成后加溶解曲线分析；使用恒温荧光PCR仪，设置为68℃，40分钟，完成后加溶解曲线分析。
10.根据权利要求7所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤(4)中，所述样本检测结果包含以下情况：扩增曲线具有明显“S”型曲线，且溶解曲线峰型单一且尖锐，则判定样本检测结果为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定样本检测结果为阴性结果；扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一，判定为非特异性扩增，非特异性扩增视为阴性结果。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926117A (zh) * 2020-08-18 2020-11-13 上海交通大学 SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法
CN114080455A (zh) * 2020-06-15 2022-02-22 国立大学法人长崎大学 SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574265A (zh) * 2017-11-01 2018-01-12 张薇 一种用于检测寨卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574265A (zh) * 2017-11-01 2018-01-12 张薇 一种用于检测寨卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YAN DU ET AL.: "A sweet spot for molecuar diagnostics:coupling isothermal amplification and strand exchange circuits to glucometers" *
叶迅等: "严重急性呼吸道综合征冠状病毒疫苗研究现状" *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114080455A (zh) * 2020-06-15 2022-02-22 国立大学法人长崎大学 SARS-CoV-2检测用引物组、用于检查SARS-CoV-2的方法、SARS-CoV-2的检查试剂和检查试剂盒
CN111926117A (zh) * 2020-08-18 2020-11-13 上海交通大学 SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法
CN111926117B (zh) * 2020-08-18 2022-09-13 交弘生物科技(上海)有限公司 SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法

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