CN110669865B - 用于鉴定泰国莲种质的ssr分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用，包括2个分子标记SSR01和SSR02，可准确将泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质区分开来，有效克服表型早期鉴定难以准确区分泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质的缺点，在莲种质资源鉴定、遗传多样性分析上具有十分广阔的应用前景。

Description

用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用。
背景技术
莲属于莲属莲科的古老孑遗植物，约有1.35亿年的进化历史。全世界仅存两种，亚洲莲(Nelumbonucifera)和美洲莲(N.lutea)。亚洲莲分布较为广泛，北起俄罗斯南部，南到澳大利亚北部，并存在温带、热带两种类型。资源极为丰富，在株型、花型、花色、根状茎、果实及种子等方面表现出极为丰富的遗传多样性。美洲黄莲主要分布于美国，从北部的安大略湖和明尼苏达州至南部的得克萨斯州和东南部的佛罗里达州。其植株较小，地下茎仅前端膨大，叶色深绿，花单瓣黄色，为亚洲莲所缺少的花色。通过与美洲黄莲杂交选育花色更丰富、更艳丽的新品种在莲育种上具有重要意义。
亚洲莲的两种生态型，热带型和温带型，具有明显不同的生长习性。热带型莲主要种植在热带气候(如泰国、印度和中国热带地区)，其生长长年不停顿，地下茎不膨大成藕，而呈鞭状生长。即使引种到亚热带地区，地下茎仍为鞭状，绿叶期长达7个月(5-11月)，花期约5个月(6-10月)。温带型莲广泛种植于中国温带和亚热带地区，有明显的年生长周期，每年清明节前后萌芽生长，6-8月份开花，秋季枯萎凋谢而地下茎膨大成藕，冬季至次年3月份处于休眠状态。热带型莲为改良花期性状提供了宝贵材料，是延长温带型莲花期的最佳亲本选择。
目前莲种质主要是通过外部形态鉴定，但形态特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。特别是在莲幼苗期，泰国莲与美洲黄莲、中国野生莲种质间在植物学形态上差异较小，要到花期通过花色与美洲黄莲区分开，到秋季成藕期才能通过地下茎是否膨大成藕进行鉴别。这给利用泰国莲为亲本材料选育长花期莲新品种工作带来了很大的限制，不利于泰国莲种质的高效利用。因此，迫切需要寻找一种真实有效、不受环境影响，能够准确区分泰国莲种质与美洲黄莲、中国野生莲种质中的简单、有效的鉴别技术。
分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。SSR(简单重复序列)分子标记，是以PCR为基础的DNA多态性检测技术，数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已成为作物种质资源鉴定的一种理想分子标记。该标记可通过比较材料之间的扩增条带，就对同一物种的不同品种进行有效准确的鉴定评价，鉴定结果客观公正、可靠性高，这对泰国莲种质的收集、保存、评价和利用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于快速、准确鉴定泰国莲种质的SSR分子标记及其应用，可将泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质资源准确区别开，操作简单、重现性好、准确度高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
申请人收集了不同地理来源、有代表性的92份莲种质资源，包括泰国莲种质25份、美洲黄莲野生种质17份和中国莲野生种质50份，作为实验材料。同时利用生物信息学技术根据千年古莲“中国古代莲”的基因组序列设计了500对SSR引物。以形态学特征差别较大的6个莲种质进行了大量引物的筛选，筛选出36对多态性好、主带清晰的引物。进一步用36对SSR引物对92份莲种质资源进行PCR扩增，从中寻找能区分能够区分泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质的特异性引物对。最终筛选出2对SSR引物可准确鉴定出泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质。
用于PCR扩增分子标记SSR01的引物序列为：
正向引物SSR01F：5'-AAGTACCATGTATGCGTCAG-3'和
反向引物SSR01R：5'-CCAGCCCTCATCTTATTG-3'。
用于PCR扩增分子标记SSR02的引物序列为：
正向引物SSR02F：5'-GGGAGGGATTGAAATGAT-3'和
反向引物SSR02R：5'-AATGGTAGCGACAACGAC-3'。
利用上述SSR分子标记鉴定泰国莲种质的方法，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定莲种质资源的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，分别利用分子标记SSR01和SSR02的引物对进行PCR扩增反应；
(3)利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳技术及快速银染法检测PCR扩增产物；
(4)根据特异性带型鉴定泰国莲：如果分子标记SSR01出现200bp和185bp两条DNA条带，分子标记SSR02出现180bp和155bp两条DNA条带，则可判断为泰国莲。
本发明的有益效果在于：本发明提供的SSR分子标记可将泰国莲种质与美洲黄莲、中国莲野生种质资源准确区别开，操作简单、重现性好、准确度高，有效克服苗期用表型鉴定方法无法准确鉴定区分泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质的缺点。
附图说明
图1为利用本发明的SSR分子标记的引物组合对92个莲种质基因组扩增结果的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，A为分子标记SSR01的电泳图，B为分子标记SSR02的电泳图。图中泳道编号的顺序同表1样品编号。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Michael R.Greenhe和Joseph Sambrook编著的分子克隆实验指南(Molecular cloning:a laboratory manual,2012)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
(1)供试材料
收集了不同地理来源、有代表性的92份莲种质资源，包括美洲黄莲野生种质17份、泰国莲种质25份和中国莲野生种质50份，具体信息如表1所示。
表1 92份供试莲种质
Figure BDA0002262903220000031
Figure BDA0002262903220000041
(2)基因组DNA的提取
以苗期新鲜叶片为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA，详细步骤如下：
I取鲜样约0.5克放入冰浴的研钵中，加1mL CTAB提取液，把叶片磨碎至浆状，然后转移装到2.0mL离心管中；
II将离心管置于65℃水浴恒温煮60分钟，其间混合2-3次；
III于12000rmp离心10分钟，吸取上清液至一干净离心管中；
IV加等体积的24:1(v:v)的氯仿：异戊醇，轻轻颠倒使其充分摇匀；然后12000rmp离心10分钟使其分层；吸取上清液，重复一次加等体积的24:1(v:v)的氯仿：异戊醇；
V轻轻吸取上清液至干净离心管，加800μL的-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻30分钟，以沉淀DNA；
VI取出白色絮状DNA，用200μL的75％乙醇浸泡5个小时；
VII倒掉乙醇，重复加75％乙醇1次，浸泡1个小时，把离心管置于通风橱内吹干；
VIII加入100mL TE溶液溶解DNA；
IX用0.8％琼脂糖凝胶电泳和OneDrop分光光度计检测DNA质量和浓度；
X将DNA浓度稀释为50ng/μL备用。
(3)SSR分子标记的获得过程
利用生物信息学技术根据千年古莲“中国古代莲”的基因组序列设计500对SSR引物。以形态学特征差别较大的6个莲种质进行引物的初步筛选，筛选出36对多态性好、主带清晰的引物。然后用筛选出的36对SSR引物对表1中的92份莲种质资源进行PCR扩增，从中寻找能够区分美洲黄莲、泰国莲和中国莲野生种质的特异性引物对。最终筛选出2对SSR引物可以准确鉴定出泰国莲、美洲黄莲和中国莲野生种质。
用于PCR扩增分子标记SSR01的引物序列为：
正向引物SSR01F：5'-AAGTACCATGTATGCGTCAG-3'和
反向引物SSR01R：5'-CCAGCCCTCATCTTATTG-3'。
用于PCR扩增分子标记SSR02的引物序列为：
正向引物SSR02F：5'-GGGAGGGATTGAAATGAT-3'和
反向引物SSR02R：5'-AATGGTAGCGACAACGAC-3'。
其中，PCR反应体系按10μL计为：50ng DNA模板，2μL 10×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶，0.2mmol/L dNTPs，正反引物各4μmol/L。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58～60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存。
(4)PCR产物检测
PCR反应产物在6％变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，50w恒功率电泳90分钟，常规银染技术进行显色反应。为了减小读带的人为误差，以提高试验的准确性，电泳时严格控制电泳时间和电压。
(5)电泳结果分析
利用上述引物分别对92份供试莲种质资源PCR扩增的电泳结果如图1所示，其中图1中泳道编号与表1材料编号对应。SSR01在美洲黄莲野生种质中能扩增出235bp和210bp的DNA条带，在泰国莲种质中能扩增出200bp和185bp的DNA条带，在中国莲野生种质中能扩增出190bp和175bp的DNA条带。SSR02在美洲黄莲野生种质中能扩增出165bp和115bp的DNA条带，或者195bp和170bp的DNA条带，在泰国莲种质中能扩增出180bp和155bp的DNA条带，在中国莲野生种质中能扩增出140bp和100bp的DNA条带。这92份莲种质的SSR指纹数据见表2。
表2供试92份莲种质在2对SSR引物的标记结果
Figure BDA0002262903220000051
从验证结果可以看出，仅利用其中1对或2对SSR引物就可以区分泰国莲种质和美洲黄莲、中国莲野生种质，但考虑到未来还会有更多新资源出现，所以为了鉴定的科学性，本发明建议采用2对引物同时进行泰国莲种质检测。同时出现上述特异性带型，可以判定为这些泰国莲种质。如出现其他带型组合，则为泰国莲与美洲黄莲、中国莲野生种质的杂交后代。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.用于鉴定泰国莲种质的SSR引物，其特征在于，由用于扩增分子标记SSR01的引物和扩增分子标记SSR02的引物组成，扩增分子标记SSR01的引物为：正向引物SSR01F：5'-AAGTACCATGTATGCGTCAG-3'，反向引物SSR01R：5'-CCAGCCCTCATCTTATTG-3'；用于扩增分子标记SSR02的引物为：正向引物SSR02F：5'-GGGAGGGATTGAAATGAT-3'，反向引物SSR02R：5'-AATGGTAGCGACAACGAC-3'。
2.基于权利要求1所述的SSR引物用于鉴定泰国莲种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待鉴定莲种质资源的基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，分别用分子标记SSR01的正向引物SSR01F：5'-AAGTACCATGTATGCGTCAG-3'和反向引物SSR01R：5'-CCAGCCCTCATCTTATTG-3'，以及分子标记SSR02的正向引物SSR02F：5'-GGGAGGGATTGAAATGAT-3'和反向引物SSR02R：5'-AATGGTAGCGACAACGAC-3'进行PCR扩增反应；
(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；
(4)根据特异性带型鉴定泰国莲，如果分子标记SSR01出现200bp和185bp两条DNA条带，分子标记SSR02出现180bp和155bp两条DNA条带，则可鉴定为泰国莲。
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