CN109576377A - 一种利用issr体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法 - Google Patents

一种利用issr体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，它涉及玉米螟种群遗传多样性的方法；本发明是要解决目前没有一种有效的分子标记方法，尤其是ISSR分子标记方法用于鉴别玉米螟，尤其是亚洲玉米螟的不同地理种群的遗传结构及亲缘关系，从而明确玉米螟迁移变化情况的问题；本发明提供了一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法。该方法是一种简单，易于操作的分子标记技术，该方法所选用的14条ISSR引物序列，在玉米螟中PCR扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高，可为玉米螟资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供技术支持。本发明应用于玉米螟领域。

Description

一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法。
背景技术
自然界中的绝大多数物种会因为其行为习性差异以及不对称的环境因子导致基因流的不随机性，从而使不同区域的物种种群间发生不同程度的遗传差异。由于这种不同种群间发生分化形成新物种现象的发生也产生了种群遗传结构多样性以及种群遗传学。
分子标记是目前研究种群遗传学的重要技术之一，随着分子生物学研究技术手段的迅猛发展，不断出现了各种分子标记技术，ISSR分子标记是以SSR分子标记技术为基础衍生出的技术具有SSR分子标记的优点，能够达到在基因组上扩增并快速有效地检测出基因组DNA上的多态性，且适用物种范围广，还可以揭示不同个体间SSR位点变异信息以及能够提供多位点信息，操作方便，成本低，重复性好，适合大样本检测，且ISSR分子标记技术采用的引物序列较长，多态性好，与普通的SSR分子标记技术相比提高了实验结果的可靠性。目前，ISSR分子标记技术广泛应用在种群遗传学、种质资源、分类学与种系发生学等研究方向。但目前采用ISSR分子标记对昆虫种内及种间遗传多样性分析的研究较少，大多集中在植物种质资源的研究中，而在对玉米螟种群遗传多样性的研究相对较少。
玉米螟俗称玉米钻心虫，属于鳞翅目，螟蛾科，是世界性害虫。玉米螟主要有亚洲玉米螟和欧洲玉米螟两种，前者主要分布于印度、东南亚、中国(包括台湾省)、朝鲜、日本、澳大利亚及太平洋西部的许多岛屿；后者几乎遍及世界各国，其中受害严重的有美国、加拿大及欧洲和非洲许多国家。广泛分布于欧洲、北美洲、东亚、南亚、大洋洲及太平洋上的一些岛屿。在中国，这两种玉米螟都有分布，但以亚洲玉米螟为主。亚洲玉米螟在我国的分布范围跨越了很大的经纬度，由于其成虫飞行扩散能力强，若干代(年)后，可能使得相邻的或不同生态区域的种群之间发生基因交流，使不同区域的物种种群间发生不同程度的遗传差异。
黑龙江省是我国玉米种植面积第一大省，同时也是我国玉米产量第一大省。近些年，随着杂交玉米的推广和栽培技术的改进，加上气候的变化，使黑龙江省玉米种植分布从最初的一、二积温带扩展到三、四积温带，玉米螟繁衍生息发生了变化，也表明亚洲玉米螟在黑龙江省的扩散形势非常严峻。为了减少玉米螟的危害，人们大量喷洒化学农药，再加上玉米又释放有毒的次生代谢物使得玉米螟产生抗药性。因此亚洲玉米螟在黑龙江省的分布扩散现状非常严峻。
亚洲玉米螟不同地理种群遗传结构分析对于其物种演变、扩散及综合防治等反方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前没有一种有效的分子标记方法，尤其是ISSR分子标记方法用于鉴别玉米螟，尤其是亚洲玉米螟的不同地理种群的遗传结构及亲缘关系，从而玉米螟迁移变化情况的问题，而提供了一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法。该方法是一种简单，易于操作的分子标记技术，可为玉米螟资源鉴定、遗传多样性分析等科学研究提供技术支持。
本发明公开了一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR分子标记引物，所述的引物序列包括：
引物807：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；
引物810：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示；
引物818：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：3所示；
引物825：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：4所示；
引物826：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：5所示；
引物835：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：6所示；
引物836：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：7所示；
引物847：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：8所示；
引物848：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：9所示；
引物849：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：10所示；
引物855：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：11所示；
引物878：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：12所示；
引物880：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：13所示；
引物890：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：14所示。
本发明一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，每25μL的反应体系中含有模板1μL，Taq酶0.125μL，Buffer2.5μL，dNTP2μL，引物1μL，ddH2O18.375μL；将上述反应体系按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，40～61℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
本发明的一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，它包括以下步骤：
一、玉米螟基因组DNA的提取；
二、采用ISSR-PCR反应体系对步骤一提取的DNA样品进行扩增；
三、对步骤二扩增后的PCR产物进行电泳，显色，显色后，拍照获取电泳条带信息并保存；
四、将得到的电泳图进行分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵；通过软件获得各玉米螟种群相似系数矩阵，并玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。
本发明的ISSR引物是在辅助鉴定玉米螟不同地理种群的遗传结构及亲缘关系的应用。
本发明包含以下有益效果：
本发明以得到的亚洲玉米螟基因组DNA为模板，从University ofBritishColumbia提供的100个ISSR标准引物序列中筛选出适合亚洲玉米螟的引物序列，并进行了PCR条件优化，筛选得到14条ISSR引物序列，在玉米螟中PCR扩增反应稳定，扩增片段清晰，多态性高。本发明建立的ISSR分子标记方法，为玉米螟不同地理种群的遗传结构及亲缘关系分析提供了技术支持，该方法可以低成本，大批量短时间内完成试验材料的鉴定。
通过本发明建立的方法对黑龙江省亚洲玉米螟种群分布进行分析，利用UPGMA法对22个种群遗传距离情况进行分析制作聚类图，结果表明SQG、SAD及QNH三个地区的亚洲玉米螟与其他地区没有聚为一支，与其他地区的遗传距离最远，除了这三个地区以外的其他地区，遗传相似系数高，证明在黑龙江省各个地方的亚洲玉米螟已经在很大程度上发生了相互的迁移变化，不同种群间存在着大量的个体迁移，基因交流频繁，亲缘关系较近。
本发明以黑龙江省亚洲玉米螟种群分布研究为基础，在分子水平上研究亚洲玉米螟抗药性机制，为掌握黑龙江省亚洲玉米螟对常用杀虫剂的抗性水平和抗药性分子特征，为合理使用化学杀虫剂防治亚洲玉米螟并为抗药性治理提供科学依据。
附图说明
图1为实施例1的技术路线图；
图2为实施例1亚洲玉米螟地理种群采集地点分布图；
图3为实施例1样本基因组DNA电泳结果图；
图4为实施例1ISSR-PCR反应电泳结果图；
图5为亚洲玉米螟22个种群基于ISSR的遗传相似性UPGMA聚类图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR分子标记引物，所述的引物序列包括：
引物807：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；
引物810：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示；
引物818：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：3所示；
引物825：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：4所示；
引物826：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：5所示；
引物835：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：6所示；
引物836：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：7所示；
引物847：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：8所示；
引物848：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：9所示；
引物849：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：10所示；
引物855：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：11所示；
引物878：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：12所示；
引物880：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：13所示；
引物890：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：14所示。
具体实施方式二：本实施方式的一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，每25μL的反应体系中含有模板1μL，Taq酶0.125μL，Buffer2.5μL，dNTP2μL，引物1μL，ddH2O18.375μL；将上述反应体系按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，40～61℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：引物选择自具体实施方式一所述的Seq ID No：1～14中的任意一条。
其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：
引物807：54℃；
引物810：51.8℃；
引物825：53.4℃；
引物825：53.0℃；
引物826：50.1℃；
引物835：59.0℃；
引物836：54.2℃；
引物847：54.2℃；
引物848：54.2℃；
引物849：56.9℃；
引物855：52.1℃；
引物878：50.4℃；
引物880：50.4℃；
引物890：52.8℃。
其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，它包括以下步骤：
一、玉米螟基因组DNA的提取；
二、采用ISSR-PCR反应体系对步骤一提取的DNA样品进行扩增；
三、对步骤二扩增后的PCR产物进行电泳，显色，显色后，拍照获取电泳条带信息并保存；
四、将得到的电泳图进行分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵；通过软件获得各玉米螟种群相似系数矩阵，并玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤二所述SSR-PCR反应体系为：每25μL的反应体系中含有模板1μL，Taq酶0.125μL，Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物1μL，ddH2O 18.375μL；将上述反应体系按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，40～61℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六不同的是：该PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶成像系统拍照保存，得到的电泳图用Quantity One分析软件分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵。其它与具体实施方式五或六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五至六之一不同的是：二元数据用POPGEN32分析，得到各亚洲玉米螟种群相似系数矩阵，利用UPGMA法对22个亚洲玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。其它与具体实施方式五至六之一相同。
具体实施方式九：本实施方式采用具体实施方式一所述引物应用，它在辅助鉴定玉米螟不同地理种群的遗传结构及亲缘关系的应用。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式九不同的是：所述的玉米螟为亚洲玉米螟。其它与具体实施方式九相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
为了更清楚表达本发明，下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购得。
实施例1
本实施例对采集自黑龙江省不同积温带亚洲玉米螟危害严重地区的自然种群进行实验。
1、材料与方法
1.1供试亚洲玉米螟种群
供试的亚洲玉米螟种群采集自黑龙江省不同积温带亚洲玉米螟危害严重地区的自然种群，详见表1和图2。
表1黑龙江省亚洲玉米螟不同种群样品的采集情况
1.2实验方法
1.2.1亚洲玉米螟基因组DNA的提取
(1)1.5mL离心管中加入亚洲玉米螟样本和适量SDS细胞裂解液，用枪头捣碎玉米螟；
(2)65℃温浴30min，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，轻轻混匀，抽提5min，4000r/min离心5min；
(3)吸上清移至新离心管，重复三次；
(4)最后得到的上清液中加入等体积冷冻无水乙醇，-20℃过夜；
(5)次日12000r/min离心10min，沉淀的DNA用75％乙醇洗涤一次，双蒸水定容，1％琼脂糖凝胶电泳及超微量分光光度计检测DNA纯度及浓度，通常DNA样品的的纯度应保证在1.8左右，将提好的DNA-20℃条件下保存备用。
1.2.2PCR反应扩增
本实验所用引物参见University of British Columbia提供的ISSR标准引物序列，从中筛选出适合亚洲玉米螟使用的引物序列。反应体系和条件见表2。
表2PCR反应体系和条件
PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶成像系统拍照保存，得到的电泳图用Quantity One分析软件分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵。二元数据用POPGEN32分析，得到各亚洲玉米螟种群相似系数矩阵，利用UPGMA法对22个亚洲玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。
2结果与分析
2.1亚洲玉米螟基因组DNA提取结果
共采集亚洲玉米螟22个自然种群，每个自然种群各提取30个单只亚洲玉米螟基因组DNA样本，共计660份，-20℃保存备用。部分基因组电泳图见图3。
2.2亚洲玉米螟ISSR分子标记方法优化
本实施例以得到的亚洲玉米螟基因组DNA为模板，从University ofBritishColumbia提供的100个ISSR标准引物序列中筛选出适合亚洲玉米螟的引物序列，并进行了PCR条件优化，经过筛选的ISSR引物序列及条件优化后的最适退火温度如表3所示。
表2-6ISSR引物序列及最适退火温度
注：B＝T,C or G；D＝A,T or G；W＝A or T；Y＝C or T.
Note:B＝T,C or G；D＝A,T or G；W＝Aor T；Y＝C or T.
2.3黑龙江省亚洲玉米螟不同区域种群遗传多样性和遗传结构的分析
将上述筛选出来的14个ISSR引物对黑龙江省22个种群的660个亚洲玉米螟DNA样品进行ISSR-PCR扩增，得到DNA指纹图谱如图4所示。利用Quantity One凝胶分析软件分析胶图，统计每个样品的里的各个迁移位置条带的有无情况，在相同位置如果有条带则记录为“1”，相应位置没有条带则记录为“0”，建立二元数据矩阵。将建立的二元数据矩阵输入分析软件POPGEN32中，获得22个亚洲玉米螟种群的相似系数矩阵，结果如表4所示。
表2-7亚洲玉米螟种群间的遗传相似性(右上角)与遗传距离(左下角)
Table 2-7Genetic Identity(above diagonal)and Genetic Distance(belowdiagonal)among Ostrinia furnacalis
筛选出的14条引物一共扩增出了42条清晰可见带，平均每个引物扩增出3条带，其中多态带41条，多态性条带比率为97.62％。黑龙江省亚洲玉米螟种群总的遗传多样性(Ht)为0.3236，种群内的遗传多样性(Hs)为0.2094，表明总的遗传变异主要来自种群间。根据总的遗传多样性和种群内遗传多样性计算不同种群间的分化水平(Gst)。所分析的22个黑龙江省亚洲玉米螟种群间的Gst为0.3531，表明总的遗传变异中有35.31％的变异存在于种群间，种群内的遗传变异为64.69％，种群间每代个体的基因流(Nm)为0.9161。利用UPGMA法对22个种群遗传距离情况进行分析制作聚类图，结果如图5所示。首先聚为一支的地区遗传距离最近，遗传背景相似度最高，从图中可知，SQG、SAD及QNH三个地区的亚洲玉米螟与其他地区没有聚为一支，与其他地区的遗传距离最远。
结果表明SQG、SAD及QNH三个地区的亚洲玉米螟与其他地区没有聚为一支，与其他地区的遗传距离最远，除了这三个地区以外的其他地区，遗传相似系数高，证明在黑龙江省各个地方的亚洲玉米螟已经在很大程度上发生了相互的迁移变化，不同种群间存在着大量的个体迁移，基因交流频繁，亲缘关系较近。
本实施例采用ISSR分子标记研究方法对采集自黑龙江省不同积温带的各亚洲玉米螟种群遗传结构进行分析，不仅为黑龙江省亚洲玉米螟扩散形势及种群遗传结构分析奠定基础，并为化学杀虫剂防治亚洲玉米螟的合理使用及黑龙江省亚洲玉米螟的防控提供科学的理论依据。
序列表
<110>黑龙江省植检植保站
<120>一种利用ISSR体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法
<160>14
<210>1
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物807。
<400>1
AGA GAG AGA GAG AGA GT 17
<210>2
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物810。
<400>2
GAG AGA GAG AGA GAG AT17
<210>3
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物818。
<400>3
CAC ACA CAC ACA CAC AG17
<210>4
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物825。
<400>4
ACA CAC ACA CAC ACA CT17
<210>5
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物826。
<400>5
ACA CAC ACA CAC ACA CC17
<210>6
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物835。
<400>6
AGA GAG AGA GAG AGA GYC18
<210>7
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物836。
<400>7
AGA GAG AGA GAG AGA GYA18
<210>8
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物847。
<400>8
CAC ACA CAC ACA CAC ARC18
<210>9
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物848。
<400>9
CAC ACA CAC ACA CAC ARG18
<210>10
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物849。
<400>10
GTG TGT GTG TGT GTG TYA18
<210>11
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物855。
<400>11
ACA CAC ACA CAC ACA CYT18
<210>12
<211>16
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物878。
<400>12
GGA TGG ATG GAT GGA T16
<210>13
<211>15
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物880。
<400>13
GGA GAG GAG AGG AGA15
<210>14
<211>17
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物890。
<400>14
VHV GTG TGT GTG TGT GT17

Claims (10)

1.一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR分子标记引物，其特征在于，所述的引物序列包括：
引物807：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示；
引物810：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：2所示；
引物818：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：3所示；
引物825：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：4所示；
引物826：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：5所示；
引物835：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：6所示；
引物836：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：7所示；
引物847：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：8所示；
引物848：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：9所示；
引物849：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：10所示；
引物855：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：11所示；
引物878：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：12所示；
引物880：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：13所示；
引物890：其核苷酸序列如序列表Seq ID No：14所示。
2.一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，每25μL的反应体系中含有模板1μL，Taq酶0.125μL，Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物1μL，ddH2O 18.375μL；将上述反应体系按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，40～61℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
3.根据权利要求2所述的一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，引物选择自权利要求1所述的Seq ID No：1～14中的任意一条。
4.根据权利要求2所述的一种用于玉米螟种群遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系，其特征在于，所述的退火温度根据所选择的引物来确定，具体如下：
5.一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
一、玉米螟基因组DNA的提取；
二、采用ISSR-PCR反应体系对步骤一提取的DNA样品进行扩增；
三、对步骤二扩增后的PCR产物进行电泳，显色，显色后，拍照获取电泳条带信息并保存；
四、将得到的电泳图进行分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵；通过软件获得各玉米螟种群相似系数矩阵，并玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。
6.根据权利要求5所述的一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，其特征在于，步骤二所述SSR-PCR反应体系为：每25μL的反应体系中含有模板1μL，Taq酶0.125μL，Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物1μL，ddH2O 18.375μL；将上述反应体系按如下程序进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，40～61℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，共40个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
7.根据权利要求5所述的一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，其特征在于，PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶成像系统拍照保存，得到的电泳图用Quantity One分析软件分析，统计各样本迁移位置条带有无，相同位置有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，建立二元数据矩阵。
8.根据权利要求5所述的一种利用ISSR反应体系分析玉米螟种群遗传多样性的方法，其特征在于，二元数据用POPGEN32分析，得到各亚洲玉米螟种群相似系数矩阵，利用UPGMA法对22个亚洲玉米螟种群进行聚类分析并制作聚类图。
9.权利要求1所述的引物应用，其特征在于，它在辅助鉴定玉米螟不同地理种群的遗传结构及亲缘关系的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的玉米螟为亚洲玉米螟。
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