CN101210270A

CN101210270A - 病毒病原高通量快速排查检测方法

Info

Publication number: CN101210270A
Application number: CNA2006101053976A
Authority: CN
Inventors: 李铮; 陈超; 高金拽; 王小强; 祁会彩; 黄鹤
Original assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd
Current assignee: SHAANXI BEIMEI GENE CO Ltd; Shaanxi Lifegen Co Ltd
Priority date: 2006-12-31
Filing date: 2006-12-31
Publication date: 2008-07-02

Abstract

一种病毒病原高通量快速排查检测方法，其步骤是：(1)探针设计、芯片点制得寡核苷酸芯片；(2)引物设计合成，得到与待检测病原对应的引物；(3)生成单链DNA产物：用与待检测病原对应的引物对待测样本进行同步不对称PCR扩增，生成与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA产物；(4)在单链DNA产物上标记荧光物质，形成标记上荧光物质的单链DNA产物；(5)将标记上荧光物质的单链DNA产物与寡核苷酸芯片杂交，清洗芯片；(6)用荧光扫描仪扫描，得病毒检测分析结果。本发明解决了背景技术中猪疫病病毒检测方法费时、费力，敏感性及特异性较低，检测结果不准确的技术问题。本发明可对多种基因进行快速、准确、高效的检测。

Description

病毒病原高通量快速排查检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒病原的排查检测方法，具体涉及一种猪疫病病毒的高通量快速排查检测方法。

背景技术

寡核苷酸芯片(Oligonucleotide Microarrays)，是将事先设计并合成好的十几至几十个碱基的寡核苷酸探针通过点样仪有规律地排列固定于支持物上，然后与荧光标记的靶序列按碱基配对原理在一定条件下杂交，经洗涤后通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机进行数据比较和分析，一次试验就可对多种基因进行快速、准确、高效的检测。

猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)是引发猪患病的常见病原，且常呈混合感染出现。猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒是危害猪呼吸系统、神经系统、生殖系统常见的四类高发性病毒性病疫原。目前，现有技术中对这几种类型病毒的分析检测多采用病原分离和常规的免疫血清学检测以及聚合酶链式反应(PCR)法。病原分离不仅费时、操作复杂。免疫血清学检测法，虽然操作较为简单，但主要是敏感性及特异性相对较低。现有PCR分析检测的方法：先根据待检测病毒设计引物，对待测样本进行扩增，然后进行检测。由于是采用电泳的方法直接进行检测，因此每次只能检测一种病原，多种病原需要进行多次检测，费时、操作复杂，特异性相对较低，假阳性率较高。

现有技术中样本处理采用直接标记的方法，标记效率低，导致检测灵敏度低。步骤是：(1)引物的设计合成：先设计引物，然后合成引物，同时标记上荧光物质，形成标记有荧光物质的引物。(2)生成单链DNA产物：扩增产物，形成带有荧光物质单链DNA产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病原高通量快速排查检测方法，其解决了背景技术中猪疫病病毒检测方法费时、费力，敏感性及特异性较低，检测结果不准确的技术问题。

本发明的技术解决方案是：

一种病毒病原高通量快速排查检测方法，其特殊之处在于，该方法的实现步骤包括：

(1)制备芯片：探针设计，芯片点制，得寡核苷酸芯片；

(2)待测样本处理：

(2.1)引物的设计合成：得到与待检测病原对应的引物；

(2.2)生成单链DNA产物：用与待检测病原对应的引物对待测样本进行同步不对称PCR扩增，生成与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA产物；

(2.3)标记荧光物质：在单链DNA产物上标记荧光物质，形成际记上荧光物质的单链DNA产物；

(3)杂交：将标记上荧光物质的单链DNA产物与寡核苷酸芯片杂交，清洗芯片；

(4)检测分析：用荧光扫描仪扫描，得到病毒检测分析结果。

上述制备芯片的步骤可包括：

(1)探针的设计：根据病毒基因组保守序列设计特异性强的寡核苷酸探针；

(2)芯片点制：先进行片基表面修饰处理，然后将探针按照设计的阵列固定在片基上，制备成寡核苷酸芯片，进行芯片点样后处理，得寡核苷酸芯片。

上述标记荧光物质的步骤可以是：

(1)单链样本的间接荧光标记：通过不对称PCR掺入的氨基烯丙基和荧光分子cy3或cy5上的琥珀酰亚胺基团进行连接，使不对称PCR单链产物连接上荧光标记分子；

(2)标记产物的纯化：将荧光标记产物用Amersham G-25柱进行纯化，除去未标记的游离荧光分子，得纯化后的荧光标记的样本，置于-20℃避光保存，备杂交用。

上述荧光扫描仪以采用GenePix 4000B扫描仪为宜。

上述引物设计合成中引物的选出方案可以是：引物长度15-30个碱基，引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55％，引物自身不形成二级结构，引物之间无互补序列，引物序列是被检病毒特异的，引物3′端碱基与模板DNA配对，引物3′末端碱基以选T、C或者G。

上述探针设计方案可以是：Tm值为85℃±5℃，GC含量为50％-60％，重复的单一碱基连续≤6个，探针分子的二级结构配对碱基长度≤6bp，合成后的引物和寡核苷酸探针用灭菌水溶解，引物终浓度为20pmol/μl，探针终浓度为25pmol/μl；或合成后的寡核苷酸探针用无菌水溶解至浓度为50μM/L，同2×spotting buffer 1∶1混合使其点样终浓度调整为25μM/L。

上述单链样本的间接荧光标记的步骤可以是：取分装干燥的cy染料，加5μl的DMSO室温避光孵育1小时；用30μl 0.1M PH9.3 Na₂CO₃充分溶解纯化后的不对称PCRss-DNA，然后立即转移至孵育好的cy荧光染料中，吹吸混匀，室温避光反应1小时，每隔10分钟温和震荡1分钟；加入10μl 4M羟胺，使羟胺终浓度为1M，室温静置15分钟。

上述将标记上荧光物质的单链DNA产物与寡核苷酸芯片杂交的步骤可以是：将荧光标记的样本与1×以1∶9的体积比混合，95℃变性3分钟，使二级茎环结构解链；取混合样品至芯片表面，置于杂交盒内60℃杂交；所述的杂交液为50％甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS以及1％鲑鱼精DNA。

上述制备芯片包括片基处理，步骤可以是：用APTES溶液对Gold seal硅烷化玻片进行处理，离心甩干，经扫描后，选取背景均一且背景值较低的氨基化片基，室温干燥，保存以备用。

上述芯片清洗的步骤可以是：取出芯片，立即浸入清洗液I中清洗2次，每次10分钟；再转入4℃保存的清洗液II中清洗10分钟，最后常温下将芯片离心甩干。清洗液I可采用6×SSC以及Triton-X102，清洗液II可采用0.1×SSC以及Triton-X102。

本发明具有以下优点：

1.本发明应用寡核苷酸(Oligo)芯片，可对多种猪疫病病毒进行并行化的高通量、快速排查检测。

2.操作简便，省时

3.敏感性及特异性高，检测结果稳定，准确性好。

4.由于可对多种基因进行快速、准确、高效的检测，实用性强。

附图说明

图1为本发明实施例芯片设计示意图。

图2为本发明实施例芯片阵列设计示意图。

图3为本发明引物特异性验证结果图。

图4为本发明不对称PCR反应扩增产物的PAGE胶验证结果图。

图5为本发明引物特异性跑胶验证结果图。

图6为本发明芯片扫描结果图。

具体实施方式

本发明采用的病毒病原高通量快速排查检测方法，实现步骤如下：

1.制备芯片：

本发明制备芯片中的探针设计及芯片点制均可采用公知技术。

(1.1)探针的设计：根据病毒基因组保守序列设计特异性强的60bp寡核苷酸探针。

(1.2)芯片点制：先进行片基表面修饰处理，然后将探针按照设计的阵列固定在片基上，制备成寡核苷酸芯片，进行芯片点样后处理，即得寡核苷酸芯片。

2.待测样本处理：

本发明样本处理采用间接标记的方法，标记效率高，使检测灵敏度提高，而且成本低。

(2.1)引物的设计合成：得到与待检测病原对应的引物。

(2.2)生成单链DNA产物：用与待检测病原对应的引物对待测样本进行同步不对称PCR扩增，生成大量可与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA产物。

(2.3)标记荧光物质：在单链DNA产物上标记荧光物质，形成标记上荧光物质的单链DNA产物。

(2.3.1)单链样本的间接荧光标记：通过不对称PCR掺入的氨基化脱氧尿嘧啶核苷酸(aa-dUTP)和荧光物质cy3或cy5上的琥珀酰亚胺基团进行连接，使不对称PCR单链产物连接上荧光标记分子。具体方法：取分装干燥的cy染料，加5μl的DMSO室温避光孵育1小时；用25μl 0.1M Na₂CO₃(PH9.3)充分溶解纯化后的不对称PCRss-DNA，然后立即转移至孵育好的cy荧光染料中，吹吸混匀，室温避光反应1小时，每隔10分钟温和震荡1分钟；加入10μl 4M羟胺，使羟胺终浓度为1M，室温静置15分钟。

(2.3.2)标记产物的纯化：将上述荧光标记产物用Amersham G-25柱进行纯化，除去未标记的游离荧光分子，得纯化后的荧光标记的样本，置于-20℃避光保存，备杂交用。

3.杂交：

将标记上荧光物质的单链DNA产物与寡核苷酸芯片进行杂交，清洗芯片。具体方法如下：

(3.1)杂交：将荧光标记的样本与1×以1∶9的体积比混合，95℃变性3min，使可能存在的二级茎环结构解链。取混合样品至芯片表面，置于杂交盒内60℃杂交。杂交液可采用：50％甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS以及1％鲑鱼精DNA。

(3.2)芯片清洗：取出芯片，立即浸入清洗液I中清洗2次，每次10分钟；再转入4℃保存的清洗液II中清洗10分钟，最后常温下将芯片离心甩干。清洗液I可采用6×SSC以及Triton-X102，清洗液II可采用0.1×SSC以及Triton-X102。

4.检测分析：

用GenePix 4000B荧光扫描仪扫描，分析芯片荧光信号，则得到猪病毒检测结果。目前，Genepix 4000B荧光扫描仪带有Genepix pro 3.0微阵列分析软件，芯片扫描完成，即可得到芯片荧光信号检测分析结果。

实施例实现步骤如下：

(1)引物的设计方案：引物长度一般以15-30个碱基为宜。正向、反向两条引物链之间的距离应适中。因为片断过短会影响结果判定，过长则扩增特异性降低。引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55％为宜。引物自身不形成二级结构，引物之间没有互补序列。引物序列必须是被检病毒特异的。引物3′端碱基与模板DNA要配对，引物3′末端碱基以选T、C或者G为宜，一般不选A。

(2)探针的设计方案：Tm值在85℃左右，上下波动范围为5℃。GC含量为50％-60％。重复的单一碱基连续不超过6个。探针分子最稳定的二级结构配对碱基长度少于6bp。猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)探针，合成后的引物和探针用灭菌水溶解，引物终浓度为20pmol/μl，探针终浓度为25pmol/μl。猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症这四种病毒的探针，均未经任何修饰，质量等级为PAGE级。合成好的寡核苷酸探针用无菌水溶解至浓度为50μM/L，同2×spotting buffer1∶1混合使其点样终浓度调整为25μM/L。猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症这四种病毒的引物序列位置、序列及特点如下表所述：

表1

表2

猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症寡核苷酸探针编号、序列组成及其特点如下表所述：

表3

表4

(3)制备芯片：

片基处理：用APTES溶液对Gold seal硅烷化玻片进行处理，离心甩干，经扫描后，选取背景均一且背景值较低的氨基化片基，室温干燥，保存以备用。具体可参照氨基化芯片片基制备的标准化操作方案。

猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)芯片设计为6×4的阵列，见图1，每个探针横向重复打印2个点。阵列中的PC位点为荧光标记探针，起标示位置的作用，B位点为空白对照点样缓冲液，SC1和SC2为病毒检测的阳性外对照，起监视体系的作用，其中SC1为DNA病毒的阳性外对照探针，SC2为RNA病毒的阳性外对照探针，V1-V3分别代表所检测的病毒基因，其中深色位点表示正链的寡核苷酸探针，浅色位点表示负链的寡核苷酸探针，正、负链探针可互为阴性、阳性对照。

猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症这四种病毒共设计8条60mer Oligo阳性和阴性检测探针以及阳性质控、阴性指控探针各1条，另外加上空白对照，将芯片设计成6×6的阵列。阵列设计方案见图2。

(4)单链DNA片段的制备：

普通PCR扩增的反应体系为25μl，含有5μl 10×PCR buffer，2μl 2.5mmol/LdNTP，2μl模板，20μmol/L的上、下游引物各0.625μl，0.5μlTaqDNA聚合酶(3M/μl)，加ddH₂O至终体积25μl。PCR反应条件：95℃5分钟；95℃30秒，51℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃5分钟。收集PCR产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳观察结果。经普通PCR实验验证，所设计引物的特异性良好，引物特异性验证结果见图3。其中，M泳道表示DNA Marker DL2000，1、2泳道表示PPV的NS基因片段，3、4泳道表示PPV的VP基因片段。从电泳结果可知扩增产物大小正确，无非特异性条带，所用的种特异性引物间没有交叉扩增的现象，证实了这些引物的特异性良好。

(5)验证不对称PCR单链产物

经过对上述引物特异性验证后，通过不对称PCR方法来制备ss-DNA，在不对称PCR体系中掺入aa-dUTP，以备下一步进行间接荧光标记。25μl不对称PCR反应体系为：Virus模板2μl、10×reaction buffer 2.5μl、MgCl2 solution 2.5μl、dNTP每种浓度为：2.5mM(dATP 0.5μl、dGTP 0.5μl、dCTP 0.5μl、dTTP 0.3μl、aa-dUTP 0.2μl，其中，dTTP和aa-dUTP的比例固定为3∶2)、Primer：P_上/P_下(20μM)0.625μl、P_下/P_上(0.2μM)0.625μl比例为100∶1、Tag DNA polymerse(3M/L)0.5μl、无菌水补至25μl。不对称PCR反应条件同每种病毒各自扩增条件，不同的是循环数增加至40个循环。图4为不对称PCR扩增结果。其中，M泳道表示DNA Marker DL2000；1泳道表示上下游引物摩尔比为100∶1的不对称PCR产物；2泳道表示上下游引物摩尔比为50∶1的不对称PCR产物；3泳道表示普通PCR产物。经12％聚丙烯凝胶电泳分离后，不对称PCR产物中出现2条分子量较接近的条带，双链DNA产物与同时电泳的普通PCR产物分子量大小一致，略有滞后的条带是单链扩增产物，即单链DNA产物。

图5为引物特异性跑胶验证结果图。其中，M泳道表示DNA Marker DL2000，1、2泳道表示PPV NS1基因片断，3、4泳道表示PPV VP2基因片断。

图6为样品与芯片杂交后用Genepix4000B扫描仪扫描的结果图。从杂交结果可看出所有病毒基因的阳性寡核苷酸探针都能特异性地与相应样品杂交，能检测到较强的荧光信号，而空白对照和阴性对照基本不能检测到荧光信号。

Claims

1.一种病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，该方法的实现步骤包括：

(1)制备芯片：探针设计，芯片点制，得寡核苷酸芯片；

(2)待测样本处理：

(2.1)引物的设计合成：得到与待检测病原对应的引物；

(2.3)标记荧光物质：在单链DNA产物上标记荧光物质，形成标记上荧光物质的单链DNA产物；

(4)检测分析：用荧光扫描仪扫描，得到病毒检测分析结果。

2.根据权利要求1所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述制备芯片的步骤包括：

3.根据权利要求1或2所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述标记荧光物质的步骤是：

4.根据权利要求3所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述的荧光扫描仪为GenePix 4000B扫描仪。

5.根据权利要求4所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述的引物设计合成中引物的选出方案是：引物长度15-30个碱基，引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55％，引物自身不形成二级结构，引物之间无互补序列，引物序列是被检病毒特异的，引物3′端碱基与模板DNA配对，引物3′末端碱基以选T、C或者G。

6.根据权利要求5所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述的探针设计方案是：Tm值为85℃±5℃，GC含量为50％-60％，重复的单一碱基连续≤6个，探针分子的二级结构配对碱基长度≤6bp，合成后的引物和寡核苷酸探针用灭菌水溶解，引物终浓度为20pmol/μl，探针终浓度为25pmol/μl；或合成后的寡核苷酸探针用无菌水溶解至浓度为50μM/L，同2×spotting buffer 1∶1混合使其点样终浓度调整为25μM/L。

7.根据权利要求6所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述单链样本的间接荧光标记的步骤是：取分装干燥的cy染料，加5μl的DMSO室温避光孵育1小时；用30μl 0.1M PH 9.3Na₂CO₃充分溶解纯化后的不对称PCR ss-DNA，然后立即转移至孵育好的cy荧光染料中，吹吸混匀，室温避光反应1小时，每隔10分钟温和震荡1分钟；加入10μl 4M羟胺，使羟胺终浓度为1M，室温静置15分钟。

8.根据权利要求6所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述的将标记上荧光物质的单链DNA产物与寡核苷酸芯片杂交的步骤是：将荧光标记的样本与1×以1∶9的体积比混合，95℃变性3分钟，使二级茎环结构解链；取混合样品至芯片表面，置于杂交盒内60℃杂交；所述的杂交液为50％甲酰胺、5×SSC、0.1％SDS以及1％鲑鱼精DNA。

9.根据权利要求8所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述的制备芯片包括片基处理，步骤是：用APTES溶液对Gold seal硅烷化玻片进行处理，离心甩干，经扫描后，选取背景均一且背景值较低的氨基化片基，室温干燥，保存以备用。

10.根据权利要求9所述的病毒病原高通量快速排查检测方法，其特征在于，所述芯片清洗的步骤是：取出芯片，立即浸入清洗液I中清洗2次，每次10分钟；再转入4℃保存的清洗液II中清洗10分钟，最后常温下将芯片离心甩干。清洗液I可采用6×SSC以及Triton-X102，清洗液II可采用0.1×SSC以及Triton-X102。