CN105755133A - 番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法与应用 - Google Patents

番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法与应用,本发明所提供的用于进行番茄颈腐根腐病分子标记的引物为两对，分别扩增732bp的抗病特异片段和535bp的感病特异片段。使用所述引物以番茄全基因组DNA为模板进行PCR扩增，通过分析目的片段多态性，有效鉴定番茄材料颈腐根腐病抗性。此分子标记准确度高、成本低、操作简便，可实现Frl基因的分子标记辅助育种，加快育种进程，具有很强的实用性。

Description

番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法与应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体的说，涉及一种番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法与应用。
背景技术
番茄颈腐根腐病(Fusariumcrownandrootrot，FCRR)是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici)侵染引起的土传病害，主要症状表现为在土壤与番茄植株茎基部交接处，环绕茎基部有明显的深褐色病斑。3-5片叶的幼苗被侵染从发病部位折倒而萎蔫死亡；5叶期以后至开花结果期植株发病，则表现为茎基部缢缩、呈深褐色，叶片逐渐萎蔫致死(耿丽华等，2012)。该病害最早发现于日本和美国的加利福尼亚，之后在很多国家爆发并成为严重影响番茄保护地生产和露地生产的重要病害(SatoandAraki,1974；ScottandJones,2000；Scott,2008)。在国内，江苏、山东、辽宁、宁夏等地多年连作的塑料大棚和日光温室中均有番茄颈腐根腐病发生的报道，并呈现逐年加重，迅速蔓延的趋势。我省大棚和日光温室番茄主产区包括烟台海阳市、潍坊寿光市、东营广饶县、德州齐河县与临邑县、临沂费县与苍山县等番茄颈腐根腐病已普遍发生，其中寿光蔬菜老菜棚80％以上发病，致死率在30％以上，高的达100％，造成严重减产甚至绝产。番茄颈腐根腐病已成为我省继线虫、黄化曲叶病毒等毁灭性病害爆发之后的另一重要普遍性病害，严重威胁着我省一百多万亩的保护地番茄生产，涉及千家万户菜农的收成。
Fazio等(1999)开发了抗番茄颈腐根腐病的RAPD分子标记，它们以TG101-UBC655-UBC116-UBC194-Frl的顺序连锁，其中UBC194与Frl紧密连锁，可以用于分子标记辅助育种。然而，Tanyolac(2010)和Truong(2011)的研究结果则否认了UBC194标记标定Frl基因的有效性，并且认为RAPD技术不能区分杂合和纯合材料，具有很大局限性。2014年报道的Frl基因的CAPS标记C2-25是根据与Frl紧密连锁的保守序列位点C2-At2g38025设计，此序列位于番茄9号染色体45cM的位置上(Staniaszeketal.,2014)。但是，CAPS标记需要酶切，成本高，实验程序繁琐，检测效率低。
综上所述，到目前为止，番茄育种中缺乏能有效跟踪Frl基因的分子标记，制约了番茄抗颈腐根腐病品种的育种效率和育种进程。开发有效的、易于操作且实用性强的Frl基因分子标记，对培育抗颈腐根腐病的番茄优良品种，有效控制番茄颈腐根腐病的危害，具有重要意义，也是一项重要的育种方法创新和技术创新。
参考文献：
1)FazioG,StevensMR,ScottJW.IdentificationofRAPDmarkerslinkedtofusariumcrownandrootrotresistance(Frl)intomato.1999.Euphytica,105:205-210.
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发明内容
本发明目的是针对现有技术中需要酶切，成本高，实验程序繁琐，检测效率低等不足与缺陷，提供一种成本低、快捷高效、准确率高的抗番茄颈腐根腐病分子标记及其标记方法和应用。
本发明技术方案如下：
利用设计的两对引物以番茄全基因组DNA为模板进行扩增，通过分析目的片段多态性，确定番茄材料是否抗颈腐根腐病。上述两对引物分别命名为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，包含有以下序列：SEQIDNO:1:
上游引物A1为5’–TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’，
下游引物A2为5’–TAGCATGAAGTACAAAATGGATATAG-3’；
扩增732bp抗病特异片段；
SEQIDNO:2:
上游引物B1为5’–TTTGGTTTCTTCAGCGGTGCTGGCA-3’，
下游引物B2为5’–TATCACACTTTTATCCCATTTTTTCG-3’；
扩增535bp感病特异片段。
优选的，抗番茄颈腐根腐病分子标记引物为：SEQIDNO:1:
上游引物A1为5’–TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’，
下游引物A2为5’–TAGCATGAAGTACAAAATGGATATAG-3’；
SEQIDNO:2:
上游引物B1为5’–TTTGGTTTCTTCAGCGGTGCTGGCA-3’，
下游引物B2为5’–TATCACACTTTTATCCCATTTTTTCG-3’。
本发明还提供了抗番茄颈腐根腐病分子标记检测方法：
a.CTAB法提取番茄全基因组DNA(具体方法见实施例1)。
b.PCR扩增：PCR反应体系为2×TaqMix10μL，引物A1、A2，B1、B2各0.5μL，DNA模板20-100ng，ddH2O补足20μL；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min。
c.电泳检测：PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，可获得732bp抗病特异条带或/和535bp感病特异条带，以此分析植株抗病性。其中，只检测到732bp特异片段的样品为纯合抗病材料；只检测到535bp特异片段的样品为纯合感病材料，检测到732bp和535bp两条特异片段的样品为杂合抗病材料。
本发明也提供了该分子标记在番茄抗颈腐根腐病品种选育中的应用。
应用有益效果如下：
(1)检测准确性高：对6169份番茄单株进行检测，结合田间抗病性状调查及人工接菌验证，本标记准确率可达95％，实用性强。可应用于番茄颈腐根腐病抗病分子标记辅助育种。
(2)检测成本降低：检测过程不需要限制性内切酶酶切，降低检测成本。
(3)操作简便：PCR扩增后可直接用琼脂糖电泳检测，且抗病和感病条带相差约200bp，操作简便，易于检测。
(4)效率提高：与CAPS分子标记相比，本发明的分子标记检测效率提高。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
图1：番茄颈腐根腐病分子标记对番茄单株的检测。M：DL2000Marker；样品1-16分别为：965-11、967-5、972-1、972-4、972-6、963-11、973-12、968-7、965-8、961-1、973-10、964-4、965-10、961-9、960-6、968-8。
图2：番茄颈腐根腐病病菌SG11接种不同番茄植株后的发病情况。1为965-11(抗病)，2为967-5(感病)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1：番茄颈腐根腐病抗病基因Frl分子标记的创建与应用
(1)取抗颈腐根腐病番茄材料30份和感病材料25份，用CTAB法提取其全基因组DNA：
1)将番茄叶片冷冻干燥，研磨，取0.6g样品到1.5mL离心管中,加入1mL预热CTAB，65℃水浴30min，期间颠倒3-5次；
2)加入400μL氯仿：异戊醇混液(24:1)，颠倒混匀，12000rpm离心15min；
3)取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置30min；
4)12000rpm离心10min，弃上清，用70％酒精洗涤1次；
5)晾干，加入60μLddH2O溶解，-20℃贮存备用。
(2)根据与番茄颈腐根腐病抗病基因Frl紧密连锁的保守序列
C2-At2g38025，利用引物C2-25以上述番茄样品DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖电泳检测，回收1100bp目的片段，TA连接、克隆后送北京Invitrogen公司测序。
所述引物C2-25序列为：
C2-25F：5’–ATGGGCGCTGCATGTTTCGTG-3’
C2-25R：5’–ACACCTTTGTTGAAAGCCATCCC-3’
(3)将抗病和感病序列比对分析，共发现16个碱基点突变位点和2个插入突变位点。分别为：297T/A、367A/G、384T/C、389T/C、397A/G、453A/G、471C/G、523G/A、623G/T、784T/C、837T/C、846G/C、907A/G、953A/C、962T/G、978C/A、471-472之间插入GC、642-643之间插入TT。
(4)设计引物：将碱基突变位点设在特异引物的3’端，在297位设计引物A1，在978位设计引物A2，在471位设计引物B1，在953位设计引物B2。引物交由上海Invitrogen公司合成，序列如下：
A1：5’-TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’；
A2：5’-TAGCATGAAGTACAAAATGGATATAG-3’；
B1：5’-TTTGGTTTCTTCAGCGGTGCTGGCA-3’；
B2：5’-TATCACACTTTTATCCCATTTTTTCG-3’。
(5)PCR扩增及电泳检测：PCR反应体系为：2×TaqMix10μL，A1(10μM)0.5μL，A2(10μM)0.5μL，B1(10μM)0.5μL，B2(10μM)0.5μL，DNA模板20-100ng，ddH2O补足20μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min。其中，PCR仪为BIO-RAD公司的S1000ThermalCycler。
PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，可检测到732bp抗病特异条带或/和535bp感病特异条带，以此分析植株抗病性。其中，只检测到732bp条带的样品为纯合抗病材料；只检测到535bp条带的样品为纯合感病材料，检测到732bp和535bp两条条带的样品为杂合抗病材料。
(6)番茄颈腐根腐病病菌SG11(由山东省设施蔬菜分子育种省级重点实验室保存)接种鉴定。在1片真叶时用浓度为107个/mL的孢子悬浮液浸根处理10min进行接种。2周后观察、记录番茄植株的发病情况。同该标记检测结果比对，确认该分子标记准确性。正常植株与发病植株对比图见图(2)。
实施例2：抗番茄颈腐根腐病分子标记在番茄抗病品种选育中的应用
(1)荷兰引进番茄颈腐根腐病纯合抗病品种R326和纯合感病品种S531，两者杂交得F1群体；
(2)对22份F1单株进行该分子标记检测(表1)，并进行人工接种验证，均为杂合抗病植株，将F1单株自交得到F2群体；
(3)对512份F2单株进行该分子标记检测(表2)，并结合田间农艺性状调查以及人工接种验证，获得纯合抗病单株125份、杂合抗病单株258份、纯合感病单株129份，三者比例接近1:2:1，符合孟德尔遗传定律。
表1F1群体抗番茄颈腐根腐病分子标记检测结果
表2F2群体抗番茄颈腐根腐病分子标记检测结果(部分)
实施例3：抗番茄颈腐根腐病分子标记在辅助选育优质抗病番茄品种中的应用
(1)用抗番茄颈腐根腐病分子标记对4318份番茄低代自交系材料(F2、F3、F4代)进行检测；
(2)对1851份高代番茄自交系材料(F5、F6、F7代)进行检测；
(3)结合人工接种及田间农艺性状调查，共获得1529份纯合抗病单株、984份感病单株和3656份杂合抗病单株。
部分检测结果如图1所示。M：DL2000Marker；样品1-16分别为：965-11、967-5、972-1、972-4、972-6、963-11、973-12、968-7、965-8、961-1、973-10、964-4、965-10、961-9、960-6、968-8。
检测结果如下：965-11、972-1、972-4、972-6、963-11、965-8、973-10、960-6为纯合抗病单株；967-5、961-1、965-10、961-9为纯合抗病单株；973-12、968-7、964-4、968-8杂合抗病单株。

Claims (5)

1.番茄颈腐根腐病分子标记，其特征在于：所述分子标记的引物序列包含以下序列：SEQIDNO:1:
上游引物A1为5’–TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’，
下游引物A2为5’–TAGCATGAAGTACAAAATGGATATAG-3’；
SEQIDNO:2:
上游引物B1为5’–TTTGGTTTCTTCAGCGGTGCTGGCA-3’，
下游引物B2为5’–TATCACACTTTTATCCCATTTTTTCG-3’。
2.如权利要求1所述的番茄颈腐根腐病分子标记，其特征在于：所述引物序列为：SEQIDNO:1:
上游引物A1为5’–TAAAGGACCATTTTTCGTAGACCATT-3’，
下游引物A2为5’–TAGCATGAAGTACAAAATGGATATAG-3’；
SEQIDNO:2:
上游引物B1为5’–TTTGGTTTCTTCAGCGGTGCTGGCA-3’，
下游引物B2为5’–TATCACACTTTTATCCCATTTTTTCG-3’。
3.番茄颈腐根腐病分子标记方法，其特征在于：
a.CTAB法提取番茄全基因组DNA；
b.利用权利要求2所述的引物A1、引物A2、引物B1和引物B2以全基因组DNA为模板进行PCR扩增；
c.电泳检测：PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，可获得732bp的抗病特异片段或/和535bp的感病特异片段，以此判断植株的抗病性。
4.如权利要求3所述的番茄颈腐根腐病分子标记方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min。
5.番茄颈腐根腐病分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在番茄颈腐根腐病抗病番茄品种选育中的应用。
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