CN112592999A - 一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents

一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用，所述分子标记为黄瓜基因组3号染色体上26138107bp位置处发生的T向C的突变。利用项目组收集的289份种子资源，采用全基因组关联分析(GWAS)结合QTL定位等方法，鉴定了影响黄瓜果皮光泽调控的关键变异位点，根据该变异开发分子标记。设计的1个KASP分子标记，利用该标记对分离群体中的295个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。研究结果不仅有助于果皮光泽黄瓜的早期鉴别及辅助育种，且为果皮光泽调控基因的图位克隆及解析光泽调控的分子机理提供了基础，具有广泛的推广价值。

Description

一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于黄瓜育种分子生物学领域，涉及一种与黄瓜(cucumis sativus L)果皮光泽调控基因连锁的分子标记及该分子标记在黄瓜果皮光泽鉴定和育种中的应用。
背景技术
果皮光泽度是黄瓜的重要外观商品性状，是黄瓜基础研究和育种研究的重点。Vanvliet和Meysing在1974年对黄瓜果皮表面光泽性的研究表明，无光泽(D，Dull fruitskin)基因是影响黄瓜果实灰暗性状的一个主效基因，与黄瓜对霜霉病、白粉病的抗性有一定的相关性。Pierce和Wehner对黄瓜果皮灰暗性状进行遗传分析研究，认为黄瓜果皮灰暗性状为单基因显性遗传，无光泽对有光泽单基因显性遗传。杜辉(2008)以有光泽的欧美型黄瓜和无光泽的华南型黄瓜为基本试材，研究表明黄瓜果皮无光泽性状为单基因显性遗传，并将黄瓜果皮无光泽基因(D)定位在其构建的连锁图谱的第6连锁群上，获得与其连锁距离为25.8cM的SSR标记CMCTN71。Yuan等(2008)利用重组自交系RILs构建遗传图谱，发现表面灰暗基因D、表皮小刺基因ss和未成熟果实果皮颜色一致基因u，3个形态学标记紧密连锁，位于第6连锁群。Miao等(2011)研究表明控制黄瓜果皮光亮性状的基因位于5号染色体上，获得两个侧翼标记SSR15818和SSR06003，遗传距离分别为4.8和6.7cM。董邵云等(2013)以有光泽的欧洲型黄瓜和华北型黄瓜为试材，对黄瓜光泽性状遗传分析表明，控制黄瓜果皮关泽性状的G基因，单基因显性遗传，有光泽对无光泽为显性，通过筛选分子标记将该基因定位到黄瓜第5染色体上。其研究同时发现，在F2分离群体中，有光泽黄瓜的光泽强度并不相同，有特亮、亮和稍亮的区别，是对光泽强度概念的首次报道。Yang等(2014)在前人的研究基础上，对黄瓜果实无光泽基因D定位在物理距离为244.9kb的SSR标记SSR37和SSR112之间。用新开发的2个共显性标记SSR37和SSRll2，检测72个黄瓜品种，结果表明SSR37和SSRll2这两个标记均可用于黄瓜果实光泽性状的分子标记辅助选择育种。前人对黄瓜果皮光泽研究多集中在光泽度的有无，但在果皮光泽度强弱方面的研究尚缺，因此强光泽的黄瓜材料作为一种重要的种质资源，将会深受未来育种家们及市场消费的青睐。通过开发与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将光泽调控基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与光泽调控基因连锁的分子标记，有利于光泽最适亮度黄瓜的选育，且为克隆黄瓜果皮光泽调控基因，研究光泽调控的分子机制奠定了基础。
发明内容
本发明的首要目的在于针对黄瓜果皮表面中出现的光泽度缺乏现象，提供一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用,为强光泽果皮黄瓜材料的预判、鉴定和辅助筛选，以及强光泽果皮黄瓜的育种等提供新的途径。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，为黄瓜基因组3号染色体上26138107bp位置处发生的T向C的突变。
优选地，所述的分子标记对应的基因型：T:T为具有果皮光泽的野生基因型、T:C为具有果皮光泽的野生基因型、C:C为果皮光泽的突变基因型。
优选地，针对黄瓜果皮光泽调控突变设计的引物如下：
引物名称 引物序列5’-3’
Cu_26138107F-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCAAATATAGCAAAATTTGTT
Cu_26138107F-2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCAAATATAGCAAAATTTGTC
Cu_26138107C GGCAAGAAAGTATAAGTTATCTAAGC
优选地，Cu_26138107F-1、Cu_26138107F-2两条引物5’端分别连接不同的荧光接头序列；优选地，所述荧光接头序列为LGC公司的FAM或HEX接头序列，
FAM信号：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
HEX信号：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，用于鉴定和辅助筛选果皮强光泽黄瓜。
优选地，用于果皮强光泽黄瓜突变体育种。
优选地，采用PCR反应进行检测。
优选地，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
优选地，对扩增产物进行荧光检测时，若是T:T基因型，则判定为果皮表面弱光泽的野生单株；若是纯合C:C基因型，则判定为果皮表面强光泽的突变单株；若是杂合T:C基因型，则判定为果皮表面中光泽的野生单株。
优选地，采用Touchdown PCR；
Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
相对于现有技术，本发明所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记及应用具有以下优势：
本发明利用GWAS结合BSA定位的方法，定位到一个控制黄瓜果皮光泽调控的位点，并依据该突变位点，开发了与该黄瓜果皮光泽调控基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于黄瓜果皮光泽度和相对应的基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。可以用于各种品种的黄瓜鉴定，因此，本发明在研究黄瓜果皮光泽度的形成机制和理论研究上具有重大的意义。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为黄瓜果皮光泽度基因组关联分析Manhattan图；
图2为BSA群体定位的2个亲本，A：弱光泽果皮亲本G35；B：强光泽果皮亲本Q51；
图3为G35与Q51构建群体的BSA定位结果；果皮光泽调控基因位于黄瓜第3号染色体上8010000到2625000之间；
图4为本发明的Cu_26138107分子标记在G35与Q51构建的F2群体中进行基因分型的部分结果，
A处表示：PCR产物为引物Cu_26138107对应的荧光信号，为果皮表面具有弱光泽度的纯合单株；
B处表示：PCR产物为引物Cu_26138107对应的荧光信号，为果皮表面具有强光泽度的纯合单株；
C处表示：PCR产物具有引物Cu_26138107两种荧光信号，为果皮表面具有中光泽度的杂合单株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的黄瓜种质均由天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所提供，也可保证对外出售至少20年。
实施例1黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的获得
一、GWAS分析方法
1.全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)基因总体关联分析的方法，该方法以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因(位点)间连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)为基础，将目标性状表型的多样性与基因(或标记位点)的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。对289份黄瓜种质进行深度重测序，平均测序深度为15X，共获得2,352,638个SNP位点，经过条件为dp7(个体深度7)、Miss0.2(个体缺失率)、maf0.05(最小等位基因频率0.05)过滤后，最后共获得399,352个高质量的SNP，构建一套全面的高密度黄瓜变异组图谱，为黄瓜遗传育种研究提供了丰富的遗传标记。对289个自然群体光泽度进行分级分析，比较所有SNP位点的等位基因在光泽度高和光泽度低之间的差异；找到66个SNP位点的在光泽度高的个体组中出现的频率明显高于光泽度低的个体，关联到3号染色体25912655-26963590区间与光泽度相关联，如图1,曼哈顿图为遗传标记效应值即经F检验的全基因组P值按染色体上物理位置，P值越小关联性越强，分析发现最小P值在26046923-26146923位置，即最关联的SNP区域为26046923-26146923。
二、BSA定位方法
1.群体的构建
利用经过多代自交选育出的弱光泽黄瓜亲本‘G35’(图2A所示)，及稳定遗传的高代自交系强光泽果皮材料‘Q51’为亲本(图2B所示)，将弱光泽亲本与强光泽果皮亲本进行杂交得到F1代，F1代自交后获得F2群体。
2.光泽调控基因初定位
在G35×Q51的F2群体中选取25个有果皮具有弱光泽度的野生植株叶片和25个果皮具有强光泽度的突变植株叶片，分别构建两个DNA池并进行混池测序，共产生32Gb的序列数据。通过bwa软件将reads比对到黄瓜参考基因组上，使用bcftools软件寻找全基因组的SNP位点。过滤掉QUAL值(碱基质量值)小于30，MQ质最值小于30，DP值小于2的位点，因为这些SNPs可能是由基因组的重复序列或者测序造成的失误或比对失误造成的假SNP，这些SNPs都是不可信的。然后筛选出子代与双亲纯合且差异的SNP位点，并计算出显性池与隐性池的SNP-index值。将隐性池与显性池的SNP-index值相减，得到△SNP-index值。以物理距离1M为窗口，10Kb为步长进行滑窗分析，得到每一窗口内的△SNP-index均值。经过计算机模拟实验，我们得到了每一测序深度对应的预值，将预值与每一SNP位点逐一匹配以后，也进行同样的滑窗分析，将△SNP-index均值与预值分别作图，观察△SNPindex值分布，我们发现在三号染色体上有个明显高于预值线的峰，90％置信的区间是8010000-2625000。
三、光泽调控基因标记开发
通过步骤GWAS和BSA的分析获得控制色泽调控的染色体交集的区域，区域为26046923-26146923：根据区间的变异信息，开发了10个标记，发现26138107位置的KASP标记基因分型最吻合。利用Cu_26138107标记对G35与Q51构建的F2群体280个单株进行基因分型。出现了3种荧光信号，其中T:T的荧光信号有83个单株，T:C的荧光信号有139个单株，C:C的荧光信号有58个单株。结合表型调查数据发现基因型与果皮光泽度表型高度一致，见表1。以上结果充分说明，Cu_26138107标记具有通用性和准确性，可以应用于黄瓜果皮强光泽植株的预测、鉴定和筛选。
分子标记应用时，具体包括以下步骤：(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物；(2)对扩增产物进行检测与分析。
引物名称 引物序列5’-3’
Cu_26138107F-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCAAATATAGCAAAATTTGTT
Cu_26138107F-2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCAAATATAGCAAAATTTGTC
Cu_26138107C：GGCAAGAAAGTATAAGTTATCTAAGC
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到引物Cu_26138107F-1对应的荧光信号，则检测位点为T:T基因型，判定为黄瓜果皮具有弱光泽度表型单株；如果样品PCR产物只检测到引物Cu_26138107F-2对应的荧光信号，则检测位点为C:C基因型，判定为黄瓜果皮强光泽度表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为T:C基因型，判定为黄瓜果皮具有中光泽度表型的单株。
分子标记应用时，采用Touchdown PCR，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
待测样本为叶片。
表1 Cu_26138107标记在G35与Q51构建的F2群体中部分单株果皮光泽度类型及基因型
Figure BDA0002858259650000071
Figure BDA0002858259650000081
Figure BDA0002858259650000091
Figure BDA0002858259650000101
Figure BDA0002858259650000111
Figure BDA0002858259650000121
Figure BDA0002858259650000131
Figure BDA0002858259650000141
上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物Cu_26138107对应的C:C荧光信号的材料，就能够选育出黄瓜果皮强光泽度的材料。保留检测到引物Cu_26138107对应的T:T荧光信号的材料，就能够选育出果皮具有弱光泽度的纯合材料。保留检测到T:C荧光信号的材料，就能够选育出果皮具有中光泽度的杂合材料，通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，其特征在于：为黄瓜基因组3号染色体上26138107bp位置处发生的T向C的突变。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，其特征在于：所述的分子标记对应的基因型：T:T为具有果皮光泽的野生基因型、T:C为具有果皮光泽的野生基因型、C:C为果皮光泽的突变基因型。
3.根据权利要求2所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，其特征在于：针对黄瓜果皮光泽调控突变设计的引物如下：
引物名称 引物序列5’-3’
Cu_26138107F-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGCAAATATAGCAAAATTTGTT
Cu_26138107F-2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGCAAATATAGCAAAATTTGTC
Cu_26138107C GGCAAGAAAGTATAAGTTATCTAAGC。
4.根据权利要求3所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记，其特征在于：Cu_26138107F-1、Cu_26138107F-2两条引物5’端分别连接不同的荧光接头序列；
优选：
FAM信号：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；
HEX信号：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
5.权利要求1-4任一项所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：用于鉴定和辅助筛选果皮强光泽黄瓜。
6.根据权利要求5所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：用于果皮强光泽黄瓜突变体育种。
7.根据权利要求5所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：采用PCR反应进行检测。
8.根据权利要求7所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdown PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
9.根据权利要求8所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：对扩增产物进行荧光检测时，若是T:T基因型，则判定为果皮表面弱光泽的野生单株；若是纯合C:C基因型，则判定为果皮表面强光泽的突变单株；若是杂合T:C基因型，则判定为果皮表面中光泽的野生单株。
10.根据权利要求8所述的与黄瓜果皮光泽调控基因连锁的分子标记的应用，其特征在于：采用Touchdown PCR；
Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
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