CN101302564A

CN101302564A - 一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列及其应用

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Publication number: CN101302564A
Application number: CNA2008100498736A
Authority: CN
Inventors: 郑天存; 何中虎; 夏先春; 李新平; 杨光宇; 殷贵鸿; 韩玉林; 黄峰; 王丽娜
Original assignee: Zhoukou Academy of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhoukou Academy of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2028-05-27
Also published as: CN101302564B

Abstract

本发明涉及一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物以及其应用。所述引物序列包括wmc419和barc181两组引物，与提供的引物序列形成的SSR标记Xwmc419和Xbarc181紧密连锁的抗叶锈病基因对我国目前流行的大多数叶锈菌生理小种表现抗病。利用该分子标记可以对该抗病基因进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。另外筛选方法也简单易行，便于操作，该引物及其应用将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

Description

一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物以及其应用。

(二)背景技术

小麦叶锈病是一种世界性病害，其分布范围比条锈病和秆锈病更广。小麦叶锈病菌适应不同的气候条件，可在全世界不同的小麦种植区发生，若条件适宜可造成40％甚至更大的产量损失(Knott 1989)。在我国，小麦叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、西北及东北各地也日趋严重。在我国1969年、1973年、1975年和1979年曾几度大面积流行，造成严重减产。1998年，小麦叶锈病在全国较大范围内流行，山东鲁西南等地发病严重，后期病叶率达70-80％，严重的达100％，部分田块减产20％以上。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的最经济、有效、快捷的方法。目前已有60个抗叶锈病基因正式命名(McIntosh et al.2007)。其中大多数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Lr9，Lr19，Lr24和Lr38，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。

目前，在寻找和发掘抗源的过程中，分子标记技术使用较为广泛，特别是在小麦的基因作图中得到了广泛应用。分子标记包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP，近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗叶锈病基因。其中SSR标记由于其多态性高、共显性、稳定性好及染色体位置清楚而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和聚合育种。在利用分子标记进行抗性筛选和鉴定的过程中，特异性的引物是关键。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种用于小麦叶锈病抗性筛选的引物及其应用。

本发明采用的技术方案如下：

一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列，它包括wmc419和barc181两组引物，其中wmc419的上游引物序列为：5′-GTTTCGGATAAAACCGGAGTGC-3′，下游引物序列为：5′-ACTACTTGTGGGTTATCACCAGCC-3′；barc181的上游引物序列为：5′-CGCTGGAGGGGGTAAGTCATCAC-3′，下游引物序列为：5′-CGCAAATCAAGAACACGGGAGAAAGAA-3’。

如上所述的引物序列是从美国农业部网站公开的多个SSR引物中进行多次试验筛选得到的，在筛选小麦叶锈病抗性方面有很好的应用效果。具体应用为：以待测小麦基因组DNA为模板、wmc419和barc181为引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待测小麦有叶锈病抗性。

本发明所提供的用于筛选抗叶锈病小麦的分子标记分别是Xwmc419和Xbarc181，标记Xwmc419由引物wmc419扩增获得(153bp)，标记Xbarc181由引物barc181扩增获得(165bp)。

本发明中具体检测方法如下：

1)提取待测小麦基因组DNA为模板；

2)以wmc419和barc181为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增：

20μL PCR反应体系组成如下：

待测小麦基因组DNA 20～100ng，Taq酶0.5～1.2U，上下游引物(4μmol·L^-1)各0.5～1.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.2～0.6μL，10×PCR缓冲液2μL，余量为无菌蒸馏水；

优选组成如下：

待测小麦基因组DNA60ng，Taq酶1U，上下游引物(4μmol·L^-1)各1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，余量为无菌蒸馏水。

PCR反应条件为：94℃预变性4min，随后94℃变性1min，60℃(wmc419)或58℃(barc181)退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；

3)对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入变性载样指示剂，94℃变性10min后冷却，具体可于冰水混合物中冷却，然后在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待测小麦有叶锈病抗性。

所述变性载样指示剂组成为：98％(v/v)无离子甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.25％(w/v)溴酚蓝，0.25％(w/v)二甲苯氢氟，溶剂为蒸馏水。

本发明方法中引物wmc419和barc181分别扩增出SSR标记Xwmc419和Xbarc181，标记Xwmc419和Xbarc181与叶锈病抗性基因的连锁距离分别为4.8cm和6.1cm；该标记是从1984年育成的小麦品系周8425B和中国春杂交产生的F₁、F₂和F₃群体进行遗传分析和分子标记后找到的，与抗叶锈病基因紧密连锁。利用该分子标记可以对抗病基因进行标记辅助选择，还可实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。

Xwmc419和Xbarc181与叶锈病抗病基因紧密连锁可通过以下实验证实：

用强毒力叶锈菌生理小种THTT对小麦材料周8425B(由河南省周口市农科院选育)和中国春(亲本)的F₁、F₂和F₃代群体进行苗期抗病性鉴定，共鉴定F₁群体16株，F₂群体286株，125个F₃家系，周8425B表现中抗，中国春表现感病，F₁全部抗病，F₂中有208株表现抗病，78株表现感病，抗感分离符合3∶1(χ²＝0.79，P＞0.25)；125个F₃家系中27个家系表现纯合抗病，65个家系表现抗感分离，33个家系表现为感病，F₃家系分离比例为纯合抗∶抗感分离∶纯合感＝1∶2∶1(χ²＝0.78，P＞0.5)，这表明周8425B中含有一个显性抗病基因。从F₂代单株中选用20个抗病单株和20个感病单株分别组成抗病池和感病池。

以周8425B、中国春、抗病池和感病池的基因组DNA为模板，进行PCR扩增以及扩增产物的检测，PCR反应体系、扩增方法以及检测方法同本发明中的扩增体系及方法；

结果表明标记Xwmc419和Xbarc181在亲本和抗感池之间有多态性，用标记Xwmc419和Xbarc181对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的检测结果如图1和图2所示(P1为周8425B，P2为中国春，Br为抗病池，Bs为感病池，R为抗病单株，S为感病单株)，用标记Xwmc419检测出现了3种电泳带型，分别称为带型A、B和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单株可扩增出大约153bp的DNA片段，见图1中带型A，P2、感病池和感病单株可扩增出大约135bp的DNA片段，见图1中带型B；用标记Xbarc181检测出现了3种电泳带型，分别称为带型A、B和H(杂合带型)，周8425B、抗病池和抗病单株可扩增出大约165bp的DNA片段，见图2中带型A，P2、感病池和感病单株可扩增出大约185bp的DNA片段，见图2中带型B。

用标记Xwmc419和Xbarc181对F₂群体286个单株分别进行检测(反应体系和反应条件同上)，用Mapmanager QTX b20进行处理，绘制基因连锁图，如图3所示，表明这2个标记都与抗病基因连锁，遗传距离分别为4.8和6.1cm。将125个F₃家系用两个标记Xwmc419和Xbarc181进行检测，结果如表1所示，用Mapmanager QTX b20处理可知在F₃家系中抗病基因与两个标记的遗传距离分别为5.8cm和8.0cm。

表1125个F₃家系的苗期鉴定结果及SSR标记Xwmc419-1B和Xbarc181-1B在各个F₃家系中带型

RR表示纯合抗病的家系，Rr表示发生抗感分离的家系，rr表示纯合感病的家系；

A代表周8425B中的带型，B代表中国春中的带型，H代表杂合带型。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

与本发明提供的引物序列形成的SSR标记Xwmc419和Xbarc181紧密连锁的抗叶锈病基因对我国目前流行的大多数叶锈菌生理小种表现抗病。利用该分子标记可以对该抗病基因进行标记辅助选择，从而实现多个有效抗病基因的累加，延长品种的抗病性。另外筛选方法也简单易行，便于操作，该引物及其应用将在小麦抗病育种中发挥重要作用。

(四)附图说明

图1为微卫星引物wmc419对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果；

图2为微卫星引物barc181对抗感亲本、抗感池和F₂群体单株的PCR扩增结果；

图3为本发明wmc419和barc181引物扩增出的SSR标记与叶锈病抗病基因的遗传连锁图。

(五)具体实施方式：

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

本发明所用wmc419和barc181引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实施例1

取山前麦(抗叶锈病品种)的叶片，提取其基因组DNA 60ng为模板，Taq酶1U，引物序列(4μmol·L^-1)各1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，然后用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL，将反应体系在94℃预变性4min，随后94℃变性1min，60℃(wmc419)、58℃(barc181)退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；在扩增产物中加入8μL变性载样指示剂(其组成为：98％无离子甲酰胺，10mM EDTApH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯氢氟)，94℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却，每份变性的扩增样品取5μL在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，扩增产物中含有大约153bp和大约165bp大小的条带，证明山前麦含有抗叶锈病基因。

实施例2

取小麦材料安农7959(非抗叶锈病品种)的叶片，提取其基因组DNA 60ng为模板，Taq酶1U，引物序列(4μmol·L^-1)各1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，然后用无菌蒸馏水补充反应体系至20μL，将反应体系在94℃预变性4min，随后94℃变性1min，60℃(wmc419)、58℃(barc181)退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；在扩增产物中加入8μL变性载样指示剂(其配比为98％无离子甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯氢氟)，94℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却，每份变性的扩增样品取5μL在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，扩增产物中未见含有大约153bp和大约165bp大小的条带，证实安农7959不含有抗叶锈病基因。

SEQUENCE LISTING

<110>周口市农业科学院中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列及其应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

gtttcggata aaaccggagt gc 22

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

actacttgtg ggttatcacc agcc 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

cgctggaggg ggtaagtcat cac 23

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

cgcaaatcaa gaacacggga gaaagaa 27

Claims

1.一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列，其特征在于所述引物序列包括wmc419和barc181两组引物，其中wmc419的上游引物序列为：5′-GTTTCGGATAAAACCGGAGTGC-3′，下游引物序列为：5′-ACTACTTGTGGGTTATCACCAGCC-3′；barc181的上游引物序列为：5′-CGCTGGAGGGGGTAAGTCATCAC-3′，下游引物序列为：5′-CGCAAATCAAGAACACGGGAGAAAGAA-3’。

2.如权利要求1所述的引物序列在筛选小麦叶锈病抗性中的应用。

3.如权利2所述的引物序列在筛选小麦叶锈病抗性中的应用，其特征在于所述应用为：以待测小麦基因组DNA为模板、wmc419和barc181为引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待测小麦有叶锈病抗性。

4.如权利要求3所述的引物序列在筛选小麦叶锈病抗性中的应用，其特征在于检测方法如下：

1)提取待测小麦基因组DNA为模板；

20μL PCR反应体系组成如下：

PCR反应条件为：

94℃预变性4min，随后94℃变性1min，引物为wmc419和barc181的退火温度分别为60℃和58℃，退火时间为1min，72℃延伸1min，进行35个循环；

最后72℃延伸10min，4℃保存；

3)对扩增产物进行分离检测：在扩增产物中加入变性载样指示剂，94℃变性10min后冷却，然后在浓度为6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待测小麦有叶锈病抗性。

5.如权利要求4所述的引物序列在筛选小麦叶锈病抗性中的应用，其特征在于PCR反应体系每20μL组成如下：

待测小麦基因组DNA 60ng，Taq酶1.0U，上下游引物(4μmol·L^-1)各1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，余量为无菌蒸馏水。

6.如权利要求4所述的引物序列在筛选小麦叶锈病抗性中的应用，其特征在于所述步骤3)中变性载样指示剂组成为：98％(v/v)无离子甲酰胺，10mmol·L^-1EDTA(pH8.0)，0.25％(w/v)溴酚蓝，0.25％(w/v)二甲苯氢氟。