CN106191231B - 与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106191231B CN106191231B CN201610520348.2A CN201610520348A CN106191231B CN 106191231 B CN106191231 B CN 106191231B CN 201610520348 A CN201610520348 A CN 201610520348A CN 106191231 B CN106191231 B CN 106191231B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cabbage
- wax powder
- cgl
- brilliant green
- bcym000140
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明提供了一种与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl‑4紧密连锁的分子标记BCYM000140，其特征在于：所述分子标记BCYM000140的上下游引物具有如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了基于所述分子标记的用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl‑4的结球甘蓝种质资源的试剂盒和方法。本发明所述的标记或试剂盒，具有特异性好、准确性高的特点，能在植株生长早期简捷快速地获知所测材料是否含有无蜡粉亮绿基因cgl‑4，以便于更有针对性地开展后续育种工作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)属十字花科芸薹属，具有营养物质含量丰富、适应性广、易栽培、耐运输等特点，在我国蔬菜周年供应以及出口创汇中占有重要的地位，我国年栽培面积约90万hm2(方智远，2008；杨丽梅等，2011)。球色绿是结球甘蓝一项十分重要的商品性状，也是育种工作者的主要育种目标之一。由于结球甘蓝植株体表白色蜡粉的覆盖，结球甘蓝叶片一般表现为灰绿色或深绿色。植物体表蜡粉的合成和运输由多个基因控制，蜡粉合成基因的突变，会造成蜡粉合成通路中断和蜡粉的缺失，并最终导致叶色变成亮绿色或翠绿色。与野生型结球甘蓝相比，无蜡粉亮绿结球甘蓝具有质地脆嫩、VC等营养物质含量丰富的特点，表现出较好的商品性(初莲香，1992)。因此，无蜡粉亮绿突变体种质资源对选育商品性状美观、营养品质优良的结球甘蓝新品种具有十分重要的意义。
由于无蜡粉亮绿基因cgl-4是单基因隐性遗传基因(刘东明，2014)，所以用于配备无蜡粉亮绿结球甘蓝品种的双亲必需同时含有cgl-4基因。因为目前只搜集到一份具有突变基因cgl-4的结球甘蓝材料(LD10)，所以需要通过以LD10与其它亲本材料杂交、多代回交的方式将突变基因cgl-4引入到其它亲本，从而获得另一份含有cgl-4基因的亲本材料。由于cgl-4基因符合单基因隐性遗传规律，在突变体LD10与其它有蜡粉结球甘蓝杂交、回交得到的后代材料中，杂合子和纯合子类型材料体表均有蜡粉覆盖，无法直接通过外观性状判断其是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，需通过对其进行自交、测交等方式鉴定其基因型。这不仅加大了工作量，而且延缓了育种进程。DNA分子标记辅助育种技术可以在分子水平上利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，不受周围环境和时间的影响，减少工作量，加速育种进程。因此与cgl-4紧密连锁的分子标记的获得和利用将会对后代选择提供极大的辅助作用。虽然刘东明等(2014)已经对无蜡粉基因cgl-4的分子标记进行了研究，获得了一个与无蜡粉性状控制基因连锁的分子标记，但此标记与结球甘蓝无蜡粉基因cgl-4间的遗传距离较远，为4.7cM，连锁关系不紧密，在选择育种工作中易出现后代筛选错误、选择效率低下的问题，无法应用于实际辅助选择工作。因此开发与无蜡粉性状基因cgl-4连锁更加紧密、能实际应用于辅助育种的分子标记十分必要。
发明内容
基于上述领域的不足和需求，本发明提供了一个用于筛选结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的PCR标记，该分子标记需具有特异性强、稳定性好的特点。
本发明的技术方案如下：
一种与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140的引物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：
BCYM000140-F/BCYM000140-R:
CCCACTTCACTCTGCTTATG/GTATGGTCGAAGTGGTATGC
所述引物扩增的与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；
所述引物扩增的与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的试剂盒，其特征在于，包括所述的分子标记BCYM000140的引物。
所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的方法，其特征在于，采用所述的分子标记BCYM000140的引物或所述的试剂盒进行如下步骤：
(1)采用所述分子标记BCYM000140的引物对待选结球甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从电泳检测结果中筛选出与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带一致的材料，所述与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。
所述PCR扩增的反应体系为：15mmol/L MgCl2的10×Buffer 0.1μL/μL，含A、G、C、T各2.5mmol/L的dNTP 0.08μL/μL，上下游引物各0.33μmol/μL，Taq酶0.05U/μL，模板DNA4ng/μL，其余为双蒸水。
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s为1个循环，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
所述凝胶电泳检测指采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。
所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括所述分子标记BCYM000140的引物。
组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。
本发明基于发明人的前期研究，利用结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10和有蜡粉野生型材料21-3配制F1，F1植株自交获得F2代群体，共898个单株，鉴定每个单株的蜡粉有无情况，结果为有蜡粉单株667个，无蜡粉单株231个。经过引物开发、筛选、验证，最终获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140。
初步筛选：利用双亲LD10和21-3为模板，对本课题组现有的978对EST-SSR引物、2170对gSSR引物和255对Indel引物进行初步筛选，从中筛选出在双亲间存在多态性、条带清楚、易于识别、并可以稳定扩增的248对引物。
二次筛选：根据基于性状表现的分离群体分组分析法(BSA)原理，在F2群体中随机选取10株无蜡粉亮绿单株和10株有蜡粉单株构建无蜡粉亮绿基因池和有蜡粉基因池，以无蜡粉亮绿基因池、有蜡粉基因池为模板对上述初步筛选出的多态性引物进行再次筛选，获得可能与目标基因连锁的DNA引物1个。对该引物和F2群体单株有无蜡粉性状的连锁关系进行验证，确定该引物与无蜡粉基因cgl-4紧密连锁。
开发标记：基于上述标记和结球甘蓝基因组数据库的信息，在该标记附近区域开发了50对引物。
验证：用F2分离群体单株对新开发的引物进行验证和分析，最终筛选获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4连锁关系最紧密的分子标记BCYM000140。
本发明提供的与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记BCYM000140，其特征在于：所述分子标记BCYM000140的上下游引物的核苷酸序列分别如SeqID No.1和Seq ID No.2所示；所述分子标记BCYM000140的特异性引物扩增的与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述分子标记BCYM000140的特异性引物扩增的与结球甘蓝有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示，因此，采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增结球甘蓝基因组DNA。本发明所述标记BCYM000140与发明人2014年得到的分子标记相比，与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的遗传距离更近，遗传距离为0.28cM，连锁关系更为紧密，可实际应用于育种辅助选择。
基于所述分子标记BCYM000140，本发明还提供了一种用于筛选包含无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的试剂盒。所述试剂盒的特征是，包括具有如Seq ID No.1和Seq ID No.2所示的核苷酸序列的所述分子标记BCYM000140的引物；进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应和/或电泳所需的试剂。采用所述引物，以结球甘蓝基因组DNA为模板，采用常规试剂进行常规PCR反应与电泳即可获知所测基因组DNA对应的结球甘蓝材料是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，简单快捷，采用最少的步骤能最快地获得结果。本发明还请求保护所述试剂盒的制备方法，任何规模的基于商业目的销售或生产所述试剂盒的行为都属于本发明请求保护的范围，其中生产所述试剂盒的行为指组装试剂盒的试剂中包括具有如SeqID No.1和Seq ID No.2所示的核苷酸序列的引物。
本发明还请求保护采用所述分子标记BCYM000140或所述试剂盒进行包含无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源筛选的方法，即采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增待测结球甘蓝材料的基因组DNA，通过常规的PCR反应和电泳检测确定出符合育种条件的含有cgl-4基因的结球甘蓝育种材料。采用所述分子标记BCYM000140的引物扩增结球甘蓝基因组DNA，可能出现三种电泳结果：仅出现131bp特征条带，说明DNA模板对应的结球甘蓝材料是含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的隐性纯和材料；仅出现135bp特征条带，说明DNA模板对应的结球甘蓝材料是包含有蜡粉基因CGl-4的显性纯和材料；同时出现131bp和135bp两种条带，说明是含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的有蜡粉显性纯和材料。选出第1、3种条带对应的结球甘蓝材料用作育种材料，剔除第2种条带结果对应的材料。由此可见，采用所述分子标记BCYM000140，可以在结球甘蓝生长周期的任一阶段获知该结球甘蓝是否包含cgl-4基因，从而筛选出符合育种条件的结球甘蓝材料。采用本发明所述的分子标记BCYM000140对含有无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源进行筛选，具有限制少、较准确、效率高等特点。更重要的是，采用本发明所述的标记或试剂盒，可在结球甘蓝生长早期通过提取秧苗DNA进行PCR扩增，能简捷快速地获知该结球甘蓝秧苗是否含有无蜡粉亮绿基因cgl-4，并筛选出符合条件的秧苗，对于不符合条件的秧苗可以停止进一步继续培养，使结球甘蓝培育工作更有针对性，从而避免了产生多余劳动和资源浪费。
综上所述，本发明所述的分子标记BCYM000140或试剂盒以及基于它们的筛选方法，克服了常规育种方法所需时间周期长、工作量大等缺点，大大加速了育种进程、减少了工作量。因此，本发明结果在结球甘蓝育种实践中大大提高了育种效率，在实际育种和生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为无蜡粉亮绿结球甘蓝材料LD10；
图2为普通有蜡粉结球甘蓝材料21-3；
图3为标记BCYM000140在LD10×21-3的F2群体部分单株中的扩增结果。泳道1是MarkerⅠ，泳道2是亲本LD10，泳道3是亲本21-3，泳道4是F1，泳道5-36是F2群体无蜡粉亮绿单株，泳道37-68是F2群体有蜡粉单株；
图4为标记BCYM000140在无蜡粉亮绿材料LD10和其余20份有蜡粉材料的扩增结果。泳道1是MarkerⅠ，泳道2是亲本LD10，泳道3是有蜡粉甘蓝材料21-3,泳道4至泳道22是从市场搜集到的19份有蜡粉甘蓝材料，其详细信息见表1。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料
无蜡粉结球甘蓝突变体材料LD10由本所结球甘蓝课题研究组于2010年搜集获得，记载于《结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10遗传规律及分子标记研究》一文中；
有蜡粉结球甘蓝野生型材料21-3为本课题组原有自交系材料，记载于《结球甘蓝无蜡粉亮绿突变体材料LD10遗传规律及分子标记研究》一文中。
试剂与耗材
PCR反应所需的试剂，如10×Buffer、dNTP、Taq酶等；以及电泳所用的试剂，如聚丙烯酰胺等均可商购获得；PCR反应所需的试剂还可以是现有市面上常见的PCR试剂盒、PCR反应Mix等等。
实施例1、本发明所述分子标记BCYM000140的获得
(1)F2代分离群体的构建
利用结球甘蓝无蜡粉突变体材料LD10和有蜡粉野生型材料21-3配制杂交组合，F1群体单株全部表现为有蜡粉性状。F1代自交产生F2代群体，共898株个体，鉴定单株表型，其中有蜡粉单株667株，无蜡粉单株231株，经卡方检验验证其符合3:1的分离比例。
(2)结球甘蓝基因组DNA提取
用CTAB法提取亲本及F1、F2代群体叶片的基因组DNA。取大小约为1cm2的真叶至2mL离心管，加入750μL CTAB裂解缓冲液后置于打样器打样5分钟，65℃水浴15分钟，期间每隔5分钟轻微上下颠倒使之充分混匀。向上述匀浆裂解液中加入750μL氯仿异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，12000rpm 4℃离心15分钟。吸取上清液500μL至1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于零下20℃静置120分钟，12000rpm 4℃离心15分钟。弃上清，沿离心管壁加入500μL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁后弃去乙醇。室温干燥沉淀30分钟，加入100μL含RNA酶的TE缓冲液溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用TE缓冲液稀释终浓度为30ng/μL，于零下20℃备用。
(3)分子标记筛选
初步筛选：利用双亲LD10和21-3为模板，对本课题组现有的500对EST-SSR引物(陈琛等，2010)和2780对SSR引物(刘东明等，2014)进行初步筛选，从中筛选出在双亲间存在多态性、条带清楚、易于识别、并可以稳定扩增的378条引物。
二次筛选：根据基于性状表现的分离群体分组分析法(BSA)原理，在F2群体中随机选取10株无蜡粉亮绿单株和10株有蜡粉单株构建无蜡粉亮绿基因池和有蜡粉基因池，以无蜡粉亮绿基因池、有蜡粉基因池为模板对上述初步筛选出的多态性引物进行再次筛选，获得可能与目标基因连锁的DNA引物1个。对该引物和F2群体单株有无蜡粉性状的连锁关系进行验证，确定该引物与无蜡粉基因cgl-4紧密连锁。
开发标记：根据二次筛选获得的标记序列，对结球甘蓝全基因组数据进行比对，发现该引物位于1号染色体。根据结球甘蓝基因组数据，在该引物附件开发了50对引物。
验证：用F2群体单株对新开发的引物进行验证，结果表明引物BCYM000140与目的基因连锁最为紧密，为0.28cM,交换率最低，说明与之前获得的标记相比具有较高的选择效率。
筛选扩增分子标记时，进行的PCR反应的体系为10μL：模板2.0μL、Taq DNA聚合酶(5U·μL-1)0.2μL、10×PCR buffer(25mmol·L-1MgCl2)1.0μL、dNTPs(2.5mmol·L-1)0.8μL、Forward Primer(5pmol·L-1)0.4μL、Reverse Primer(5pmol·L-1)0.4μL、ddH2O 5.2μL。
PCR反应的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸7min，扩增产物4℃保存。采用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，设恒定电压160V，银染法染色。
经上述步骤，筛选获得一个与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记，并命名为BCYM000140。
扩增该标记的上下游引物分别为：BCYM000140-F/BCYM000140-R:
CCCACTTCACTCTGCTTATG/GTATGGTCGAAGTGGTATGC(Seq ID No.1/Seq ID No.2)；
所述引物扩增的结球甘蓝无蜡粉突变体材料LD10基因组DNA的特征条带(与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁)为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；
所述引物扩增的有蜡粉野生型材料21-3基因组DNA的特征条带(与结球甘蓝有蜡粉基因CGl-4紧密连锁)为135bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
实施例2、本发明所述试剂盒的组装
基于实施例1获得的分子标记BCYM000140，组装本发明所述的试剂盒。所述试剂盒包括扩增所述分子标记BCYM000140的具有Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列的上下游引物。
所述试剂盒还包括用于PCR反应和/或电泳的常规试剂。具体地，所述用于PCR反应的常规试剂包括：10×Buffer、dNTP、Taq酶等，也可以是常见的可商购获得的PCR试剂盒、PCR反应Mix等。
实施例3、采用本发明所述标记或试剂盒进行无蜡粉亮绿结球甘蓝的辅助选择育种
以无蜡粉亮绿基因材料LD10与野生型21-3进行杂交。结合分子标记辅助选择，通过多代回交，将LD10的无蜡粉亮绿基因cgl-4导入到21-3中。后代群体中含有LD10带型的单株用于育种改良。
实施例4、采用本发明所述标记或试剂盒验证其它遗传背景结球甘蓝材料
用实施例1获得的分子标记BCYM000140或实施例2所述的试剂盒在表1所列的19份不同遗传背景的结球甘蓝材料上进行验证，以确定该标记用于其它具有不同遗传背景结球甘蓝材料的分子标记辅助选择的准确性。验证方法采用实施例1描述的PCR反应和电泳检测方法。
用现有已知的19份不同遗传背景的结球甘蓝品种材料验证分子标记BCYM000140，如图4所示，条带显示结果与有无蜡粉的表型(或后代分离情况)的一致性为100％。进一步证实，通过本发明所述分子标记BCYM000140或试剂盒以及本发明所述的方法，可在将无蜡粉亮绿基因cgl-4引入到其他有蜡粉结球甘蓝材料的过程中，在结球甘蓝生长的任意阶段较为准确地进行分子标记辅助选择，从而大大提高育种效率。
表1有蜡粉结球甘蓝材料信息
Claims (4)
1.用于筛选包含结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4的结球甘蓝种质资源的方法，其特征在于，采用分子标记BCYM000140的引物进行如下步骤：
(1)采用所述分子标记BCYM000140的引物对待选结球甘蓝材料的基因组DNA进行PCR扩增；
(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；
(3)从电泳检测结果中筛选出与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带一致的材料，所述与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；
所述分子标记BCYM000140的引物具有如下核苷酸序列：
BCYM000140-F/BCYM000140-R:
CCCACTTCACTCTGCTTATG/GTATGGTCGAAGTGGTATGC
所述引物扩增的与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记特征条带为131bp，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示；
所述引物扩增的与结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.capitata L.)有蜡粉基因CGl-4紧密连锁的分子标记特征条带为135bp，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PCR扩增的反应体系为：15mmol/L MgCl2的10×Buffer 0.1μL/μL，含A、G、C、T各2.5mmol/L的dNTP 0.08μL/μL，上下游引物各0.33μmol/μL，Taq酶0.05U/μL，模板DNA 4ng/μL，其余为双蒸水。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；以94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s为1个循环，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝胶电泳检测指采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，于160V恒功率电泳分离，最后银染显色。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610028540X | 2016-01-15 | ||
| CN201610028540 | 2016-01-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106191231A CN106191231A (zh) | 2016-12-07 |
| CN106191231B true CN106191231B (zh) | 2019-11-01 |
Family
ID=57465168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610520348.2A Active CN106191231B (zh) | 2016-01-15 | 2016-07-05 | 与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106191231B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107312845B (zh) * | 2017-07-07 | 2020-11-03 | 华中农业大学 | 鉴别无蜡粉不结球白菜的引物、试剂盒及鉴别方法 |
| CN111254213B (zh) * | 2020-03-24 | 2022-06-24 | 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 | 一种与大白菜显性亮绿性状相关的InDel标记、引物及应用 |
| CN112813180B (zh) * | 2021-01-18 | 2023-11-03 | 江苏省农业科学院 | 一种用于鉴定甘蓝叶片蜡粉性状的分子标记、引物对及其应用 |
| CN113528698B (zh) * | 2021-07-14 | 2022-01-25 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101956012B (zh) * | 2010-09-30 | 2012-07-04 | 河北农业大学 | 一种鉴定结球甘蓝—大白菜异附加系的方法 |
-
2016
- 2016-07-05 CN CN201610520348.2A patent/CN106191231B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106191231A (zh) | 2016-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105385697B (zh) | 芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记 | |
| CN106191231B (zh) | 与结球甘蓝无蜡粉亮绿基因cgl-4紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN109762921B (zh) | 用于检测黄瓜果肉颜色的snp标记及其应用 | |
| CN109762920B (zh) | 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用 | |
| CN106755483A (zh) | 一种鉴定嘎拉苹果后代植株的ssr分子标记ii及其应用 | |
| CN110295251A (zh) | 与小麦有效分蘖数qtl连锁的snp分子标记及其应用 | |
| CN109593876A (zh) | 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用 | |
| CN110438252A (zh) | 与菠菜雌雄性别紧密连锁的分子标记及其应用 | |
| CN109988862A (zh) | 与甘蓝显性核基因雄性不育性相关的pcr标记及其应用 | |
| CN111394508B (zh) | 一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用 | |
| CN107365865A (zh) | 与番茄果实颜色相关的分子标记及其应用 | |
| CN105256031B (zh) | 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物 | |
| CN109929945A (zh) | 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF2604引物及其应用 | |
| CN114015796B (zh) | 一种与控制美洲南瓜浅白色果皮紧密连锁的分子标记、引物及应用 | |
| CN109609687B (zh) | 用于检测西瓜枯萎病抗性的kasp标记引物组合及其应用 | |
| CN106957897A (zh) | 黄瓜幼叶黄化基因的分子标记方法 | |
| CN106591489A (zh) | 水稻粒长基因gw7的分子标记及其专用引物序列 | |
| CN111926098B (zh) | 与茄子果色的上位性基因Y紧密连锁的InDel分子标记与应用 | |
| CN113637789A (zh) | 小麦抗条锈病基因YrTD121连锁的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用 | |
| CN108179220A (zh) | 小麦矮秆基因Rht12紧密连锁的KASP标记及其应用 | |
| CN107955838A (zh) | 温敏雄性核不育基因tms5功能分子标记的开发与应用 | |
| CN105803094B (zh) | 一种鉴定或辅助鉴定马铃薯熟性的scar标记及其应用 | |
| CN112592999A (zh) | 一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用 | |
| CN110283929A (zh) | 辣椒疫病抗性基因相关的snp标记5-160及其特异性引物和应用 | |
| CN112391489B (zh) | 一种与西瓜瓤色相关的snp分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |