CN110468220A - 一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记,属于分子标记与遗传育种领域。所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第17号染色体第1735865位,且该处碱基是G或C。本发明还提供了用于检测上述SNP标记的引物组合及其应用。利用该SNP分子标记和引物组合,可建立鸡绿壳蛋暗斑高效准确的分子标记辅助育种方法,从而有效地对暗斑进行针对性选择,获得较好的遗传进展。进而有效地改善绿壳蛋暗斑的选育方法,促进地方特色蛋鸡产业的发展。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域,具体涉及一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
随着我国经济的迅速发展,人们消费水平的提高,对地方特色蛋鸡的需求越来越高,我国地方特色蛋鸡的年饲养量已超过2亿只,占蛋鸡总量的10%。地方特色蛋鸡市场份额提高的同时,人们对蛋品质的要求越来越高。市场上暗斑严重的鸡蛋影响了消费者的选择,使消费者购买欲望低,严重影响了养殖效益。
蛋壳暗斑最早由Holst等于1932年提出,国内学者称为薄斑或底斑,主要是由蛋壳厚度不均匀而出现的一种现象,影响鸡蛋的外观。在蛋壳上表现有条状、片状、带状、点状等,直径也从针尖大小至几厘米,肉眼下可见几个至成百上千个。不同品种表现的暗斑不同,褐壳蛋的暗斑很少,而绿壳蛋暗斑相对较多。受我国消费市场对绿壳蛋的需求影响,蛋鸡育种者有必要对绿壳蛋的暗斑性状进行选择。
暗斑的选择首先要确定暗斑的评定方案,目前对暗斑的度量多采用四级评分系统,然该方法易受不同人的判断影响结果。生产中无论从表观测定还是分子标记均无对蛋壳暗斑的有效选择方法。
随着分子生物学技术的发展,分子标记辅助选择方法(marker assistedselection,MAS)被越来越多地应用于育种环节中加快了遗传进展。诸多研究表明,蛋壳暗斑可遗传给后代,若进行稳定选择则会获得良好进展。而利用分子标记技术将会对该性状进行准确选择。
发明内容
为了解决生产中鸡绿壳蛋暗斑性状选育方法的空白,发明人进行了大量研究,意外地发现国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第17号染色体上物理位置第1735865核苷酸处的G>C突变与鸡绿壳蛋暗斑相关,从而完成本发明。
本发明第一方面提供一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记,所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第17号染色体第1735865位,且该处碱基是G或C。所述的SNP标记在国际鸡参考基因组上的名称为rs312873273。
本发明第二方面提供一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,且其第39位碱基是G或C。
本发明第三方面提供检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定鸡绿壳蛋暗斑性状的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
在本发明的一些实施方案中,所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。
本发明的第四方面提供一种用于鉴定鸡绿壳蛋暗斑性状的试剂盒,包括能够检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂。
在本发明的一些实施方案中,所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。
在本发明的一些实施方案中,所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。
本发明的第五方面提供一种选育产低暗斑指数绿壳蛋的鸡种或品系的方法,包括以下步骤:
(1)获取产绿壳蛋的待测鸡的基因组DNA;
(2)检测所述基因组DNA中本发明第一方面或第二方面所述SNP分子标记的基因型,
选择GC和CC基因型的鸡,淘汰GG基因型鸡。
在本发明的一些实施方案中,步骤(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。
在本发明的一些具体实施方案中,所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。
在本发明中,所述暗斑指数是指本领域通常所述的暗斑评级数(王德贺.鸡蛋暗斑形成机理探索研究.中国农业大学.2017),级别数即为暗斑指数。
在本发明中,GC和CC基因型的暗斑指数较低,GG基因型的暗斑指数较高。
在本发明的一些实施方案中,所述低暗斑指数或暗斑指数低是指暗斑指数小于参考值,所述高暗斑指数或暗斑指数高是指暗斑指数大于参考值。在本发明的一些优选实施方案中,所述参考值是指选育产绿壳蛋鸡种或品系大量样本暗斑指数的平均值或中位值,在本发明的一些更优选实施方案中,所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中,所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施方案中,所述大量样本是指1075只。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术具有如下的优势和效果:
(1)利用本发明的与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记进行分子标记辅助选择,能够有效地使鸡绿壳蛋暗斑程度降低。
(2)本发明同时提供了该SNP分子标记的序列以及鉴定的引物,通过该分子标记和引物,可利用Sanger测序法建立快速高效准确的分子标记辅助育种技术,使鸡绿壳蛋暗斑程度降低,可在早期进行选育,降低饲养成本,提高生产效益。
(3)本发明提供的SNP分子标记对绿壳蛋在产蛋当天和储存7天暗斑的表型贡献率在3.39%和15.94%,利用该SNP分子标记可有效降低绿壳蛋壳暗斑,达到快速选育目的。
附图说明
图1示出了由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体关于绿壳蛋暗斑双变量的全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)曼哈顿图;其中横坐标代表鸡的染色体编号;纵坐标代表-logP值,黑色水平线代表以8.43×10-7为显著性表达水平阈值。
图2示出了不同基因型的绿壳蛋在产蛋当天和储存7天的暗斑值。
图3示出了不同基因型的Sanger测序峰图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白,下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术,因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白,这里所公开的特定实施例可以做很多修改,仍然能得到相同的或者类似的结果,而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义,所有在此使用的技术和科学的术语,和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同,在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备,如无特殊说明,均为实验室常规仪器设备;下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为常规生化试剂商店可购买到的。
下述实施例1中,利用由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡其中1075只产绿壳蛋的个体,采用4级评分系统进行评定。主要分为1级(几乎没有暗斑)、2级(暗斑数量少)、3级(暗斑数量多、直径较大)、4级(暗斑数量多、直径大)(王德贺.鸡蛋暗斑的形成机理探索研究.中国农业大学;2017.),评定数值即为暗斑指数,数值越高,即暗斑指数越高,暗斑越严重。试验在江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地进行,所有母鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。
实施例1全基因组关联分析
(1)采集F2代群体母鸡翅静脉血,利用标准的酚-氯仿法进行基因组DNA提取。通过标准的程序进行DNA质量检测、浓度测定等,最终选择以OD260/280比值在1.8-2.0之间为合格以备后续试验。统一将浓度稀释为50ng/μl用于基因分型。
(2)利用Affymetrix公司的鸡600K高密度基因芯片进行基因分型,参照芯片说明书进行基因分型和质量控制,主要包括:利用APT v1.16.0进行分型前的质量控制;PLINK v1.90进行质量控制,剔除call rate小于0.97,偏离哈代温伯格平衡≤10-6的SNP标记;BEAGLE v4.0选择R2>0.5的SNPs进行填充。质控剩余了435867个SNPs和1075个样本用于后续分析。
(3)全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)方法:进行GWAS分析之前为了消除假阳性,计算多维度主成分分析,以前5个主成分作为协变量加入到模型中。利用R脚本“simpleM”方法计算各SNPs位点独立检验估计,得到了59308个indepSNPs。利用Bonferroni进行校正,得到基因组显著水平为8.43×10-7。利用GEMMA v0.94软件中双变量混合线性模型对产蛋当天和7天的暗斑值进行GWAS分析,模型为:其中Y*代表n个样本d个表型值的矩阵;w代表协方差矩阵(在本实施例中代表前5个主成分);α*代表对应系数包括截距的向量;X标记的基因型的n个样本的向量;β*代表标记的替代效应;z代表的随机效应相关矩阵,zd代表第d个性状的随机效应关联矩阵;μ*代表随机效应;ε*代表误差效应;I代表单位矩阵。
GWAS分析的结果如图1所示,最显著的SNP分子标记为位于17号染色体的rs312873273,P=1.09×10-7。
(4)不同基因型的绿壳蛋暗斑指数由图2所示,GC和CC基因型的表现为暗斑指数更低,其中,GC基因型暗斑指数最低。而GG基因型暗斑指数较大。因此在继代选育过程中选留GC和CC基因型的个体,淘汰GG型的个体。
实施例2绿壳蛋暗斑指数的等位基因检测方法的建立
(1)对与绿壳蛋暗斑显著相关的SNP标记位点的目的片段引物扩增5号染色体上一段171bp的核苷酸片段,序列扩增的上下游引物为:
上游引物greenM-F:CCCTGCCATTTCACTCCCTA(SEQ ID NO.1)
下游引物greenM-R:TCTCATCCCAGTCACTGCAC(SEQ ID NO.2)
(2)PCR扩增:
本实施例中试剂由南京诺维赞公司获得,引物合成及测序由上海生工公司完成。
以获取的L3品系鸡基因组DNA为模板,使用引物greenM-F和greenM-R进行PCR扩增。
扩增体系如下:
PCR反应程序如下:
(3)序列测序与鉴定
PCR扩增的产物greenM_SEQ在上海生工公司进行Sanger测序,基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组GRCg6a Primary Assembly进行比对,得出对应的SNP标记位点突变。
PCR扩增产物greenM_SEQ如下所示(SEQ ID NO.3):
CCCTGCCATTTCACTCCCTATAAATACCCTATGAACACS[C/G]AGCTGTGCAGGTGGCAATGCCCAGCCTGGCAGCACCAACATGAACCACACGTGTGCTTAGTGCCCAGTTCTCAGCCATCTGAGCTCACAAAGGGAAGCTCCGTGTGGATTGGGTGCAGTGACTGGGATGAGA
注:序列中标注的S为突变位点,用加粗并标有下划线显示(括号中为突变碱基,为等位基因突变),序列的首尾加粗显示为引物序列。
(4)测序峰图如图3所示,继代选育过程中选留GC和CC基因型的个体,淘汰GG基因型个体。
实施例3分子标记SNP rs312873273G>C突变的效应分析
本发明提供的一个改善鸡绿壳蛋暗斑的SNP分子标记,对52周龄产蛋当天和7天蛋壳暗斑值表型贡献SNP效应分别为3.39%和15.94%。利用所述SNP标记进行分子标记进行辅助选择,能够显著降低绿壳蛋的暗斑指数,加快地方特色蛋鸡的蛋壳选育进程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记及其应用
<130> XY-2019-1-W-075
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctgccatt tcactcccta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctcatccca gtcactgcac 20
<210> 3
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccctgccatt tcactcccta taaataccct atgaacacsa gctgtgcagg tggcaatgcc 60
cagcctggca gcaccaacat gaaccacacg tgtgcttagt gcccagttct cagccatctg 120
agctcacaaa gggaagctcc gtgtggattg ggtgcagtga ctgggatgag a 171
Claims (10)
1.一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第17号染色体第1735865位,且该处碱基是G或C。
2.一种与鸡绿壳蛋暗斑相关的SNP分子标记,其特征在于,所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示,且其第39位碱基是G或C。
3.检测权利要求1-2任一所述的SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定鸡绿壳蛋暗斑性状的试剂盒中的应用。
4.一种用于鉴定鸡绿壳蛋暗斑性状的试剂盒,其特征在于,包括能够检测权利要求1-2任一所述的SNP分子标记的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述引物组合由具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物组成。
7.一种选育产低暗斑指数绿壳蛋鸡种或品系的方法,其特征在于,包括以下步骤:
获取待测个体的基因组DNA;
检测所述基因组DNA中权利要求1-2任一所述SNP分子标记的基因型,
选择GC和CC基因型个体,淘汰GG基因型个体。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述引物组合由具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的下游引物组成。
10.根据权利要求7-9任一所述的方法,其特征在于,所述低暗斑指数是指暗斑指数小于参考值。
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