CN106755288B - 荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法 - Google Patents

荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体公开了一种荷花品种‘摄山丹叶’的分子鉴定方法。使用该组引物进行PCR扩增并检测获取其SSR指纹数据，根据该指纹数据和本发明所公开的数据进行比较，可以快速准确地鉴定该荷花品种是否为‘摄山丹叶’。

Description

荷花品种摄山丹叶的分子鉴定方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体的说，是基于基因组SSR标记的荷花品种‘摄山丹叶’的分子鉴定方法。
背景技术
荷花（Nelumbo nucifera）也称莲花，是多年生挺水植物，我国十大传统名花中唯一的水生花卉；在我国已有两千多年的栽培历史，具有极高的观赏价值和深厚的文化底蕴。荷花的群体花期长，而且在整个生长期都有观赏价值, 以其美观的形态、独特的清香而深受人们喜爱，为水景园林布置中的主题植物，是重要的夏季观赏花卉之一，也可用于插花和盆景。
我国分布的野生荷花资源为中国莲，花色包括红色、粉色及白色，花型多样，除少瓣花型外，还有重瓣、重台、千瓣等；红色系荷花是广受消费者欢迎的、具极高观赏价值的品种，但是颜色鲜红至深紫红色的荷花品种亦不多见。江苏省中科院植物研究所与大学和企业联合攻关，培育了一个优异的红色系荷花新品种——‘摄山丹叶’。‘摄山丹叶’花色为紫红色，绚丽夺目；植株高大挺拔，着花密度大，群体花期长，抗逆性佳、适应性广，广泛适应于长江中下游地区种植。该品种于2015年已经通过江苏省农委鉴定。
摄山丹叶’是典型的营养繁殖型荷花新品种，其外部形态特征易受到环境条件和管理水平的影响，导致消费者难以辨别品种的真实性，给新品种的开发利用带来影响。因此，寻找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分不同基因型的简单、有效的鉴别技术十分必要。
SSR（简单重复序列）分子标记技术是以PCR为基础的 DNA 多态性检测技术，具有共显性、稳定性好、多态性高和遗传信息量大的特点，与其他的分子标记相比较有明显的优势，是理想的分子标记方法。
发明内容
技术问题：本发明提供一种基于荷花基因组SSR标记的荷花品种‘摄山丹叶’的分子鉴定方法，克服了仅依据形态特征鉴定新品种的不确定性，且检测方法更为快速、准确、高效。
技术方案：
上述荷花品种‘摄山丹叶’的分子鉴定方法，其特征在于：
1. 用CTAB法提取‘摄山丹叶’幼嫩叶片的DNA。
用荧光标记引物SSRD01（正向引物序列5-GACTAATGAAACAGGGGTTAGGGC-3，反向引物序列 5-TCTCCAATCTCCCAACGACTCTTA-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为148bp和164bp。
用荧光标记引物SSRD02（正向引物序列5-TAGACCAGGCTAGGATGGGGTAG-3，反向引物序列5-AGTTAATGACATCTGCAGGGTGGT-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为233bp和249bp。
用荧光标记引物SSRD03（正向引物序列5-TTGGATTGAGTAAATGAGGGGAAA-3，反向引物序列5-AGAAACTTCCTCAGGTTTCAAGCA-3）对上述DNA进行扩增，扩增产物采用毛细管电泳荧光检测法检测分析，得到且只能得到该位点的片段大小为268bp和284bp。
同时用以上3对引物对荷花某一新品种叶片DNA 进行SSR荧光扩增检测，每对引物得到结果与上述要求的SSR指纹数据完全一致，则表明该品种为‘摄山丹叶’。否则为其它品种。
2. 扩增及检测方法：
SSR-PCR采用25ul的反应体系，其中包括50ng DNA, 2.5μL 10×PCR buffer,0.2mmolL-1 dNTPs, 1U Taq DNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1；PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55°C ~ 60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸10min，4℃保存；扩增产物用美国ABI3730 进行自动荧光检测，用GeneMapper软件分析原始数据，获得SSR指纹数据。
有益效果：
1. 本发明通过直接检测‘摄山丹叶’的DNA序列对其进行鉴定，克服了依据外部形态特征对其鉴定的不确定性；
2. 本发明为‘摄山丹叶’新品种保护提供了科学的技术保障；
3. 本发明为‘摄山丹叶’品种推广应用过程中的鉴定提供了实验证据。
具体实施方式
1. DNA 的提取及鉴定标记的获得
选择生产上常用且具代表性的27种荷花品种，采集这27个品种以及‘摄山丹叶’的幼嫩叶片，使用CTAB法提取其基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳和OneDrop分光光度计检测DNA质量和浓度。
用15对SSR引物对所提取的DNA进行扩增。SSR-PCR采用25μL的反应体系，其中包括：50ng DNA, 2.5μL 10×PCR buffer, 0.2mmolL-1 dNTPs, 1U Taq DNA聚合酶，正反向引物各4μmolL-1。SSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55°C ~ 60℃退火30s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物用美国ABI3730 进行自动荧光检测，用GeneMapper软件分析原始数据，获得各位点等位基因数据。
扩增结果表明，15对引物中SSRD01、SSRD02及SSRD03三对引物的PIC值最大，多态性最好（表1），用这三对引物完全可以区分‘摄山丹叶’与供试的其它27个品种，指纹数据见表2。
表1 三对SSR引物多态性
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表2 28个品种在3对SSR引物下的指纹数据
品种名称 引物SSRD01 引物SSRD02 引物SSRD03
‘摄山丹叶’ 148/164 233/249 268/284
金凤凰 158/172 233/249 266/282
碧云 164/172 229/245 266/282
粉青莲 172 229/245 268/284
锦衣卫 168/172 229 268/284
金太阳 158/172 233/245 266/282
逸仙莲 148/164 237 268/284
宜良千瓣 158 233/249 266
红台莲 158 233/249 266/282
伯里夫人 148/172 229 266/282
艾江南 148/168 233 266/282
大洒锦 158/164 233/249 266/282
友谊牡丹莲 164/172 229/245 268/284
中国红 瑞金 172/178 233/245 266/282
中国红 井冈山 158/164 249 266/282
中国红 遵义 158/164 245 268/284
中国红 延安 148/172 229/245 268/284
俊愉莲 158 233/249 266/282
精彩 158 245/249 268/284
星甸红莲 156/172 245 266/282
友谊莲 164 245 268/286
粉精灵 164/174 249 268/284
金陵畅想 164/174 229/233 266/282
中国红 西北坡 164/172 245 266/282
中国红 韶山 158/172 229/249 268/284
红唇 164 233/245 266/282
中国红 嘉兴 164/172 233/245 266/282
红纤指 158 249 266/282
2. 用所筛选的3对SSR引物对‘摄山丹叶’品种鉴定的验证实验
用上述3对SSR荧光引物，选择江苏省中科院植物所和企业新选育的16个荷花新品种，与‘摄山丹叶’同时进行扩增，扩增及检测方法同上。结果发现，这3对引物可以将‘摄山丹叶’与其它品种区分开，‘摄山丹叶’与这16个品种的SSR指纹数据见表3。
表3 17个品种在3对SSR引物下的指纹数据
品种 引物SSRD01 引物SSRD02 引物SSRD03
‘摄山丹叶’ 148/164 233/249 268/284
XY-N-1 158/164 245/249 268/284
XY-N-2 158/164 229/245 266/282
XY-N-3 158 203/215 266/268
XY-N-4 158/164 215/245 268/284
XY-N-5 158/164 229/249 266/282
XY-N-6 164 245 266/282
XY-N-7 164/174 229/249 266/282
XY-N-8 164/174 229/245 266/282
XY-N-9 158 229/245 266/282
XY-N-10 158 233/249 266/282
XY-N-11 158/164 229 266/282
XY-N-12 158/164 229/245 266/282
XY-N-13 164 245/249 268/284
XY-N-14 158/164 233/249 266/282
XY-N-15 164 233/245 266/282
XY-N-16 158/164 237/245 266/282
从验证结果可以看出，仅利用其中1对或2对SSR引物就可以区分‘摄山丹叶’与其它16个新品种，但考虑到未来可能会有更多新品种出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用以上3对引物同时进行检测，若3对引物扩增得到的结果与本发明公布的完全一致，则说明该品种为荷花品种‘摄山丹叶’。

Claims (1)

1.荷花品种′摄山丹叶′的分子鉴定方法，其特征在于：用荧光标记引物SSRD01(正向引物序列5-GACTAATGAAACAGGGGTTAGGGC-3，反向引物序列5-TCTCCAATCTCCCAACGACTCTTA-3)对′摄山丹叶′叶片提取的DNA进行扩增，扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位点的片段大小为148bp和164bp；用荧光标记引物SSRD02(正向引物序列5-TAGACCAGGCTAGGATGGGGTAG-3，反向引物序列5-AGTTAATGACATCTGCAGGGTGGT-3)对′摄山丹叶′叶片提取的DNA进行扩增，扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位点的片段大小为233bp和249bp；用荧光标记引物SSRD03(正向引物序列5-TTGGATTGAGTAAATGAGGGGAAA-3，反向引物序列5-AGAAACTTCCTCAGGTTTCAAGCA-3)对′摄山丹叶′叶片提取的DNA进行扩增，扩增产物通过毛细管电泳荧光检测，得到且只能得到该位点的片段大小为268bp和284bp；同时用以上3对引物对荷花某一品种进行SSR荧光扩增，每对引物得到结果与上述要求的SSR指纹数据完全一致，则表明该品种为′摄山丹叶′。
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