CN101985665A - 一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体公开了一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针。本发明对腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒(HKU1、NL63和SARS)、副流感病毒(I型、II型、III型和IV型)共14种呼吸道病毒核酸序列进行分析，设计相应的反转录引物、PCR引物和特异性探针；以反转录和多重不对称PCR的方法扩增特定基因片段；采用液相芯片技术将偶联有病毒特异性探针的荧光编码微球组与PCR扩增产物温育杂交，最后用Bio-PlexTM200进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，且操作简单，检测速度快。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体涉及一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针，尤其涉及利用针对呼吸道病毒的特异性核酸探针用液相芯片方式结合多重聚合酶链反应（PCR）技术，用于快速检测多种呼吸道病毒的方法。
背景技术
呼吸道疾病是世界范围内常见的重要致死疾病之一，引发急性呼吸道感染的病原微生物种类很多，其中病毒占了90%以上，且其引起的临床表现症状都类似：如发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咳嗽、咽痛等。常见的呼吸道病毒包括腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)等。
在对上述病毒检测方面，目前常规应用的检测手段如分离培养方法、免疫学方法以及核酸检测方法如PCR、多重PCR、RT-PCR方法和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病原学诊断和药敏结果常需要3～5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要；而用免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。
对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。
基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。它包含有直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。
与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有以下优点：需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等特点。
采用多重PCR联合液相芯片技术，可以快速准确的对呼吸道病毒进行检测。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针。
本发明利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来检测多种呼吸道病毒，其优势在于，利用该项技术，可以平行一次检测14种呼吸道病毒，包括腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)。并且该技术操作便捷，特异性强，灵敏度高，稳定性好。
本发明提出的检测多种呼吸道病毒的方法，包括如下步骤：
（1）利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)的核酸序列进行广泛的病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对相应基因片段的反转录引物、PCR引物和特异性核酸探针。其中人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)等RNA病毒需要设计反转录引物。腺病毒(AdV)和博卡病毒(BOV)这两种DNA病毒无需设计反转录引物；
（2）采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；
（3）采用多重不对称PCR的方法分两组对病毒cDNA/DNA进行PCR扩增，其中每对引物中有一个5’端修饰有生物素标记，以使该条单链产物能与偶联于微球上特异性核酸探针互补结合并利于后期信号标记；
（4）特异性核酸探针5’端进行C12-胺基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性核酸探针的混合微球组温育杂交，最后用Bio-PlexTM 200进行检测；
本发明所述对RNA病毒特异基因进行特异性反转录反应，针对不同病毒，其反转录序列分别为：SEQ ID Nos：1-12。对RNA病毒的多重特异性反转录反应增加了病毒检测的特异性，减少了后期PCR扩增中非特异序列对扩增的影响，提高扩增效率，具有较高的灵敏度。
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| hMPV-rtp | agactgtgaaacaagaggagac | 1 |
| IfA-rtp | tattgaaagatgagtcttctaacc | 2 |
| IfB-rtp | ttgaatgcatatgaccagagt | 3 |
| RSV-rtp | gtaataactaaattagcagcagg | 4 |
| RV-rtp | tatatatattgtcaccataagc | 5 |
| HKU1-rtp | ccaaaactaaactactaacaat | 6 |
| NL63-rtp | gtaacaataacacaccacttctg | 7 |
| SARS-rtp | cattctcctaagaagctattaa | 8 |
| PIV1-rtp | tcatcaaacttaatcactcaagg | 9 |
| PIV2-rtp | aagctgttcagtcactgctatac | 10 |
| PIV3-rtp | gacatggcataatgtgctatc | 11 |
| PIV4-rtp | tcacaacaatgaaaataatggac | 12。 |
本发明所述用于PCR扩增的病毒特异基因序列的引物，其序列针对不同病毒，分别为：SEQ ID Nos：14-41。选用的引物对各自扩增的病毒特异序列，都有很高的灵敏度，提高了检测的准确性。
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| AdV-F | gaygcytcggagtacctgag | 14 |
| AdV-RB | tgccacngtggggttycta | 15 |
| hMPV-F | cttttgcgacacagcagcag | 16 |
| hMPV-RB | agaggggacagtgcaaccat | 17 |
| IfA-F | ttctaaccgaggtcgaaacgt | 18 |
| IfA-RB | caggattggtcttgtctttagc | 19 |
| IfB-FB | aaggacattcaaagccaa | 20 |
| IfB-R | agttcttccgtgaccagt | 21 |
| RSV-FB | actacccaaggacatagccaac | 22 |
| RSV-R | aaatcccttcaactctactgcc | 23 |
| BOV-FB | aaggctgagcgagaggcat | 24 |
| BOV-R | agtttttgaagaagcgaag | 25 |
| RV-FB | cccctgaatgcggctaacctt | 26 |
| RV-R | agtgaaacacggacacccaaa | 27 |
| HKU1-F | tttgaagagtatagcagc | 28 |
| HKU1-RB | cccaacccataagaacag | 29 |
| NL63-F | cgtacttctattatgaagcatga | 30 |
| NL63-RB | gcagatctaatgttatacttaaa | 31 |
| SARS-F | agagccaccacattttca | 32 |
| SARS-RB | acatggggatagcactac | 33 |
| PIV1-FB | tacctatgacatcaacgac | 34 |
| PIV1-R | tcaaatactaaatcttcta | 35 |
| PIV2-FB | ctgagaaagaagattatgc | 36 |
| PIV2-R | ctgttgtatttggaagaga | 37 |
| PIV3-FB | ggagcattgtgtcatctg | 38 |
| PIV3-R | cgtttactctttcggttg | 39 |
| PIV4-F | gctcccataatcgtcact | 40 |
| PIV4-RB | tatttgcttggttccaga | 41 |
更佳的，本发明所述的引物中还有扩增人GAPDH基因片段的一个反转录引物，其序列为：SEQ ID No：13，和一对PCR引物，其序列分别为：SEQ ID Nos：42-43，用以作为内对照片段，其中，PCR引物的设计使用跨内含子设计，以利于监控体系反转录效果，提高检测准确性。
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| GAPDH-rtp | aatcatattggaacatgtaaacc | 13 |
| GAPDH-FB | ggaaggtgaaggtcggagt | 42 |
| GAPDH-R | gtagttgaggtcaatgaaggg | 43 |
本发明采用不对称PCR的方法，增加生物标记单链的产量，提高后期PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球杂交结合的效率，提高检测灵敏度。
本发明所述针对不同病毒的特异性核酸探针序列，分别为：SEQ ID Nos：44-57。选用的探针碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性。
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| AdV-P | gccaccgacacctacttca | 44 |
| hMPV-P | tacccatgcaaagtcagc | 45 |
| IfA-P | gagatcgcacagagacttga | 46 |
| IfB-P | taattgtctccctcttctgg | 47 |
| RSV-P | ctctggtagaagattgtgcta | 48 |
| BOV-P | ctcctctgcgatctctatat | 49 |
| RV-P | atcccgcaattactcattac | 50 |
| HKU1-P | tcctgttgttataggaaccac | 51 |
| NL63-P | aacgtacaggtgttattttg | 52 |
| SARS-P | agggtacagtgaataatgct | 53 |
| PIV1-P | tgtagtctcattcacagtgg | 54 |
| PIV2-P | ataatagaaagcaagtctcagt | 55 |
| PIV3-P | actctcgatttttgtgagtc | 56 |
| PIV4-P | tttgttgatcaagacaataca | 57 |
更佳的，本发明所述的核酸探针中还包括一个针对人GAPDH基因片段的特异性核酸探针，其序列为：SEQ ID No：58，用以作为内对照探针，保证检测的稳定性和准确性。
| 名称 | 序列 | SEQ ID No |
| GAPDH-P | agttaaaagcagccctggtg | 58 |
本发明所称的杂交是PCR产物变性后与偶联有特异性核酸探针的微球组充分混合，并在一定的温度条件下进行核酸单链间互补配对杂交的过程。
本发明所称的信号标记过程是指杂交完成后加入SA-PE（Streptavidin-R-phycoerythrin，抗链霉素藻红蛋白），最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。
本发明采用Bio-PlexTM 200对杂交结果进行检测，并根据本发明所提供标准进行判定。
本发明针对不同病毒，检测的特异性基因序列如下表所示：
| 病原体 | 靶基因 |
| 腺病毒（AdV） | hexon |
| 人偏肺病毒（hMPV） | fusion glycoprotein(F) |
| 流感病毒A型（IfA） | matrix protein |
| 流感病毒B型（IfB） | nonstructural |
| 呼吸道合胞病毒（RSV） | nucleocapsid |
| 博卡病毒（BOV） | nonstructural |
| 鼻病毒（RV） | 5' UTR |
| HKU1病毒（HKU1） | pol |
| NL63病毒（NL63） | la |
| SARS病毒（SARS） | 3’-NCR |
| 副流感病毒I型（PIV1） | hemagglutinin-neuraminidase |
| 副流感病毒II型（PIV2） | hemagglutinin-neuraminidase |
| 副流感病毒III型（PIV3） | hemagglutinin-neuraminidase |
| 副流感病毒IV型（PIV4） | phosphoprotein |
本发明还包括一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，包括：针对12种呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列分别为：SEQ ID No：1- -SEQ ID No ：13 ；针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的PCR引物，其序列分别为：SEQ ID No：14-- SEQ ID No：43 ；针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的探针，其序列分别为：SEQ ID No：44- -SEQ ID No：58。
本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，并且操作简单，检测速度快，能够对呼吸道病毒进行快速的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明：
实施例1：多种呼吸道病毒特异性核酸探针微球组的制备。
一、核酸探针的序列合成
按照以下序列合成各种核酸探针序列，所有探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列：
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| AdV-P | gccaccgacacctacttca | 44 |
| hMPV-P | tacccatgcaaagtcagc | 45 |
| IfA-P | gagatcgcacagagacttga | 46 |
| IfB-P | taattgtctccctcttctgg | 47 |
| RSV-P | ctctggtagaagattgtgcta | 48 |
| BOV-P | ctcctctgcgatctctatat | 49 |
| RV-P | atcccgcaattactcattac | 50 |
| HKU1-P | tcctgttgttataggaaccac | 51 |
| NL63-P | aacgtacaggtgttattttg | 52 |
| SARS-P | agggtacagtgaataatgct | 53 |
| PIV1-P | tgtagtctcattcacagtgg | 54 |
| PIV2-P | ataatagaaagcaagtctcagt | 55 |
| PIV3-P | actctcgatttttgtgagtc | 56 |
| PIV4-P | tttgttgatcaagacaataca | 57 |
| GAPDH-P | agttaaaagcagccctggtg | 58 |
二、核酸探针与微球偶联
选取编号为12，22，28，30，33，42，49，56，59，61，64，65，67，68和70号共15种微球（BioRad公司），按照如下方法进行核酸探针的偶联：
1．将储存于2-10℃的编号为12，22，28，30，33，42，49，56，59，61，64，65，67，68和70号的15种微球及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30分钟-60分钟；
2．将AdV-P、hMPV-P、IfA-P、IfB-P、RSV-P、BOV-P 、RV-P、HKU1-P、NL63-P、SARS-P、PIV1-P、PIV2-P、PIV3-P、PIV4-P和GAPDH-P核酸探针用ddH2O溶解，浓度为0.1 nmol/μl；
3．将微球高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；
4．各取100μl（1.25×106个）微球加入1.5ml Eppendorf管中；
5．14000g离心4分钟沉淀微球；
6．小心弃上清夜，加入8.5μl 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；
7．每种核酸探针各取1μl（0.1 nmol/μl）加入上述Eppendorf管中，并振荡混匀；
8．新鲜制备10mg/ml浓度的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；
9．避光，室温孵育30分钟；
10．重复步骤8-9一次；
11．每管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；
12．14000g离心4分钟沉淀微球；
13．弃上清夜，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；
14．16000g离心4分钟沉淀微球；
15．弃上清夜，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒；
16．微球计数：
(1) 将偶联好的微球振荡混匀40秒；
(2) 用ddH2O将微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀；
(3) 取10μl微球稀释液加入到血球计数板上；
(4) 对四个角上的计数室内的微球计数；
(5) 计算微球悬液的浓度；
15种微球悬液的计数结果都约为：4×104个/μl；
17．将偶联好的微球悬液避光储存于2-10℃备用。
三、准备核酸探针微球组：
将偶联好的核酸探针微球等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于多种呼吸道病毒检测的特异性核酸探针微球组。
实施例2：对5个临床样本的呼吸道病毒检测。
一、样本的准备
用常规方法抽提1-5号临床样本的总RNA及基因组DNA，测浓度，备用。
二、反转录反应。
1．按照以下序列合成各反转录引物：
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| hMPV-rtp | agactgtgaaacaagaggagac | 1 |
| IfA-rtp | tattgaaagatgagtcttctaacc | 2 |
| IfB-rtp | ttgaatgcatatgaccagagt | 3 |
| RSV-rtp | gtaataactaaattagcagcagg | 4 |
| RV-rtp | tatatatattgtcaccataagc | 5 |
| HKU1-rtp | ccaaaactaaactactaacaat | 6 |
| NL63-rtp | gtaacaataacacaccacttctg | 7 |
| SARS-rtp | cattctcctaagaagctattaa | 8 |
| PIV1-rtp | tcatcaaacttaatcactcaagg | 9 |
| PIV2-rtp | aagctgttcagtcactgctatac | 10 |
| PIV3-rtp | gacatggcataatgtgctatc | 11 |
| PIV4-rtp | tcacaacaatgaaaataatggac | 12 |
| GAPDH-rtp | aatcatattggaacatgtaaacc | 13 |
2．准备混合反转录引物工作液：
（1）合成的每个反转录引物用TE（pH8.0）配制成100μmol/L的储存液；
（2）分别取各反转录引物储存液10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，加入370μl TE（pH8.0）补足到总体积为500μl，并振荡混匀，即为混合反转录引物工作液。
3．样本总RNA反转录反应
反应体系：使用TaKaRa公司反转录反应试剂对样本的总RNA进行反转录反应，反转录反应体系为10μl，其中，5×PrimeScriptTM Buffer 2μl、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 0.5μl、混合反转录引物工作液0.5μl、总RNA 1μg，补RNase Free dH2O至总体积为10μl。
反应程序：42℃ 15分钟→85℃ 5秒。
三、多重PCR扩增。
1．合成PCR扩增引物：
（1）按照以下的序列合成无修饰PCR扩增引物：
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| AdV-F | gaygcytcggagtacctgag | 14 |
| hMPV-F | cttttgcgacacagcagcag | 16 |
| IfA-F | ttctaaccgaggtcgaaacgt | 18 |
| IfB-R | agttcttccgtgaccagt | 21 |
| RSV-R | aaatcccttcaactctactgcc | 23 |
| BOV-R | agtttttgaagaagcgaag | 25 |
| RV-R | agtgaaacacggacacccaaa | 27 |
| HKU1-F | tttgaagagtatagcagc | 28 |
| NL63-F | cgtacttctattatgaagcatga | 30 |
| SARS-F | agagccaccacattttca | 32 |
| PIV1-R | tcaaatactaaatcttcta | 35 |
| PIV2-R | ctgttgtatttggaagaga | 37 |
| PIV3-R | cgtttactctttcggttg | 39 |
| PIV4-F | gctcccataatcgtcact | 40 |
| GAPDH-R | gtagttgaggtcaatgaaggg | 43 |
（2） 按照以下序列合成带修饰PCR扩增引物，所有引物5’端均带有生物素修饰：
| 名称 | 序列 | SEQ ID No： |
| AdV-RB | tgccacngtggggttycta | 15 |
| hMPV-RB | agaggggacagtgcaaccat | 17 |
| IfA-RB | caggattggtcttgtctttagc | 19 |
| IfB-FB | aaggacattcaaagccaa | 20 |
| RSV-FB | actacccaaggacatagccaac | 22 |
| BOV-FB | aaggctgagcgagaggcat | 24 |
| RV-FB | cccctgaatgcggctaacctt | 26 |
| HKU1-RB | cccaacccataagaacag | 29 |
| NL63-RB | gcagatctaatgttatacttaaa | 31 |
| SARS-RB | acatggggatagcactac | 33 |
| PIV1-FB | tacctatgacatcaacgac | 34 |
| PIV2-FB | ctgagaaagaagattatgc | 36 |
| PIV3-FB | ggagcattgtgtcatctg | 38 |
| PIV4-RB | tatttgcttggttccaga | 41 |
| GAPDH-FB | ggaaggtgaaggtcggagt | 42 |
2．准备混合PCR引物工作液：
（1）合成的每个反转录引物用TE（pH8.0）配制成100μmol/L的储存液；
（2）混合PCR引物工作液I：分别取下述PCR引物储存液：AdV-F、IfB-R、HKU1-F、NL63-F、SARS-F、PIV1-R、PIV2-R和PIV4-F各5μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再取下述PCR引物储存液：AdV-RB、IfB-FB、HKU1-RB、NL63-RB、SARS-RB、PIV1-FB、PIV2-FB和PIV4-RB各25μl加入到上述同一个1.5ml Eppendorf管中，再加入260μl TE（pH8.0）补足到总体积为500μl，并振荡混匀，即为混合PCR引物工作液I；
（3）混合PCR引物工作液II：分别取下述PCR引物储存液：hMPV-F、IfA-F、RSV-R、BOV-R、RV-R、PIV3-R和GAPDH-R各5μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，再取下述PCR引物储存液：hMPV-RB、IfA-RB、RSV-FB、BOV-FB、RV-FB、PIV3-FB和GAPDH-FB各25μl加入到上述同一个1.5ml Eppendorf管中，再加入290μl TE（pH8.0）补足到总体积为500μl，并振荡混匀，即为混合PCR引物工作液II。
3．PCR扩增反应：
（1） PCR反应体系I：PCR扩增反应体系为20μl，其中包括10×PCR Buffer 2μl、dNTP（2.5mmol/L）2μl、rTaq酶（5U/μl）0.4μl、混合PCR引物工作液I 2μl、样本反转录产物cDNA 1μl、样本基因组DNA 1μl（约10-50ng），补ddH2O 11.6μl至终体积为20μl；
（2） PCR反应程序I：94℃ 5分钟→94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 30秒（40个循环）→72℃ 5分钟→4℃保温；
（3） PCR反应体系II：PCR扩增反应体系为20μl，其中包括10×PCR Buffer 2μl、dNTP（2.5mmol/L）2μl、rTaq酶（5U/μl）0.4μl、混合PCR引物工作液II 2μl、样本反转录产物cDNA 1μl、样本基因组DNA 1μl（约10-50ng），补ddH2O 11.6μl至终体积为20μl；
（4）PCR反应程序II：94℃ 5分钟→94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒（40个循环）→72℃ 5分钟→4℃保温。
四、杂交
取上述临床样本1-5号和阴性对照（模板为ddH2O）所对应的PCR扩增产物I与PCR扩增产物II各5μl加入到同一个洁净的0.25ml PCR反应管中，分别加入7μl TE（pH8.0）缓冲液和33μl核酸探针微球组（含15种核酸探针，每种核酸探针的微球数量约为5000个），振荡混匀后95℃变性5分钟，55℃杂交20分钟。
五、信号标记
每管杂交产物中分别加入100μl SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后60℃孵育10分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。
六、检测
各取100μl信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-PlexTM 200对杂交结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。
临床样本1-5号及阴性对照检测结果如下：
根据本方法判定规则判定上述1-5号临床样本的检测结果如下：
阴性对照的检测每种核酸探针的读数≤150判定为检测成功；
阴性对照的检测每种核酸探针的读数＞150判定为检测失败；
每个样本的内对照探针检测读数≥450判定为该样本检测成功；
每个样本的内对照探针检测读数＜450判定为该样本检测失败；
针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/阴性对照检测读数≥3.0，则判定此样本的该种病毒检测结果为阳性；
针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/阴性对照检测读数＜3.0，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。
结果如下：
结果说明如下：
1号临床样本为副流感病毒I型(PIV1)感染；
2号临床样本为副流感病毒III型(PIV3)感染；
3号临床样本为人偏肺病毒(hMPV)感染；
4号临床样本为呼吸道合胞病毒(RSV)感染；
5号临床样本为流感病毒B型(IfB)感染。
Claims (8)
1.一种检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)的核酸序列进行病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对相应基因片段的反转录引物、PCR引物和特异性核酸探针；其中人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4) RNA病毒设计反转录引物，腺病毒(AdV)和博卡病毒(BOV)这两种DNA病毒不设计反转录引物；
（2）采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；
（3）采用多重不对称PCR的方法分两组对病毒cDNA/DNA进行PCR扩增，其中每对引物中有一个5’端修饰有生物素标记，以使该条单链产物能与偶联于微球上特异性核酸探针互补结合并利于后期信号标记；
（4）特异性核酸探针5’端进行C12-胺基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性核酸探针的混合微球组温育杂交，最后用Bio-PlexTM 200进行检测。
2.如权利要求1所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述的反转录引物包括针对12种呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列分别为：SEQ ID Nos：1-13：
hMPV-rtp agactgtgaaacaagaggagac SEQ ID No: 1；
IfA-rtp tattgaaagatgagtcttctaacc SEQ ID No: 2；
IfB-rtp ttgaatgcatatgaccagagt SEQ ID No: 3；
RSV-rtp gtaataactaaattagcagcagg SEQ ID No: 4；
RV-rtp tatatatattgtcaccataagc SEQ ID No: 5；
HKU1-rtp ccaaaactaaactactaacaat SEQ ID No: 6；
NL63-rtp gtaacaataacacaccacttctg SEQ ID No: 7；
SARS-rtp cattctcctaagaagctattaa SEQ ID No: 8；
PIV1-rtp tcatcaaacttaatcactcaagg SEQ ID No: 9；
PIV2-rtp aagctgttcagtcactgctatac SEQ ID No: 10；
PIV3-rtp gacatggcataatgtgctatc SEQ ID No: 11；
PIV4-rtp tcacaacaatgaaaataatggac SEQ ID No: 12；
GAPDH-rtp aatcatattggaacatgtaaacc SEQ ID No: 13。
3.如权利要求2所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述的PCR引物包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的PCR引物，其序列分别为：SEQ ID Nos：14-43：
AdV-F gaygcytcggagtacctgag SEQ ID No: 14；
AdV-RB tgccacngtggggttycta SEQ ID No: 15；
hMPV-F cttttgcgacacagcagcag SEQ ID No: 16；
hMPV-RB agaggggacagtgcaaccat SEQ ID No: 17；
IfA-F ttctaaccgaggtcgaaacgt SEQ ID No: 18；
IfA-RB caggattggtcttgtctttagc SEQ ID No: 19；
IfB-FB aaggacattcaaagccaa SEQ ID No: 20；
IfB-R agttcttccgtgaccagt SEQ ID No: 21；
RSV-FB actacccaaggacatagccaac SEQ ID No: 22；
RSV-R aaatcccttcaactctactgcc SEQ ID No: 23；
BOV-FB aaggctgagcgagaggcat SEQ ID No: 24；
BOV-R agtttttgaagaagcgaag SEQ ID No: 25；
RV-FB cccctgaatgcggctaacctt SEQ ID No: 26；
RV-R agtgaaacacggacacccaaa SEQ ID No: 27；
HKU1-F tttgaagagtatagcagc SEQ ID No: 28；
HKU1-RB cccaacccataagaacag SEQ ID No: 29；
NL63-F cgtacttctattatgaagcatga SEQ ID No: 30；
NL63-RB gcagatctaatgttatacttaaa SEQ ID No: 31；
SARS-F agagccaccacattttca SEQ ID No: 32；
SARS-RB acatggggatagcactac SEQ ID No: 33；
PIV1-FB tacctatgacatcaacgac SEQ ID No: 34；
PIV1-R tcaaatactaaatcttcta SEQ ID No: 35；
PIV2-FB ctgagaaagaagattatgc SEQ ID No: 36；
PIV2-R ctgttgtatttggaagaga SEQ ID No: 37；
PIV3-FB ggagcattgtgtcatctg SEQ ID No: 38；
PIV3-R cgtttactctttcggttg SEQ ID No: 39；
PIV4-F gctcccataatcgtcact SEQ ID No: 40；
PIV4-RB tatttgcttggttccaga SEQ ID No: 41；
GAPDH-FB ggaaggtgaaggtcggagt SEQ ID No: 42；
GAPDH-R gtagttgaggtcaatgaaggg SEQ ID No: 43。
4.如权利要求3所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于所述的荧光编码微球为15种不同荧光编码的微球，所述的核酸探针为15种特异性核酸探针，每种所述荧光编码微球上固定有1种特异性核酸探针；所述的15种特异性核酸探针包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的探针，其序列分别为：SEQ ID Nos：44-58：
AdV-P gccaccgacacctacttca SEQ ID No: 44；
hMPV-P tacccatgcaaagtcagc SEQ ID No: 45；
IfA-P gagatcgcacagagacttga SEQ ID No: 46；
IfB-P taattgtctccctcttctgg SEQ ID No: 47；
RSV-P ctctggtagaagattgtgcta SEQ ID No: 48；
BOV-P ctcctctgcgatctctatat SEQ ID No: 49；
RV-P atcccgcaattactcattac SEQ ID No: 50；
HKU1-P tcctgttgttataggaaccac SEQ ID No: 51；
NL63-P aacgtacaggtgttattttg SEQ ID No: 52；
SARS-P agggtacagtgaataatgct SEQ ID No: 53；
PIV1-P tgtagtctcattcacagtgg SEQ ID No: 54；
PIV2-P ataatagaaagcaagtctcagt SEQ ID No: 55；
PIV3-P actctcgatttttgtgagtc SEQ ID No: 56；
PIV4-P tttgttgatcaagacaataca SEQ ID No: 57；
GAPDH-P agttaaaagcagccctggtg SEQ ID No: 58。
5.用于如权利要求1—4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的反转录引物，其特征在于，包括针对12种呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列分别为：SEQ ID No：1- -SEQ ID No ：13 。
6.用于如权利要求1—4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的PCR引物，其特征在于，该PCR引物包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的PCR引物，其序列分别为：SEQ ID No：14-- SEQ ID No：43 。
7.用于如权利要求1—4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的核酸探针，其特征在于，包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的探针，其序列分别为：SEQ ID No：44- -SEQ ID No：58。
8.一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求5所述的一组检测多种呼吸道病毒的反转录引物组、如权利要求6所述的一组检测多种呼吸道病毒的PCR引物组和如权利要求7所述的一组检测多种呼吸道病毒的核酸探针微球组。
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