CN111254213B - 一种与大白菜显性亮绿性状相关的InDel标记、引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与大白菜显性亮绿性状相关的InDel标记、引物及应用。十字花科芸薹属作物是一种常见的、以花茎作为食用部位的农作物，具有亮绿表皮性状的植株通常受到消费者的偏爱。本发明通过筛选获得一株由显性、单基因控制亮绿性状的突变体，并且通过生物信息学技术分离到显性基因控制的亮绿突变基因，确定了亮绿基因位点GL A09‑2，及唯一的候选功能基因Bra024697。该突变个体作为亲本材料能够显著降低亮绿性状个体筛选的工作量，对于十字花科芸薹属作物的选育具有重要的意义。

Description

一种与大白菜显性亮绿性状相关的InDel标记、引物及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与大白菜显性亮绿性状紧密连锁的InDel标记，检测该分子标记的引物序列及在农作物选育方面的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

菜心、菜薹或白菜苔都属于十字花科芸薹属中的不同亚种或变种，它们均以抽薹以后幼嫩、鲜美的花茎、花蕾及附着叶片为主要食用器官，其中占比最大的食用部分是花茎组织，它的重要商品性状之一是其表皮颜色，其中蜡质缺失的亮绿表皮最受消费者喜爱。亮绿性状是一种表皮蜡质缺陷突变体，是花茎和叶片等组织的表皮缺乏蜡质所致。快速培育具有亮绿表皮的新白菜苔或菜心品种，筛选显性基因控制的亮绿突变体具有重要的经济意义。因为白菜苔或菜心品种多为杂交种，显性基因控制的性状允许亲本之一具有该性状即可，比隐性基因控制的性状在亲本培育方面具有显著的优势。

植物表皮蜡质是一个复杂的性状，它涉及蜡质合成、运输以及对上述过程的调控，是一个复杂的多基因控制的性状。来自模式植物拟南芥的研究结果表明：参与蜡质合成代谢途径、运输和调控过程的基因多达几十个，如已知CER1、CER2、CER3、MAH1、KCR1、RST1、WSD1、KCS和CYTB5等基因参与拟南芥蜡质生物合成有关，ACBP1、ABCG11、ABCG12、LTPG1、LTPG2和GNL1等基因参与蜡质转运(Hegebarth et al.,2017)，WIN1/SHINE1、SHINE2、SHINE3、MYB30、MYB94、MYB96、CER3、DEWAX、WAR6/RDR6、HUB1等基因主要在转录水平、转录后水平或翻译水平通过调控表皮蜡质合成通路基因的表达从而间接调控蜡质含量(Aharoniet al.,2004；Chan et al.,2016)。上述研究结果表明，表皮蜡质的有无与蜡质合成、转运和调控过程相关基因的正常表达有关，是个十分复杂的过程。

十字花科蔬菜作物中表皮蜡质性状的研究才刚刚起步。大多数报道的亮绿性状呈单基因隐性遗传，如小白菜花茎和叶片(曹阳等，2008；Wang等，2017)、青梗菜(冯辉等，2010)、大白菜(Zhang等，2013)、红菜薹(李红莲，2014)、结球甘蓝“亮叶98-1030”(牟香丽2014)、甘蓝蜡质缺失突变体LD10、10Q-961和g21-3(刘东明，2014；Liu等，2017a)。少数报道显性遗传：如甘蓝突变体10Q-974的蜡质缺失性状由一对显性基因控制(Liu等2017b；2018)，另外也有少数蜡质缺失突变株受双基因控制，如甘蓝型油菜Nilla(Mo等，1995)。但上述研究均未能分离相关功能基因更谈不上开发功能性标记。

发明内容

本发明利用两个花茎组织为亮绿杆的白菜自交系为亲本，利用重组自交系群体，定位到一个显性位点控制的亮绿性状，利用生物信息学技术分离到了显性基因控制的亮绿突变基因，确定了亮绿基因位点GLA09-2，及唯一的候选功能基因Bra024697。

本发明分析了野生型和突变体的核酸序列，开发了相应的功能性检测标记，利用该标记检测重组自交系(RIL)群体中的不同株系，明确了这些株系在该位点的基因型，通过相应的分子标记对该功能基因表达情况进行检测，有利于高效的筛选具有亮绿性状的后代，应用于农作物选育工作具有良好的效果。

基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记，所述InDel标记如SEQ ID NO:4所示。

本领域公知，农作物的农艺性状大多由多基因进行控制，单基因控制的农艺性状实属可贵。对于以杂交种用作生产用种的作物而言，显性基因控制的农艺性状尤其显得珍贵。经检测，本发明筛选获得的突变体相比野生型在起始密码子上、下游发生了8处突变，成为一种由显性、单基因控制亮绿性状的个体，这作为一种亲本材料是非常难能可贵的。

本发明第二方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物，所述检测引物如下：

正向引物(SEQ ID NO:1)：CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAAT；

反向引物(SEQ ID NO:2)：CACTTCATGACAAGAACTCTCAAGA。

本发明第三方面，第一方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁的分子标记和/或第二方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物在农作物选育方面的应用。

所述选育工作包括筛选显性纯合个体作为亲本材料以获得性状稳定遗传的亲本个体，还包括通过杂交手段或基因工程手段改造其他菜薹属农作物的性状。

本发明第四方面，提供一种大白菜亮绿品种选育方法，所述选育方法包括采用第二方面所述扩增引物对亮绿性状个体DNA基因组进行检测，筛选显性纯合个体作为亲本进行育种。

因为隐性基因控制的农艺性状，在创制亲本材料时，需要同时对双亲的目标农艺性状都加以改造，才能在杂交种中或的目的性状，这无疑增加了亲本创制的难度。而对于显性基因控制的农艺性状，只需要对亲本之一加以改造便能在杂交种中获得目的农艺性状。显性单基因控制的农艺性状的优点还在于：利用回交的手段对育种材料的性状进行改良时，每回交一代只需依据表型进行选择即可、回交四代后自交一代结合功能标记辅助即可获得纯系；而如果是隐性基因控制的农艺性状，则每回交一代后要么用功能标记辅助选择杂合型单株加以保留、要么每回交都需要再自交一代才能将目的基因保留，否则很容易丢失。

以上一个或多个技术方案的有益效果如下：

所述显性亮绿突变体T065-GL系列或T032-GL系列可以作为亮绿性状的供体材料，用于对其它非亮绿型材料的花茎表皮进行改造，在菜心、菜薹、白菜苔育种中尤其有重要的用途，具有显著的经济意义。

该基因的确定可以使研究者直接依据基因序列区筛选菜心、菜薹、白菜苔育种材料中是否有相应的突变体材料，如果没有则可以T065-GL或T032-GL供体进行回交转育，上述Indel标记可以对回交最后一代的自交后代进行标记辅助选择，大大加速亮绿型菜心、菜薹、白菜苔新品种的育种效率。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中RIL150群体中花茎蜡质表皮性状精细定位图。

图2为实施例1中Bra024697编码蛋白B3-domain结构分布示意图。

图3为实施例1中InDel标记的开发电泳条带图；

其中，M:50bp ladder DNA分子量标准；W野生型扩增产物；m突变体扩增产物。

图4为实施例1中利用InDel标记对回交后代的选择电泳条带图；

其中，1-30为回交四代表型为亮绿单株的自交后代，M:50bp ladder DNA分子量标准；W野生型扩增产物；m突变体扩增产物。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提出了一种用于与大白菜亮绿性状相关的Indel分子标记、用于检测该Indel的引物及其应用。

本发明第一方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁的InDel标记，所述InDel标记如SEQ ID NO:4所示。

优选的，其所对应的野生型如SEQ ID NO:3所示。

本发明第二方面，提供一种与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物，所述检测引物如下：

正向引物(SEQ ID NO:1)：CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAAT；

反向引物(SEQ ID NO:2)：CACTTCATGACAAGAACTCTCAAGA。

优选的，所述引物用于PCR扩增。

本发明第三方面，第一方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁的分子标记和/或第二方面所述与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物在农作物选育方面的应用。

优选的，所述应用包括通过所述检测引物或分子标记筛选大白菜显性纯合亲本材料。

优选的，所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。

优选的，所述应用包括将亮绿突变体作为供体材料对其他十字花科芸薹属作物进行新品种选育。

进一步优选的，所述新品种选育包括筛选显性纯合亮绿大白菜作为亲本材料与其他芸薹属作物进行杂交。

本发明第四方面，提供一种大白菜亮绿品种选育方法，所述选育方法包括采用第二方面所述扩增引物对亮绿性状个体的基因型进行检测，筛选获得显性纯合个体作为亲本进行育种。

优选的，所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取待测亮绿性状大白菜的基因组，获得基因组溶液；

(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，通过所述检测引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)将步骤(2)得到的扩增产物经电泳、染色后，如果电泳图谱中仅显示153bp处具有条带，证明该大白菜为显性纯合；如果电泳图谱中同时具有153bp和146bp两处条带，证明该大白菜为杂合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1.大白菜花茎显性亮绿突变的发现及突变株的获得

在发明人以往的研究中，以大白菜自交系06-247(亮绿表皮)与He102(亮绿表皮)为亲本构建了一个重组自交系群体RIL150(Liu et al.,2019)，在此过程中发明人发现F2植株抽薹期花茎表皮存在亮绿/有蜡粉的性状分离，暗示着06-247与He102的亮绿表皮花茎受不同等位基因控制。在采用单粒传的方法构建重组自交系的过程中，对150个F3单株跟踪调查至F7，这一过程中发现这些株系的表皮性状变化有以下三种情况：第一种情况是大部分(75个)株系的花茎表皮蜡质性状自F3至F7的过程中，要么始终是有蜡粉表皮、要么始终是亮绿表皮，这些株系在F7代时每个株系都播种了10株进行表皮性状的纯合/杂合鉴定，发现他们的F7家系均是纯系，推测这些株系的亮绿/蜡质相关位点的基因在F2代就已经是纯合子了，其显隐性遗传难以判断；第二种情况是有部分(62个)株系其早世代(F3-F5)是有蜡质性状，高世代(F6-F7)出现了亮绿表皮性状，这些株系在F7家系同样每个株系播种了10株进行蜡质表皮纯合/杂合鉴定，发现了3个株系仍然存在有蜡/亮绿表皮的分离，10个单株中有蜡粉表皮的性状居多，推测这些株系的亮绿表皮受隐性基因控制；第三种情况是，有少部分(13个)株系早世代(F3-F5)单株是亮绿表皮性状，高世代(F6-F7)单株却出现了有蜡质表皮性状，在F7代鉴定这些株系的表皮性状是否分离时，发现有2个株系存在表皮性状的分离，10个单株中亮绿表皮居多，这两个株系分别是T032和T065，推测这两个F7家系中的亮绿表皮是显性基因控制的。

为了进一步明确显性遗传控制的亮绿表皮性状是否受单基因控制，发明人增加了T032和T065的F7家系筛选规模，由于种子量有限，T032播种了93株、T065播种了134株，抽薹期调查了花茎表皮性状。在T032的93个单株中，有67株花茎是亮绿表皮、26株花茎是有蜡粉表皮。而在T065的134个单株中，亮绿表皮和有蜡粉表皮的单株数目分别是94和40。两个株系中亮绿/有蜡粉单株的分离比基本接近3:1，符合孟德尔基因分离定律。证明显性亮绿性状受单基因控制。

为了获得纯合的亮绿表皮单株，两个株系均随机选择了3个有蜡粉表皮(W(Wax的首字母)1～W3)单株和10个亮绿表皮(GL(Glossy的前两个字母)1～GL10)单株自交授粉，收获F8代种子。每个单株的F8代种子经催芽后单粒点播，随机移栽10株至纱网棚以便在抽薹期鉴定纯合子，从T032的10个F8家系中获得了5个表皮亮绿纯系，分别是T032-GL1、4、6、8、9。从T065的10个F8家系中获得了4个表皮亮绿纯系，分别是T065-GL2、5、6、9。T032和T065在F8收获的任何一对亮绿/有蜡粉株系均分别构成一对近等基因系T032-W1/T032-GL1、T065-W1/T065-GL2分别是两对近等基因系，其中的有蜡粉(W)表皮株系是野生型、而亮绿表皮则是突变体。

2.显性亮绿基因的遗传定位及相关功能基因筛选

高密度遗传连锁图构建、RIL150各株系基因型参照Liu等(2019)的文献，RIL150(F7)群体性状调查在山东省农科院蔬菜花卉研究所核心试验基地进行。每个F7家系播种10株，纯合有蜡质记作“1”，纯合无蜡质记作“0”。杂合型记作0.5，采用ICMaping软件，对重组自交系群体的蜡粉有无性状进行QTL定位，共获得3个控制表皮蜡质性状的位点，分别是A01上一个的GL A01-1，A09上两个：GL A09-1和GL A09-2(图1)，定位信息详见表1。

根据左右边界物理位置和参考基因组信息，发现GL A01-1左右边界的两个标记均位于基因Bra 013809内部，双亲测序数据显示该基因在双亲间有三个氨基酸的替换突变，该基因与Zhang等(2013)报道的隐性遗传控制的大白菜亮绿性状是同一个基因，与拟南芥CER2同源。为了确定GL A09-1和GL A09-2的遗传特征，同样基于其左右边界标记的物理位置筛选到了相应的基因，其中GL A09-1之间有两个候选基因，分别是Bra 032918和Bra032919；而GL A09-2的两侧标记均位于基因Bra024697内部。以两对近等基因系T032-W1/T032-GL1和T065-W1/T065-GL2为试材料，提取基因组DNA分别克隆了三个候选基因，发现两对近等基因系均在Bra024697之间有序列差异，而另外两个基因在近等基因系之间没有差异。由此确定GL A09-2是显性基因控制的亮绿基因位点，Bra024697是其唯一的候选功能基因。

表1控制RIL150群体蜡质表型位点的详细信息

3.显性亮绿突变体基因及野生型基因的差异分析

为了进一步明确Bra024697基因的编码区及启动子序列的差异，将该基因起始密码上游1000bp以及其基因组序列分别从T065-W1和T065-GL2中克隆了出来并进行了比较，编码区序列则依据BRAD(http://brassicadb.org/brad/index.php)数据库中Bra024697的编码序列和本实施例中克隆的基因组序列由在线比对工具Splign(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)推导而成。

分析表明：该基因由6个外显子和5个内含子组成，编码区包含1632个碱基，编码543个氨基酸。野生型和突变体基因的差异信息详见表2。经生物信息学分析，Bra024697编码一个B3-domain转录因子，它包含4个B3-domain(B3-1～B3-4，见图2)，野生型和突变体基因的序列差异详见表2、构成这4个B3-domain的具体氨基酸位置见表3。经比较发现：野生型和突变体在启动子区有小片段插入/缺失突变，编码区有7处氨基酸替换突变，每个替换位点的氨基酸性质都有较大差异，如编码区第46个碱基由A→G的突变造成编码氨基酸由“天冬酰胺”突变成“天冬氨酸”、编码区第91个碱基T→C的突变造成编码氨基酸由“酪氨酸”突变成“组氨酸”等，有的突变氨基酸位于B3-domain的间区、有的位于B3-domain(见表3)，这些突变都可能造成蛋白的正常折叠并影响其正常功能的发挥，从而造成其调控的下游基因的表达差异，最终影响植株的表型性状。

表2突变体突变情况对照表

注：以起始密码子为0点，上游启动子序列发生突变的位置以负号(-)表示，下游编码区的突变位置以正号(+)表示。

表3突变氨基酸位点在Bra024697编码蛋白不同区域的分布

4.分子标记开发及其应用

理论上讲所有插入/缺失和单碱基突变都可以被开发成合适的检测标记，如SNP突变可以开发成基于高分辨率分型的HRM标记、KASP标记或dCAPs标记等，但这些标记的开发过程复杂、检测成本高，有些如HRM和KASP还需要专门的设备，相比较而言，启动子区域的插入/缺失突变可以开发成基于PAGE胶检测的InDel标记。InDel标记检测成本低，容易被一般实验室掌握。首先在两侧保守区设计引物，正反向引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:1：CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAAT

SEQ ID NO:2：CACTTCATGACAAGAACTCTCAAGA

以近等基因系T065-W1和T065-GL2的基因组DNA为模板，进行如下PCR反应体系的配制：2×PCR mix 10μl,10pmol/L的正反向引物各1μl、20-50μg/L模板DNA 1μl、ddH₂O 7μl，总体积20μl。PCR反应条件为94℃、5min，94℃、20sec，59℃、20sec，72℃、10sec，30次循环，最终72℃延伸5min。PCR扩增产物在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳结束后银染显色，智能手机拍照。电泳结果如图3所示。野生型中的扩增产物片段大小146bp，序列如SEQ ID NO:3所示，突变体扩增产物为153bp，序列如SEQ ID NO:4所示。

SEQ ID NO:3

CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAATACAAGTGTCATAAAAGTTATCACCTTTATGAAACTTGAGTCTACCAAAAGATTCGTAATATTATTCTCTCTGCTCAGAATATAAACATTAGTGATTTCTTGAGAGTTCTTGTCATGAAGTG

SEQ ID NO:4

CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAATACAAGTGTCATAAAAGTTATCACCTTTATGAAACTTGAGTCTACCAAAAGATTCGTAATATTATTCTCTCTGCTCACTGCTCAGAATATAAACATTAGTGATTTCTTGAGAGTTCTTGTCATGAAGTG

为了验证标记的使用效果，本实施例以具有蜡质表皮的菜心品种四九-19为受体(P1)、以T065-F8-GL9为亮绿性状的供体材料(P2)，进行回交转育(四九-19×(四九-19×T065-F8-GL9))，从回交一代至回交四代全部进行表型选择，拔出花茎表皮为蜡粉性状的单株，保留亮绿单株，无需进行标记辅助选择。至BC4进行单株或根据需要株系间可以混交，自交后代在苗期进行标记辅助选择，如图4是对30个自交后代进行检测的电泳图，根据检测结果，只保留纯合突变单株，即编号为4、9、21、29和30，移栽至条件参与后续育种试验，其它基因型单株可以直接淘汰。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种与大白菜显性亮绿性状相关的InDel标记、引物及应用

<130> 2010

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgagagattc aagaccaaga agaat 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacttcatga caagaactct caaga 25

<210> 3

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgagagattc aagaccaaga agaatacaag tgtcataaaa gttatcacct ttatgaaact 60

tgagtctacc aaaagattcg taatattatt ctctctgctc agaatataaa cattagtgat 120

ttcttgagag ttcttgtcat gaagtg 146

<210> 4

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgagagattc aagaccaaga agaatacaag tgtcataaaa gttatcacct ttatgaaact 60

tgagtctacc aaaagattcg taatattatt ctctctgctc actgctcaga atataaacat 120

tagtgatttc ttgagagttc ttgtcatgaa gtg 153

Claims (3)

1.一种与大白菜亮绿性状紧密连锁InDel标记的检测引物在大白菜亮绿品种选育方面的应用；

所述检测引物如下：

正向引物：CGAGAGATTCAAGACCAAGAAGAAT；

反向引物：CACTTCATGACAAGAACTCTCAAGA；

所述InDel标记如序列4所示及对应的野生型如序列3。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用包括将所述检测引物用于制备检测试剂盒。

3.一种大白菜亮绿品种选育方法，其特征在于，所述选育方法包括采用权利要求1所述检测引物对亮绿性状个体的基因型进行检测，筛选获得显性纯合个体作为亲本进行育种；

所述检测方法包括以下步骤：

（1）提取待测亮绿性状大白菜的基因组，获得基因组溶液；

（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，通过所述检测引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（3）将步骤（2）得到的扩增产物经电泳、染色后，如果电泳图谱中仅显示153bp处具有条带，证明该大白菜为显性纯合；如果电泳图谱中同时具有153bp和146bp两处条带，证明该大白菜为杂合。

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