CN104313021B - 小麦白粉病抗病基因Pm51的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子遗传学和小麦育种，具体涉及一种小麦白粉病抗病新基因Pm51的分子标记及其应用。本发明获得与抗白粉病基因Pm51连锁的功能性分子标记BQ246670。该标记是共显性标记，与Pm51的遗传距离为1.5cM，可以快速、准确鉴定小麦Pm51基因的存在与否以及存在状态并预测白粉病抗性，从而加快对抗小麦白粉病基因Pm51的利用。

Description

小麦白粉病抗病基因Pm51的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子遗传学和小麦育种，具体涉及一种小麦白粉病抗病新基因Pm51的分子标记及其应用。

背景技术

由白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)引起的小麦白粉病是小麦的主要病害，近年该病在我国的发病范围不断扩大、危害程度不断加重，是当前小麦生产的重要威胁之一。2013年白粉病在全国发生面积为1.05亿亩，其中，河南沿黄稻茬麦和中北部高产区、江苏沿海和里下河麦区、陕西秦岭北麓偏重发生，黄淮、江淮的其他麦区，西南、西北和新疆大部麦区，华北南部麦区中等发生。白粉病已成为仅次于赤霉病或条锈病的第二大病害。

培育抗病小麦新品系是防治小麦白粉病最经济、安全和有效的方法。迄今，国际上已正式命名了61个抗白粉病主效基因(Pm1-Pm50)，分布在46个位点上。然而，由于小麦白粉菌具有高度的遗传变异性，单个的抗病基因很容易被新的白粉菌毒力突变体克服而丧失抗性。发掘新的抗病基因及其连锁的分子标记、培育抗病基因聚合品种(系)，对于小麦抗白粉病新品种的培育，延长品种抗性具有重要意义。

长穗偃麦草是小麦遗传改良的重要基因资源之一，国内外学者对其进行了深入研究，将长穗偃麦草对小麦锈病、根腐病的抗性基因成功地导入小麦，育成品种已大面积应用到生产实践中。由此可见，将长穗偃麦草抗白粉病基因导入普通小麦中并对其进行遗传定位、标记开发和标记应用的研究对小麦抗病育种工作具有十分重要的理论和实践应用意义。

为转育偃麦草的抗白粉病基因，山西省农科院作物遗传研究所以八倍体小偃麦为桥梁，通过感病品种与八倍体小偃麦“小偃7430”杂交、回交，育成兼抗白粉病和条锈病的小麦新品系CH7086。白粉病抗病性鉴定及分子标记分析表明，CH7086携带有一个显性抗白粉病基因，国际基因组命名委员会将其命名为Pm51。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦白粉病抗病新基因Pm51的分子标记及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的一种小麦白粉病抗病基因Pm51的分子标记，命名为BQ246670，核苷酸序列为：

上游引物：5′-AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3′(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5′-ACATGAGTGAGTTGTGAGTC-3′(SEQ ID NO.2)。

本发明提供的一种小麦白粉病抗病新基因Pm51的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)以CH7086/台长29的F₂代群体基因组DNA为模板，以上述分子标记为引物，进行PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含10×buffer1.5μL、10mM dNTP0.15μL、2μM引物2.0μL、5UTaqDNA聚合酶0.15μL、50ng基因组DNA2.0μL，去离子水补足至15μL；扩增程序为:94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存备用；

(2)PCR产物检测，用2％琼脂糖凝胶电泳，将15μL PCR产物和10μL上样缓冲液混合点样，110V电泳1.5h，EB染色拍照；

(3)分析鉴定，能扩增出500bp的特异条带，则说明待测小麦种质中存在抗白粉病基因Pm51，否则，待测小麦种质中不存在抗白粉病基因Pm51。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明获得与抗白粉病基因Pm51连锁的功能性分子标记BQ246670。该标记是共显性标记，与Pm51的遗传距离为1.5cM，可以快速、准确鉴定小麦Pm51基因的存在与否以及存在状态并预测白粉病抗性，从而加快对抗小麦白粉病基因Pm51的利用。

附图说明

图1为Pm51的比较基因组图谱

(A)2BL物理图谱(B)Pm51的遗传图(C)Pm51对应的水稻基因组区域(D)Pm51对应的短柄草基因组区域

图2为功能性标记BQ246670在CH7086/台长29的F₂代部分单株的扩增结果，

图中P_R：CH7086(含Pm51)、Ps：台长29、B_R：抗病基因池(含Pm51)、Bs：感病基因池、R:抗病单株(含Pm51)、S:感病单株

具体实施方式

实施例1

十倍体长穗偃麦草是小麦抗病育种的优良抗源，为了利用长穗偃麦草中的抗白粉病基因，我们对源自长穗偃麦草的小偃麦渗入系CH7086中抗白粉病基因Pm51进行定位、功能性分子标记的开发和应用。

一、苗期白粉病鉴定分析

用4个白粉菌生理小种在2-4叶期分别对各供试材料进行苗期离体白粉病抗性鉴定。温室播种实验材料待第一叶片完全展开，剪取叶段约2-4cm，水平放置在培养基表面，叶面朝上，用解剖针挑取白粉菌的孢子接种于叶段上。将接种完的叶段置于光照培养箱(20-23℃)，白天加光，晚上黑暗。10d后参照盛宝钦提出的小麦白粉病苗期反应型0-4级的分级标准，观察反应型。

二、成株期白粉病抗性鉴定及抗病基因的遗传分析

在温室用当前白粉病流行生理小种E09对各后代群体进行白粉病抗性鉴定，将待鉴定材料按单株播于温室，抗感亲本和F1各种1行、每行15粒，F2种16行、共点播240粒。F2:3家系中每一株系至少保证15株以上，每隔5行种值感病对照和诱发材料。诱发材料为京双16，感病对照为辉县红。用扫拂法人工接种E09分生孢子，待诱发材料充分发病后，于抽穗期和开花期各进行一次抗病性鉴定，以发病最重的一次作为抗性评价依据。成株期侵染型，参照修改过的CIMMYT的叶部病害0-9级方法，并根据0-4级侵染型叶片病斑表现确定最后定级的标准，0-2级属于抗病单株，3和4级属于感病单株。成株期白粉病0-4级侵染型分级标准如图2示。用χ²检验对各群体抗病性鉴定所获数据进行分离比适合度测验，从而确定CH7086所含抗白粉基因的数目。

三、F_2：3群体的分子标记分析

1、总DNA提取采用SDS法(Yang等.Hereditas,2005,142:80-85)。

2、分子标记分析：PCR反应体系总体积为15μL，扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，55～60℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min。扩增产物用8％聚丙烯酰胺非变性胶分离。

四、功能性标记开发及应用

利用小麦2BL染色体与水稻第4染色体的共线性关系，将小麦EST数据库(http://www.wheat.pw.usda.gov)公布的小麦2BL FL0.50-1.00区段内的所有EST序列与水稻的第4染色体基因组进行Blastn分析，选择与水稻同源的EST，利用Primer3.0软件设计开发功能标记。同时将开发标记在CH7086/台长29的F₂分离群体进行标记应用分析，其具体步骤如下：

(1)以CH7086/台长29的F₂代群体基因组DNA为模板，开发的功能性分子标记为引物进行PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含10×buffer1.5μL、10mM dNTP0.15μL、2μM引物2.0μL、5U TaqDNA聚合酶0.15μL、50ng基因组DNA2.0μL，去离子水补足至15μL；扩增程序为:94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存备用；

(2)PCR产物检测，用2％琼脂糖凝胶电泳，将15μL PCR产物和10μL上样缓冲液混合点样，110V电泳1.5h，EB染色拍照；

五、Pm51基因区段的小麦-水稻基因组共线性关系构建

选用与抗白粉病基因Pm51连锁的EST序列，搜索比对水稻和短柄草基因组序列数据库寻找与Pm51对应的水稻和短柄草基因。

六、数据分析

抗性分离群体F₂、F_2:3中观测值和理论期望值的适合度分析采用卡方检验(χ²)。遗传连锁图用Joinmap4.0软件分析计算，绘制连锁图用Mapdraw V2.1软件。

七、结果与分析

1、苗期白粉病鉴定分析

用4种白粉菌生理小种E09、E20、E21和E26在2-4叶期分别对各供试材料进行白粉病抗性鉴定，CH7086携带的抗白粉病基因很可能来源于其野生供体亲本十倍体长穗偃麦草。

用白粉病流行生理小种E09对4个杂交组合的抗病亲本、感病亲本和F₁群体进行苗期抗性鉴定说明CH7086的白粉病苗期抗性受显性基因控制。

表1小偃麦渐渗系、八倍体小偃麦及其亲本苗期离体白粉病鉴定结果

2、成株期白粉病抗性鉴定及遗传分析

在温室用白粉病生理小种E09对各后代群体成株期接种结果(表2)显示，CH7086表现免疫而感病亲本则表现为高感。F₁群体中，各杂交组合均对E09表现免疫。F₂代分离群体抗感分离卡方检验符合3R:1S的理论比例，F_2:3家系抗感分离单株数经卡方检验符合显性单基因控制理论比例(表2)，则CH7086含有一对显性抗白粉病基因。

表2抗×感杂交组合各世代对E09小种的抗性表现及分离

χ² _0.05,1＝3.84(df＝1),χ² _0.05,2＝5.99(df＝2)

3、抗白粉病基因的Pm51的分子标记分析及遗传图谱构建

5对SSR引物与抗白粉病基因Pm51连锁，Xwmc332、Xwmc317、Xwmc817、Xbarc159和Xgwm47与Pm51的遗传距离分别为3.2cM、30.1cM、32.8cM、42.5cM和23.8cM。3个Cos标记与抗白粉病基因Pm51连锁，Cos55、Cos65和Cos66与Pm51的遗传距离分别为5.4cM、5.1cM和11.6cM。6对EST-STS标记Xbcd135、BI479701、P79、BQ246670、BE444894和BE405017与基因Pm51存在连锁关系，其遗传距离分别为8.2、4.9、4.1、1.5、37.8和22.1cM(图2)

4、抗白粉病基因Pm51的比较基因组学分析

Pm51基因所在小麦2BL端部FL0.89－1.00区间与水稻第4染色体长臂约214kb基因组区间(Os04g56740～Os04g57140)和短柄草第5染色体长臂约198kb基因组区间(Bradi5g25090～Bradi5g25390)区间存在较好的共线性关系。

5、功能性标记BQ246670在分子标记辅助育种中的有效性检测

功能性标记BQ246670与Pm51基因的连锁距离最近。用标记BQ246670在Pm51后代材料中进行扩增，该标记只能在含有Pm51的后代材料中扩增出约500bp大小的特异条带(图2)，此结果说明，功能性标记BQ246670可以特异追踪Pm51基因，从而加快抗病育种进程。

八、结论

1、CH7086抗白粉病基因的来源、遗传方式及分子定位

CH7086是以小麦－长穗偃麦草部分双二倍体小偃7430为抗源，与普通小麦感病品种杂交、回交选育的高代品系，而杂交系谱中的小麦亲本晋春5号、太原768、76216-96和京411对白粉菌生理小种E09、E20、E21和E26表现出高度感病(表1)，而抗病亲本小偃7430及其野生亲本长穗偃麦草表现高抗，说明小偃麦渗入系CH7086中的抗白粉病基因可能来源于中间偃麦草。

CH7086与感病品种杂交后代群体的遗传分析结果说明其白粉病抗性受1对显性核基因控制。原位杂交和C-带分析说明CH7086中外源中间染色体片段较小，不存在基因累赘，在抗白粉病育种中具有重要意义。SSR标记和功能性标记对该基因进行遗传定位，14个标记与Pm51连锁。中国春第2同源群的缺体-四体和双端体材料将Pm51定位在小麦2B染色体的长臂上。

目前正式命名位于2BL上的白粉病基因有Pm6和Pm33。Pm6来源于提莫菲维小麦，Pm33源于波斯小麦，与Pm51来源完全不同；Pm6苗期只对小麦白粉病菌E15高抗(Wang等，Seedling and adult plant resistance to powdery mildew in Chinese bread wheatcultivars and lines，2005)，Pm33对小麦白粉菌E21表现感病，而Pm51对该小种表现免疫；Pm6与STS标记Xbcd135紧密连锁，遗传距离为0.8cM(Ji等，STS markers for powderymildew resistance gene Pm6in wheat，2008)，而Pm51与Xbcd135标记的遗传距离为8.2cM(图1)。Pm33与SSR标记Xwmc317紧密连锁，遗传距离为1.1cM，而Pm51与标记Xwmc317的遗传距离为30.1cM。因此，Pm51与Pm6和Pm33不是同一抗白粉病基因位点；将Pm51、Pm6和Pm33三者的载体品种分别杂交，对获得两个F₂代群体进行等位性测验。综合以上结果，可以断定Pm51与Pm6和Pm33不同，即Pm51是一个新抗白病新基因。

2、抗白粉病基因Pm51的比较基因组学分析

由于小麦2BL染色体与水稻第4染色体和短柄草第5染色体直系同源，利用与Pm51基因连锁的功能性标记对应的EST序列比对水稻和短柄草基因组发现，Pm51基因所在小麦2BL染色体区域与水稻第4染色体长臂约214kb基因组区间(Os04g56740～Os04g57140)和短柄草第5染色体长臂约198kb基因组区间(Bradi5g25090～Bradi5g25390)区间存在较好的共线性关系。

3、功能性标记在分子标记辅助育种中的有效性检测

功能性标记BQ246670与Pm51基因的连锁距离为1.5cM。用标记BQ246670在“CH7086×台长29”的后代材料中进行扩增，该标记能在含有Pm51的后代材料中扩增出约500bp大小的特异条带，而在感病亲本和单株中都无此片段出现(图2)。因此，功能性标记BQ246670可以用来特异追踪Pm51基因，从而提高抗病育种选择效率。

Claims (3)

1.扩增小麦白粉病抗病基因Pm51分子标记的引物，其特征在于，核苷酸序列为：

上游引物：5'-AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3'，

下游引物：5'-ACATGAGTGAGTTGTGAGTC-3'。

2.如权利要求1所述的扩增小麦白粉病抗病基因Pm51分子标记的引物在小麦抗白粉病基因Pm51鉴定中的应用。

3.一种小麦抗白粉病基因Pm51的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以CH7086/台长29的F₂代群体基因组DNA为模板，以权利要求1所述的扩增小麦白粉病抗病基因Pm51分子标记的引物，进行PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含10×buffer 1.5μL、10mM dNTP 0.15μL、2μM引物2.0μL、5U TaqDNA聚合酶0.15μL、50ng基因组DNA 2.0μL，去离子水补足至15μL；扩增程序为:94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，4℃保存备用；

(2)PCR产物检测，用2％琼脂糖凝胶电泳，将15μL PCR产物和10μL上样缓冲液混合点样，110V电泳1.5h，EB染色拍照；

(3)分析鉴定，能扩增出500bp的特异条带，说明待测小麦种质中存在抗白粉病基因Pm51，否则，待测小麦种质中不存在抗白粉病基因Pm51。