CN115011734A - 一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物对组，所述引物对组包括第一至第十六引物对中的至少两种，其中，第一至第十六引物对的序列如SEQ IDNO.1～33所示。本发明检测多种呼吸道病毒的方法中同一靶标设计了两种不同探针(靶标探针与捕获探针)，因此获得了双重的特异性，检测结果更准确，能够很好的避免假阳性和假阴性。本发明设计的捕获探针，灵敏性和特异性都极高，能实现绝大部分都与PCR中的靶标探针相结合，几乎不会与非靶标探针结合。

Description

一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒。
背景技术
呼吸道病毒是指一大类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，在儿童和成人中，90％以上的急性呼吸道感染都是由病毒引起的，其中以呼吸道病毒最常见。急性呼吸道感染是临床常见病之一，已成为严重威胁人类健康的一个公共卫生问题。常见的呼吸道病毒有流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、人冠状病毒、博卡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒等。
流感病毒(Influenza virus)分为甲乙丙三型，猪和禽类可携带甲型流感病毒，乙、丙型流感病毒仅在人之间传播。甲型流感病毒容易发生变异，变异后能够感染人类，感染后症状表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重肺炎，严重者心、肾等多种脏器官衰竭导致死亡，病死率很高。乙型流感病毒可引起传染性极强的急性呼吸道传染病，呈爆发或小流行，通常有肌炎及胃肠道症状。呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，简称RSV)是属于副黏液病毒科的一种RNA病毒，是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎。人偏肺病毒(Human`metapneumovirus，简称HMPV)，目前认为人类是HMPV已知的唯一天然宿主，该病毒可导致各年龄段急性呼吸道感染，临床表现与同属副黏病毒科的人呼吸道合胞病毒所致疾病相似，重症患者多为婴幼儿、老年人及罹患基础心肺疾病者。HMPV病毒在全球范围内分布，并具有季节性分布，其发病率与冬季流感病毒相当。副流感病毒(Parainfluenza virus，简称PIV)的四种亚型各有不同的临床和流行病学特征。I型和II型的最典型的临床特征是造成儿童喉气管支气管炎，I型是这种儿童喉气管支气管炎的主要原因，而II型次之。I型和II型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾病。III型经常导致肺炎和细支气管炎。IV型则很难检出。副流感病毒的潜伏期一般在1～7天左右，感染后因免疫力低，易反复感染。人腺病毒(Human adenovirus，简称HAdV)为腺病毒科的哺乳动物腺病毒属的一种DNA病毒，人腺病毒在呼吸道病毒中的感染率仅次于呼吸道合胞病毒。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱、眼和肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病有关。冠状病毒(Human coronavirus)是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。冠状病毒还可引起婴儿，新生儿急性肠胃炎，主要症状为水样大便、发热、呕吐，每天10余次，严重者还可以出现血水样便。严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，是引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19)主要病原体，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。博卡病毒(Human bocavirus，简称HBoV)通常感染肠道和呼吸道，一些病毒可能会通过胎盘传播，导致胎儿先天感染。博卡病毒与其他呼吸道病毒的共感染率可达51％，且更多地区出现在那些只有低拷贝博卡病毒的患儿样品中。博卡病毒可以以低拷贝数长期存在于呼吸道、血液以及尿液中达一个月之久，而共感染现象在这些长期感染博卡病毒的病人中十分普遍。
目前检测呼吸道病毒的方法主要为“金标准”培养法，此方法培养时间长，需要有经验的操作者；生物安全风险性高；实验操作繁琐，无法快速地出具检查报告。荧光定量PCR法通量低，一般一次只能检测一种病毒，试剂成本高，样本需求量大，且多重荧光检测时存在荧光干扰影响检测结果。对于上述几种病毒，目前还没有一套可以同时检测的多重PCR方法。
此外，生物芯片检测病原菌在目前市场得到了广泛的应用，尤其是以核酸探针为捕获探针来同时检测多重病原菌领域需求更大。大多生物芯片只能检测一种病原菌或以多块装载不同核酸探针的芯片联用才能达到多种病原菌同时检测的目的，这种方法效率较低同时较浪费资源。单一核酸探针在芯片上固定较为简单，浸泡孵育或者丝网印刷技术就能够解决，但多重核酸探针的固定则面临着诸多困难。一方面因为芯片微阵列中电极的尺寸较小，多重核酸探针的固定时易出现探针交叉污染造成检测结果的不确定性；芯片表面处理不当，核酸探针固定时数量不足会导致检测信号较低，造成假阴现象；另一方面，核酸探针溶液很难在较疏水的电极表面均匀铺展开，导致在打印时核酸探针在电极表面覆盖度较低，检测信号较低；核酸探针表面带有较多的负电荷，自身之间易出现聚集现象，不利于在芯片电极的固定。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：
提供一种检测多种呼吸道病毒的引物对组。所述检测多种呼吸道病毒的引物对组，能够同时检测多种呼吸道病毒。
本发明所要解决的第二个技术问题是：
提供一种检测多种呼吸道病毒的信号探针。
本发明所要解决的第三个技术问题是：
提供一种检测多种呼吸道病毒的捕获探针。
本发明所要解决的第四个技术问题是：
提供一种引物对组或提供一种信号探针或提供一种捕获探针在制备检测多种呼吸道病毒产品中的应用。
本发明所要解决的第五个技术问题是：
提供一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒。
本发明所要解决的第六个技术问题是：
提供一种生物芯片。所述芯片能够同时检测多种目标物，极大地提高了检测效率并降低了检测成本。
本发明所要解决的第七个技术问题是：
提供一种生物芯片的制备方法。
为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种检测多种呼吸道病毒的引物对组，所述引物对组包括以下至少两种的引物对：
第一引物对：所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ IDNO.2所示的反向引物；
第二引物对：所述第二引物对包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ IDNO.4所示的反向引物；
第三引物对：所述第三引物对包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ IDNO.6所示的反向引物；
第四引物对：所述第四引物对包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物和如SEQ IDNO.8所示的反向引物；
第五引物对：所述第五引物对包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物和如SEQ IDNO.10所示的反向引物；
第六引物对：所述第六引物对包括如SEQ ID NO.11所示的正向引物和如SEQ IDNO.12所示的反向引物；
第七引物对：所述第七引物对包括如SEQ ID NO.13所示的正向引物和如SEQ IDNO.14所示的反向引物；
第八引物对：所述第八引物对包括如SEQ ID NO.15所示的正向引物和如SEQ IDNO.16所示的反向引物；
第九引物对：所述第九引物对包括如SEQ ID NO.17所示的正向引物和如SEQ IDNO.18所示的反向引物；
第十引物对：所述第十引物对包括如SEQ ID NO.19所示的正向引物和如SEQ IDNO.20所示的反向引物；
第十一引物对：所述第十一引物对包括如SEQ ID NO.21所示的正向引物和如SEQID NO.22所示的反向引物；
第十二引物对：所述第十二引物对包括如SEQ ID NO.23所示的正向引物和如SEQID NO.24所示的反向引物；
第十三引物对：所述第十三引物对包括如SEQ ID NO.25所示的正向引物和如SEQID NO.26所示的一反向引物或者如SEQ ID NO.27所示的第二反向引物；
第十四引物对：所述第十四引物对包括如SEQ ID NO.28所示的正向引物和如SEQID NO.29所示的反向引物；
第十五引物对：所述第十五引物对包括如SEQ ID NO.30所示的正向引物和如SEQID NO.31所示的反向引物；
第十六引物对：所述第十六引物对包括如SEQ ID NO.32所示的正向引物和如SEQID NO.33所示的反向引物。
根据本发明的一种实施方式，所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43、副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E、博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)和副流感病毒I型(PIV1)中的至少两种。
为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种检测多种呼吸道病毒的信号探针，所述信号探针包括以下信号探针中的至少两种：
IVA：5’-Fc-ATCAAAGCTCTCAAACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA-3’；
IVB：5’-Fc-CAGTAATGGGCAGTATGGCCATCGGATCCTCAAYTCACTCT-3’；
HCOV-HKU1：5’-Fc-GGCTGATACGACAATGAGTGAAATAGTTATGTGTGGCGG-3’；
HCOV-OC43：5’-Fc-ACAGCGAGTCTTTTCCGCCTGGCACGGTACTCC-3’；
HCOV-NL63：5’-Fc-GTGCTCCGAACTATTGCCAAGGCTCCTAAACGTACAGGT-3’；
HCOV-229E：5’-Fc-CCAAGTCATTGACGCCCTGACGACCACGTTGTGGTTC-3’；
RSVA：5’-Fc-AACGATCTCTTGGGCTAGGAGCCATTGTGTCATGCTAT-3’；
RSVB：5’-Fc-ACTTATGGGACAACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATG-3’；
PIV1：5’-Fc-ACTTATGGGACAACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATG-3’；
PIV2：5’-Fc-ATAGGAGAACAAACATGGAATCAATCGCAAAAGCTGT-3’；
PIV3-1：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGATGTTCAAGACCTCCATACCCGA-3’；
PIV3-2：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGATGTTCAAGACCTCCATATCCGAG-3’；
PIV3-3：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGGTGTTCAAGACCTCCATATCCGA-3’；
PIV4：5’-Fc-ATATGCTCCGAACTTGGGCAAGCYTTATTYCCTGGACAATCTTT-3’；
HAdV：5’-Fc-ATAATCGATTGACATTCGCCCGTGCAACAGACACCT-3’；
HBoV：5’-Fc-TACTCTATGTTCAGAACTCCACCCCATGCCTCTCGCTCA-3’；
HMPV：5’-Fc-AGACACAATCTGATATGTTGTGCGGCARTTTTCAGACAAT-3’；
SARS-CoV-2：5’-Fc-ATGCAACGACATTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’；
探针序列中，R＝A或者G，Y＝C或者T。
信号探针中，以标记的二茂铁(Fc)为信号基团，当Fc标记的目标探针被芯片上的捕获探针捕获后，由电化学方法(方波伏安法)，施加一定的电压，Fc基团会被氧化释放电子，产生一个氧化电流峰。
为了解决所述第三个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种检测多种呼吸道病毒的捕获探针，所述捕获探针包括以下捕获探针中的至少两种：
CP-IVB：5`-(SH)3-TTTTTCTGCCCATTACTG-3；
CP-HKU1：5`-(SH)3-TTTTTTCGCCATTGTATTA-3`；
CP-NL63：5`-(SH)3-TTTTTAAAGTTCCTTGGAT-3`；
CP-229E：5`-(SH)3-TTTTTGTTCTAAGCATCAT-3`；
CP-PIV4：5`-(SH)3-TTTTTAGTTCGGAGCATAT-3`；
CP-PIV3：5`-(SH)3-TTTTTATTACACGAAACTG-3`；
CP-HBoV：5`-(SH)3-TTTTTCTGAACATAGAGTA-3`；
CP-HMPV：5`-(SH)3-TTTTTATCAGATTGTGTCT-3`；
CP-RSVA：5`-(SH)3-TTTTTCAATCGCACATTAT-3`；
CP-RSVB：5`-(SH)3-TTTTTTTGTCGTATCAGAT-3`；
CP-PIV2：5`-(SH)3-TTTTTGTTTGTTCTCCTAT-3`；
CP-IVA：5`-(SH)3-TTTTTTTGAGAGCTTTGAT-3`；
CP-SARS-CoV-2：5`-(SH)3-TTTTTTAATGTCGTTGCAT-3`；
CP-HAdV：5`-(SH)3-TTTTTTGTCAATCGATTAT-3`；
CP-PIV1：5`-(SH)3-TTTTTTTGTCCCATAAGT-3`；
CP-OC43：5`-(SH)3-TTTTTTTATGGACCTGTTA-3`。
本发明所要解决的第四个技术问题是：
提供一种引物对组或提供一种信号探针或提供一种捕获探针在制备检测多种呼吸道病毒产品中的应用。
为了解决所述第五个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对组或者所述试剂盒包括所述的引物对组，还包括所述的信号探针和/或所述的捕获探针。
根据本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括用于多重不对称PCR反应的反应体系。
根据本发明的一种实施方式，所述用于多重不对称PCR反应的反应体系包括PCR反应预混液和病毒标准品，所述PCR反应预混液包括热启动AK Taq DNA聚合酶、反应缓冲液，所述热启动AK Taq DNA聚合酶包括dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)和UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)。
根据本发明的一种实施方式，所述病毒标准品，包括甲型流感病毒标准品、乙型流感病毒标准品、呼吸道合胞病毒标准品、人偏肺病毒标准品、副流感病毒I型、II型、III型、IV型标准品、人腺病毒标准品、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)标准品、冠状病毒(HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63，HCoV-HKU1)标准品、博卡病毒标准品。
根据本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照品。
根据本发明的一种实施方式，一种检测多种呼吸道病毒的方法，包括以下步骤：
S1提供待检测样本，并从所述待检测样本中提取DNA或者RNA；
S2将提取到的DNA或者RNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，所述PCR反应液中包括所述的引物对组；
S3将PCR扩增产物修饰到芯片上，对芯片进行检测。
根据本发明的一种实施方式，所述检测多种呼吸道病毒的方法，还包括设置阳性对照、阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释至1*106～1*102拷贝/μL的步骤。
根据本发明的一种实施方式，所述方法中PCR扩增过程包括以下反应以及反应参数：
逆转录：40-50℃，15-25min；
热启动：95-100℃，2-3min。
根据本发明的一种实施方式，用电化学法检测芯片。在用电化学法同时检测多种呼吸道病毒中，最核心的是引物、探针和捕获探针的设计。由于在同一个反应体系存在多种模板(从所述待检测样本中提取到的DNA或者RNA)、引物，使得影响反应因素增多。而本发明设计的引物、探针和捕获探针，排除了模板与引物、引物与引物、模板与模板以及简并碱基等之间的相互干扰。本发明的引物的退火温度比较接近，从而能够保证试验的成功率。
本发明检测多种呼吸道病毒的方法中同一靶标设计了两种不同探针(靶标探针与捕获探针)，因此获得了双重的特异性，检测结果更准确，能够很好的避免假阳性和假阴性。本发明设计的捕获探针，灵敏性和特异性都极高，能实现绝大部分都与PCR中的靶标探针相结合，几乎不会与非靶标探针结合。
为了解决所述第六个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种生物芯片，包括亲水改性芯片与所述的引物对组，所述的引物对组修饰于所述亲水改性芯片的固相载体上。
为了解决所述第七个技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种生物芯片的制备方法，包括以下步骤：
用第一有机试剂清洗芯片，将芯片置于臭氧环境中，以紫外光照射，再将芯片置于第二有机试剂浸泡，得到亲水改性芯片；所述第一有机试剂与所述第二有机试剂独立选自乙醇和丙酮溶液中的至少两种；将所述引物对组固载于所述亲水改性芯片的固相载体上。
用有机试剂清理芯片不仅去除了表面的杂质，并且增加了表面的亲水性，使核酸探针溶液更均匀的展开，有利于探针的固定。
根据本发明的一种实施方式，将探针修饰到亲水改性芯片之前，选用高盐的PB缓冲液作核酸探针的溶剂，从而能够很好的屏蔽探针携带的负电荷，减少自身的团聚，有利于探针在芯片上的有效固定。
根据本发明的一种实施方式，选用打印机固定探针到芯片上。由于芯片尺寸较小，单纯的手工操作无法将探针点在芯片上，因此选用打印机来完成操作。选择打印机固定探针可以最大限度的在芯片微电极上滴加核酸探针，且不易造成污染，同时也极大的节约了核酸用量，提高了操作效率。
所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
1.本发明设计出针对多种呼吸道病毒特异性强的多重PCR扩增引物、普通探针、捕获探针，建立了一种电化学检测多种呼吸道病毒的方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点。本发明利用多重不对称PCR技术，大大节约了呼吸道病毒的检测成本，提高检测效率，对多种呼吸道病毒的检测提供了一种通量高、快速、高效的方法。
2.本发明检测多种呼吸道病毒的方法中同一靶标设计了两类不同探针(靶标探针与捕获探针)，因此获得了双重的特异性，检测结果更准确，能够很好的避免假阳性和假阴性。本发明设计的捕获探针，灵敏性和特异性都极高，能实现绝大部分都与PCR中的靶标探针相结合，几乎不会与非靶标探针结合。
3.本发明的亲水改性芯片，经过亲水改性处理，使得核酸探针能够在电极表面高度覆盖度，从而增强检测信号；本发明的亲水改性芯片，在将核酸探针修饰到芯片之前，选用高盐的PB缓冲液作核酸探针的溶剂，能够很好的屏蔽探针携带的负电荷，减少自身的团聚，有利于探针的有效固定。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中修饰了A组PCR产物的芯片的电化学检测结果图。
图2为实施例1中修饰了B组PCR产物的芯片的电化学检测结果图。
图3为实施例1中修饰了C组PCR产物的芯片的电化学检测结果图。
图4为实施例1中修饰了D组PCR产物的芯片的电化学检测结果图。
图5为实施例2中修饰了总浓度为1*105拷贝/μL的A、B、C、D四组混合产物的芯片的电化学检测结果图。
图6为实施例2中修饰了总浓度为1*104拷贝/μL的A、B、C、D四组混合产物的芯片的电化学检测结果图。
图7为实施例2中修饰了总浓度为1*103拷贝/μL的A、B、C、D四组混合产物的芯片的电化学检测结果图。
图8为实施例2中修饰了总浓度为1*102拷贝/μL的A、B、C、D四组混合产物的芯片的电化学检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
实施例中，多重PCR扩增呼吸道病毒特异性靶基因的选择：流感病毒M1、NS1基因，冠状病毒N、R1a、RNAP基因，人偏肺病毒F基因，博卡病毒NS1基因，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)ORF1ab基因，腺病毒Hexon基因，呼吸道合胞病毒F基因，副流感病毒HN基因。在NCBI网站检索相应病毒的的基因序列，进行同源性比较，在对应特异性基因的高度保守区设计特异性引物、探针。
实施例中，阴性对照为高温高压无酶处理水，阳性对照为甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、II型、III型、IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒的阳性质粒样本。
实施例中，序列中R＝A或者G，Y＝C或者T，其中，当R＝A或者G时，其对应的引物或者探针呈现相同的技术效果；其中，当Y＝C或者T时，其对应的引物或者探针呈现相同的技术效果。
实施例中，所用引物与信号探针如表1所示：
表1
Figure BDA0003618482280000061
Figure BDA0003618482280000071
Figure BDA0003618482280000081
实施例中，所用捕获探针序列如表2所示，探针引物由生工生物工程有限公司合成：
表2
寡核苷酸名称 序列
CP-IVB 5`-(SH)3-TTTTTCTGCCCATTACTG-3
CP-HKU1 5`-(SH)3-TTTTTTCGCCATTGTATTA-3`
CP-NL63 5`-(SH)3-TTTTTAAAGTTCCTTGGAT-3`
CP-229E 5`-(SH)3-TTTTTGTTCTAAGCATCAT-3`
CP-PIV4 5`-(SH)3-TTTTTAGTTCGGAGCATAT-3`
CP-PIV3 5`-(SH)3-TTTTTATTACACGAAACTG-3`
CP-HBoV 5`-(SH)3-TTTTTCTGAACATAGAGTA-3`
CP-HMPV 5`-(SH)3-TTTTTATCAGATTGTGTCT-3`
CP-RSVA 5`-(SH)3-TTTTTCAATCGCACATTAT-3`
CP-RSVB 5`-(SH)3-TTTTTTTGTCGTATCAGAT-3`
CP-PIV2 5`-(SH)3-TTTTTGTTTGTTCTCCTAT-3`
CP-IVA 5`-(SH)3-TTTTTTTGAGAGCTTTGAT-3`
CP-SARS-CoV-2 5`-(SH)3-TTTTTTAATGTCGTTGCAT-3`
CP-HAdV 5`-(SH)3-TTTTTTGTCAATCGATTAT-3`
CP-PIV1 5`-(SH)3-TTTTTTTGTCCCATAAGT-3`
CP-OC43 5`-(SH)3-TTTTTTTATGGACCTGTTA-3`
实施例中，选用以下标准品：流感病毒甲型(IVA)、流感病毒乙型(IVB)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、人偏肺病毒(HMPV)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)、人腺病毒(HAdV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E，HCoV-OC43，HCoV-NL63，HCoV-HKU1)、博卡病毒(HBoV)的质粒。标准品由苏州金唯智生物科技有限公司合成，实施例中，使用Qubit3.0及Qubit dsDNA assay试剂盒对合成的质粒标准品进行定量，并换算为拷贝/μL。
用于呼吸道病毒检测的标准品序列如下：
IVA-M1|长度：758：
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCGTACCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGCACTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAAGGGATTTTAGGATTTGTATTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAGTGGAAACGGAGATCCAAACAACATGGACAGAGCAGTAAAACTGTAAGGAAGCTTAAAAGAGAAATAACATTCCATGGGGCAAAAGAGGTGGCACTCAGCTATTCCACTGGTGCACTAGCCAGCTGCATGGGACTCATATACAACAGAATGGGAACTGTTACAACCGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGCGCCACATGTGAACAGATTGCTGATTCCCAGCATCGGTCTCACAGGCAGATGGTGACAACAACCAACCCATTAATCAGACATGAAAACAGAATGGTATTAGCCAGTACCACGGCTAAAGCCATGGAACAGATGGCAGGATCGAGTGAGCAGGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTAGGGCTAGGCAGATGGTACAGGCAATGAGAACCATTGGGACCCACCCTAGCTCCAGTGCCGGTTTGAAAGATGATCTCCTTGAAAATTTACAGGCCTACCAGAAACGGATGGGAGTGCAAATGCAGCGATTCAAGTGA。
IVB-NP|长度：1027：
ATGGCGAACAACAACATGACCACAACACAAATTGAGGTGGGTCCGGGAGCAACCAATGCTACCATAAACTTTGAAGCAGGAATTCTGGAGTGCTATGAAAGGCTTTCATGGCAAAGAGCCCTTGACTACCCCGGTCAAGACCGCCTAAACAGACTAAAAAGAAAATTAGAGTCAAGAATAAAGACTCACAACAAAAGTGAGCCTGAAAGTAAAAGGATGTCCCTTGAAGAGAGAAAAGCAATTGGAGTAAAAATGATGAAAGTACTCCTATTTATGAATCCGTCTGCTGGAATTGAAGGGTTTGAGCCATACTGTATGAACAGTTCCTCAAATAGCAACTGTACGAAATACAATTGGACCGATTACCCCTCAACACCAGAGAGGTGCCTTGATGACATAGAGGAAGAACCAGAGGATGTTGATGGCCCAACTGAAATAGTATTAAGGGACATGAACAACAAAGATGCAAGGCAAAAGATAAAGGAGGAAGTAAACACTCAGAAAGAAGGGAAGTTCCGTTTGACAATAAAAAGGGATATGCGTAATGTATTGTCCTTGAGAGTGTTGGTAAATGGAACATTCCTCAAACACCCCAATGGATACAAGTCCTTATCAACTCTGCATAGATTGAATGCATATGACCAGAGTGGAAGGCTTGTTGCTAAACTTGTTGCCACTGATGATCTTACAGTGGAGGATGAAGAAGATGGCCATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGTCTCAATGAAGGACATTCAAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGGGAGTCTTATCCCAATTTGGTCAAGAGCACCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAATTAGATTGGTCACGGAAGAACTTTATCTTTTAAGTAAAAGAATTGATGATAACATACTATTCCACAAAACAATGATAGCTAACAGCTCCATAATAGCTGACATGGTTGTATCATTATCATTATTAGAAACATTGTATGAAATGAAGGATGTGGTTGAAGTGTACAGCAGGCAGTGCTTGTGA。
CoV OC43-N|长度：1345：
ATGTCTTTTACTCCTGGTAAGCAATCCAGTAGTAGAGCGTCCTCTGGAAATCGGTCTGGTAATGGCATCCTCAAGTGGGCCGATCAATCCGACCAGTTTAGAAATTTTCAAACCAGGGGTAGAAGAGCTCAACCCAAGCAAACTGCTACTTCTCAGCAACCATCAGGAGGGAATGTTGTACCCCACTATTCTTGGTTCTCTGGAATTACTCAGTTTCAAAAGGGAAAGGAGTTTGAGTTTGCAGAAGGACAAGGTGTGCCTATTGCACCAGGAGTCCCAGCTACTCAAGCTAAGGGGTACTGGTACAGACACAACAGACGTTCTTTTAAAACAGCCGATGGCAACCAGCGTCAACTGCTGCCACGATGGTATTTTTACTATCTGGGAACCGGACCGCATGCTAAAGACCAGTATGGCACCGATATTAACGGAGTCTACTGGGTCGCTAGCAACCAGGCTGATGTCAATACCCCGGCTGACATTGTCGATCGGGACCCAAGTAGCGATGAGGCTATTCCGACTAGGTTTCCGCCTGGCACGGTACTCCCTCAGGGTTACTATATTGAAGGCTCAGGAAGGTCTGCTCCTAATTCCAGATCTACTTCGCGCACATCCAGCAGAGCCTCTAGTGCAGGATCGCGTAGTAGAGCCAATTCTGGCAATAGAACCCCCACCTCTGGTGTAACACCTGACATGGCTGATCAAATTGCTAGTCTTGTTCTGGCAAAACTTGGCAAGGATGCCACCAAACCTCAGCAAGTAACTAAGCATACTGCCAAAGAAGTCAGACAGAAAATTTTGAATAAACCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAATAAACAATGCACTGTTCAGCAGTGTTTTGGTAAGAGAGGCCCTAATCAGAATTTTGGTGGTGGAGAAATGTTAAAACTTGGAACTAGTGACCCACAGTTCCCCATTCTTGCAGAACTCGCACCCACAGCTGGTGCGTTTTTCTTGATCAAAATTAGAGTTGGCCAAAGTGCAGAATTTATCTGGGAATCCTGATGAGCCTCAGAAGGATGTTTATGAATTGCGCTATAACGGCGCAATTAGGTTTGACAGTACACTTTCAGGCTTTGAGACCATAATGAAGGTGCTGAGTGAGAATTTGAATGCCTATCAACAACAAGATGGTATGATGAATATGAGTCCAAAACCACAGCGTCAGCGTGGTCATAAGAATGGACAAGGAGAAAATGATAATATAAGTGTTGCAGTGCCCAAAAGTCGCGTGCAGCAAAATAAGAGTATAGAGTTGACTGCAGAGGACATCAGCCTTCTTAAGAAGATGGATGAGCCCTTTACTGAAGACACCTCAGAAATATAA。
CoV 229E-N|长度：1169：
ATGGCTACAGTCAAATGGGCTGATGCATCTGAACCACAACGTGGTCGTCAGGGTAGAATACCTTACTCTCTTTATAGCCCTTTGCTTGTTGATAGTGAACAACCTTGGAAGGTGATACCTCGTAATTTGGTACCCATCAACAAGAAAGACAAAAATAAGCTTATAGGCTATTGGAATGTTCAAAAACGTTTCAGAACTAGAAAGGGCAAACGGGTGGATTTGTCACCCAAGTTACATTTTTATTATCTTGGCACAGGACCTCATAAAGATGCAAAATTTAGAGAGCGTGTTGAAGGTGTGTCTGGGTTGCTGTTGATGGTGCTAAAACTGAACCTACAGGTTACGGTGTTAGGCGCAAGAATTCAGAACCAGAGATACCACACTTCAATCAAAAGCTCCCAAATGGTGTTACTGTTGTTGAAGAACCTGACTCCCGTGCTCCTTCCCGTTCTCAGTCAAGGTCTCAGAGTCGCAGTCGTGGTGAATCCAAATCTCAATCTCGGAATCCTTCAAGTGACAGAAACCATAACAGTCAGGATGACATCATGAAGGCAGTCGCTGCGGCTCTTAAATCTTTAGGTTTTGACAAGCCTCAGGAAAAAGACAAAAAGTCAGCGAAAACGGGTACCCCTAAGCCTTCTCGTAATCAGAGTCCTGCTTCTTCTCAATCTGCTGCCAAGATTCTTGCTCGTTCTCAGAGTTCTGAAACAAAAGAACAAAAGCATGAAATGCAAAAGCCACGGTGGAAAAGACAGCCTAACGATGATGTGACATCTAATGTCACACAATGTTTTGGCCCCAGAGACCTTGACCACAACTTTGGAAGTGCAGGTGTTGTGGCCAATGGTGTTAAAGCTAAAGGCTATCCACAATTTGCTGAGCTTGTGCCGTCTACAGCTGCTATGCTTTTTGATAGTCACATTGTTTCCAAAGAGTCAGGCAACACTGTGGTCTTGACTTTCACCACTAGAGTGACTGTGCCCAAAGACCATCCACACTTGGGTAAGTTTCTTGAGGAATTAAATGCATTCACTAGAGAAATGCAACAACAGCCTCTTCTTAACCCTAGTGCACTAGAATTCAACCCATCCCAAACTTCACCTGCAACTGTTGAACCAGTGCGTGATGAAGTTTCTATTGAAACTGACATAATTGATGAAGTCAACTAA。
CoV NL63-R1a|长度：782：
CTGCTAATAATGCTGTCTATGATGGTGCTCGTTTATTTGCTTCAGATTTGTCTACTTTAGCTGTTACAGCTATTGTTGTAGTAGGTGGTTGTGTAACATCTAATGTTCCACCAATTGTTAGTGAGAAAATTTCTGTTATGGATAAACTTGATACTGGTGCACAAAAATTTTTCCAATTTGGTGATTTTGTTATGAATAACATTGTTCTGTTTTTAACTTGGTTGCTTAGTATGTTTAGTCTTTTACGTACTTCTATTATGAAGCATGATATTAAAGTTATTGCCAAGGCTCCTAAACGTACAGGTGTTATTTTGACACGTAGTTTTAAGTATAACATTAGATCTGCTTTGTTTGTTGTAAAGCAGAAGTGGTGTGTTATTGTTACTTTGTTTAAGTTCTTATTGTTATTATATGCTATTTATGCACTTGTTTTTATGATTGTGCAATTTAGTCCTTTTAATAGTCTTTTATGTGGTGACATTGTAAGTGGTTATGAAAAATCCACTTTTAATAAGGATATTTATTGTGGTAATTCTATGGTTTGTAAGATGTGTTTGTTTAGTTATCAAGAGTTTAATGATTTGGTTCATACTAGTCTTGTTTGGAAGCACATTCGTGATCCTATATTAATCAGTTTACAACCATTTGTTATACTTGTTATTTTGTTAATTTTTGGTAATATGTATTTGCGTTTTGGACTTTTATATTTTGTTGCACAATTTATTAGTACTTTTGGTTCTTTCTTAGGCTTTCATCAGAAACAGTGGTTTTTACATTTTGTG。
CoV HKU1-RNAP|长度：341：
CAACATGAATTTTGTTGTTCACATGGTGATAGATTTTATCGCCTTGCGAATGAATGTGCTCAAGTTTTGAGTGAAATAGTTATGTGTGGCGGTTGCTATTATGTTAAGCCTGGTGGTACTAGCAGTGGTGATGCAACTACTGCTTTTGCTAATTCTGTTTTTAATATATGTCAGGCTGTTACTGCTAACGTTTGTTCTCTTATGGCCTGTAATGGCCATAAGATTGAAGATTTAAGTATACGCAATTTACAAAAACGCTTATACTCTAATGTTTATCGTACAGATTATGTTGATTATACATTTGTTAATGAGTATTATGAATTTTTATGTAAGCATTTTAG。
HMPV-F|长度：1620：
ATGTCTTGGAAAGTGATGATTATCATTTCGTTACTCATAACACCTCAGCATGGACTAAAAGAAAGTTATTTAGAAGAATCATGTAGTACTATAACTGAAGGATATCTCAGTGTTTTAAGAACAGGTTGGTACACCAATGTCTTTACATTAGAAGTTGGTGATGTTGAAAATCTTACATGTACTGATGGACCTAGCTTAATCAAAACAGAACTTGACCTAACCAAAAGTGCTTTAAGAGAACTCAAAACAGTTTCTGCTGATCAGTTAGCGAGAGAAGAACAAATTGAAAATCCCAGACAATCAAGGTTTGTCCTAGGTGCAATAGCTCTTGGAGTTGCCACAGCAGCAGCAGTCACAGCAGGCATTGCAATAGCCAAAACTATAAGGCTTGAGAGTGAAGTGAATGCAATCAAAGGTGCTCTCAAAACAACCAATGAGGCAGTATCAACACTAGGGAATGGAGTGCGGGTCCTAGCCACCGCAGTAAGAGAGCTGAAAGAATTTGTGAGCAAAAACCTGACTAGTGCGATCAACAAGAACAAATGTGACATTGCTGATTTGAAGATGGCTGTCAGCTTCAGTCAGTTCAACAGAAGATTCCTAAATGTTGTGCGGCAGTTTTCAGACAATGCAGGGATAACACCGGCAATATCATTGGACCTGATGAATGATGCTGAGCTGGCCAGAGCTGTATCATACATGCCAACATCTGCAGGACAAATAAAACTAATGTTAGAGAACCGTGCAATGGTGAGGAGAAAAGGATTTGGAATCCTGATAGGGGTCTACGGAAGCTCTGTGATTTACATGGTCCAGCTGCCGATCTTTGGTGTCATAAATACACCTTGTTGGATAATCAAGGCAGCTCCCTCTTGTTCAGAAAAAGATGGAAATTATGCTTGCCTCCTAAGAGAGGATCAAGGGTGGTATTGTAAAAATGCAGGATCCACTGTTTACTACCCAAATGAAAAAGACTGCGAAACAAGAGGTGATCATGTTTTTTGTGACACAGCTGCAGGGATCAATGTTGCTGAGCAATCAAGAGAATGCAACATCAACATATCTACCACCAACTACCCATGCAAAGTCAGCACAGGAAGACACCCTATCAGCATGGTTGCACTATCACCTCTCGGTGCTTTGGTAGCTTGCTACAAAGGGGTTAGCTGCTCGACTGGCAGTAATCAGGTTGGAATAATCAAACAACTACCTAAAGGCTGCTCATACATAACTAACCAGGACGCAGACACTGTAACAATTGACAACACTGTGTATCAACTAAGCAAAGTTGAGGGTGAACAGCATGTAATAAAAGGGAGACCAGTTTCAAACAGTTTTGATCCAATCAGGTTTCCTGAGGATCAGTTCAATGTTGCGCTTGATCAAGTCTTTGAAAGCATTGAAAACAGTCAAGCACTAGTGGACCAGTCAAACAAAATCCTGAACAGTGCAGAAAAAGGAAACACTGGTTTCATTATTGTAATAATTTTGATTGCTGTTCTTGGGTTAACCATGATTTCAGTGAGCATCATCATCATAATCAAAAAAACAAGGAAGCCCGCAGGGGCACCTCCGGAGCTGAATGGTGTTACCAACGGCGGTTTTATACCGCATAGTTAG。
HBoV-NS1|长度：1920：
ATGGCTTTCAATCCTCCTGTGATTAGAGCTTTTTCTCAACCTGCTTTTACTTATGTCTTCAAATTTCCATATCCACAATGGAAAGAAAAAGAATGGCTGCTTCATGCACTTTTAGCTCATGGAACTGAACAATCTATGATACAATTAAGAAACTGCGCTCCTCATCCGGATGAAGACATAATCCGTGATGACTTGCTTATTTCTTTAGAAGATCGCCATTTTGGGGCTGTTCTCTGCAAGGCTGTTTACATGGCAACAACTACTCTCATGTCACACAAACAAAGGAATATGTTTCCTCGTTGTGACATCATAGTTCAGTCTGAGCTAGGAGAGAAAAACTTACACTGCCATATTATAGTTGGGGGAGAAGGACTAAGCAAGAGGAATGCTAAATCATCCTGTGCTCAGTTCTATGGTTTAATACTAGCTGAGATAATTCAACGCTGCAAATCTCTTCTGGCTACACGTCCTTTTGAACCTGAGGAGGCTGACATATTTCACACTCTAAAAAAGGCTGAGCGAGAGGCATGGGGTGGAGTTACTGGCGGCAACATGCAGATCCTTCAATATAGAGATCGCAGAGGAGACCTTCATGCACAAACAGTGGATCCTCTTCGCTTCTTCAAAAACTACCTTTTACCTAAAAATAGATGTATTTCATCTTACAGCAAACCTGATGTTTGTACTTCTCCTGACAACTGGTTCATTTTAGCTGAAAAAACTTACTCTCACACTCTTATTAACGGGCTGCCGCTTCCAGAACATTACAGAAAAAACTACCACGCAACCCTAGATAACGAAGTCATTCCAGGGCCTCAAACAATGGCCTATGGAGGACGTGGTCCGTGGGAACATCTTCCTGAGGTAGGAGATCAGCGCCTAGCTGCGTCTTCTGTTAGCACTACTTATAAACCTAACAAAAAAGAAAAACTTATGCTAAACTTGCTAGACAAATGTAAAGAGCTAAATCTATTAGTTTATGAAGACTTAGTAGCTAATTGTCCTGAACTACTCCTTATGCTTGAAGGTCAACCAGGAGGGGCACGCCTTATAGAACAAGTCTTGGGCATGCACCATATTAATGTTTGTTCTAACTTTACAGCTCTCACATATCTTTTTCATCTACATCCTGTTACTTCGCTTGACTCAGACAATAAAGCTTTACAGCTTTTGTTGATTCAAGGCTATAATCCTCTAGCCGTTGGTCACGCCCTGTGCTGTGTCCTGAACAAACAATTCGGGAAACAAAACACTGTTTGCTTTTACGGGCCTGCCTCAACAGGTAAAACAAATATGGCCAAGGCAATCGTCCAAGGGATTAGACTTTATGGGTGTGTTAATCATTTGAACAAAGGATTTGTATTTAATGACTGCAGACAACGCCTAGTTGTTTGGTGGGAGGAATGCTTAATGCACCAGGATTGGGTGGAACCTGCAAAGTGTATCTTGGGCGGGACAGAATGCAGAATTGACGTCAAGCATAGAGACAGTGTACTTTTAACTCAAACACCTGTAATTATATCCACTAACCACGATATCTACGCGGTTGTTGGTGGCAATTCTGTTTCTCATGTTCACGCGGCTCCATTAAAAGAAAGAGTGATTCAGCTAAATTTTATGAAACAACTTCCTCAAACATTTGGAGAAATCACTGCTACTGAGATTGCAGCTCTTCTACAGTGGTGTTTCAATGAGTACGACTGTACTCTGACAGGATTTAAACAAAAATGGAATTTAAATAAAATTCCAAACTCATTTCCTCTTGGGGTCCTTTGTCCTACTCATTCACAGGACTTTACACTTCACGAAAACGGATACTGCACTGATTGCGGTGGTTACCTTCCTCATAGTGCTGACAATTCTATGTACACTGATCGCGCAAGCGAAACTAGCACAGGAGACATCACACCAAGTAAGTAA。
RSVA-R|长度：1725：
ATGGAGTTGCCAATCCTCAAAACAAATGCTATTACCACAATCCTTGCTGCAGTCACACTCTGTTTTGCTTCCAGTCAAAACATCACTGAAGAATTTTATCAATCAACATGCAGTGCAGTTAGCAAAGGCTATCTTAGTGCTCTAAGAACTGGTTGGTATACTAGTGTTATAACTATAGAATTAAGTAATATCAAGGAAAATAAGTGTAATGGTACAGACGCTAAGGTAAAATTAATAAAACAAGAATTAGATAAATATAAAAATGCTGTAACAGAATTGCAGTTGCTCATGCAAAGCACACCAGCAGCCAACAGTCGAGCCAGAAGAGAACTACCAAGATTTATGAATTATACACTCAACAATACCAAAAACACCAATGCAACATTAAGTAAGAAAAGGAAAAGAAGATTTCTTGGATTTTTGTTAGGTGTTGGATCTGCAATCGCCAGTGGCATTGCCGTATCCAAGGTCCTGCACCTAGAAGGGGAAGTGAACAAAATCAAAAGTGCTCTACTATCCACAAACAAGGCTGTAGTCAGCTTATCTAATGGAGTCAGTGTCTTAACCAGCAAGGTGTTAGACCTCAAAAACTATATAGATAAACAGTTGTTACCTATTGTTAACAAGCAAAGCTGCAGCATATCAAACATTGAAACTGTGATAGAGTTCCAACAAAAGAACAACAGACTACTAGAGATTACCAGAGAATTTAGTGTTAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAGCACTTATATGTTAACTAATAGTGAGTTATTATCATTAATCAATGATATGCCTATAACAAATGATCAGAAAAAGTTAATGTCCAGCAATGTTCAAATAGTTAGACAGCAAAGTTACTCTATCATGTCAATAATAAAAGAGGAAGTCTTAGCATATGTAGTACAATTACCACTATATGGTGTAATAGATACTCCTTGTTGGAAACTACACACATCCCCTCTATGTACAACCAACACAAAGGAAGGATCCAACATCTGCTTAACAAGAACCGACAGAGGATGGTACTGTGACAATGCAGGATCAGTATCCTTTTTCCCACAAGCTGAAACATGTAAAGTTCAATCGAATCGGGTGTTTTGTGACACAATGCACAGTTTAACATTACCAAGTGAGGTAAATCTCTGCAACATTGACATATTCAACTCCAAATATGATTGCAAAATTATGACTTCAAAAACAGATGTAAGCAGCTCCGTTATCACATCTCTAGGAGCCATTGTGTCATGCTATGGCAAAACCAAATGTACAGCATCCAATAAAAATCGTGGGATCATAAAGACATTCTCTAACGGGTGTGATTATGTATCAAATAAGGGGGTGGATACTGTGTCTGTAGGTAATACATTATATTATGTAAATAAGCAAGAAGGCAAAAGTCTCTATGTAAAAGGTGAACCAATAATAAATTTCTATGATCCATTAGTGTTCCCCTCTGATGAATTTGATGCATCAATATCTCAAGTCAATGAGAAAATTAATCAGAGTCTAGCATTTATCCGTAAATCAGATGAATTATTACATAATGTAAATGCTGGTAAATCCACCACAAATATCATGATAACTACCATAATTATAGTAATTATAGTAATATTGTTAGCATTAATTGCAGTTGGACTGCTTCTATACTGCAAGGCCAGAAGCACACCAGTCACATTAAGTAAGGATCAACTGAGTGGTATAAATAACATTGCATTTAGTAACTGA。
RSVB-NP|长度：1176：
ATGGCTCTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACATTAAATAAGGATCAGCTGCTGTCATCCAGCAAATACACTATTCAACGTAGTACAGGAGATAATATTGACACTCCCAATTATGATGTGCAAAAACACCTAAACAAACTATGTGGTATGCTATTAATCACTGAAGATGCAAATCATAAATTCACAGGATTAATAGGTATGCTATATGCTATGTCCAGATTAGGAAGGGAAGACACTATAAAGATACTTAAAGATGCTGGATATCATGTTAAAGCTAATGGAGTAGATATAACAACATATCGTCAAGATATAAATGGAAAGGAAATGAAATTCGAAGTATTAACATTATCAAGCTTGACATCAGAAATACAAGTCAATATTGAGATAGAATCTAGAAAGTCCTACAAAAAAATGCTAAAAGAGATGGGAGAAGTGGCTCCAGAATATAGGCATGATTCTCCAGACTGTGGGATGATAATACTGTGTATAGCTGCCCTTGTAATAACCAAATTAGCAGCAGGAGATAGATCAGGTCTTACAGCAGTAATTAGGAGGGCAAACAATGTCTTAAAAAACGAAATAAAACGCTACAAGGGCCTAATACCAAAAGACATAGCCAACAGTTTTTATGAAGTGTTTGAAAAATACCCTCATCTTATAGATGTTTTTGTGCACTTTGGCATAGCACAATCATCCACAAGAGGGGGCAGTAGAGTTGAAGGAATCTTTGCAGGATTGTTTATGAATGCCTATGGTTCAGGACAAGTAATGCTAAGATGGGGAGTTTTAGCCAAATCTGTAAAAAATATCATGCTAGGACATGCTAGTGTCCAAGCAGAAATGGAGCAAGTTGTGGAAGTCTATGAGTATGCACAGAAGTTGGGAGGAGAAGCTGGTTTCTACCATATATTGAACAATCCAAAAGCATCATTGCTGTCATTAACTCAATTTCCTAACTTCTCAAGTGTGGTCCTAGGCAATGCAGCAGGTCTAGGCATAATGGGAGAGTATAGAGGTACACCAAGAAACCAAGATCTCTATGATGCAGCCAAAGCATATGCAGAGCAACTCAAAGAAAATGGAGTAATAAACTACAGTGTATTAGACTTAACAACAGAAGAATTGGAAGCCATAAAGCATCAACTCAACCCCAAAGAAGATGACGTAGAGCTTTAA。
PIV1-HN|长度：1838：
ATGGCTGAAAAAGGGAAAACAATTAGTTCATATTGGTCTACAACCCGAAATGATAACTCCACGGTAAATACACACATTAACATACCAGCAGGAAGGACATACATCTGGCTACTGATTGCAACAACAATGCATGCAGCACTGTCCCTCATTATCATGATACTATGCATTGACCTAATTATAAAACAAGACACTTGTATGAAAACAAACATCATGACAGTATCCTCCGTAAACGAGAGTGCCAAAACAATCAAAGAGACAATCACAGAATTAATCAGACAAGAAGTGATATCAAGGACTATAAACATACAAAGTTCAGTACAAAGCGGGATCCCAATATTGTTAAACAAGCAAAGCAGAGATCTCACACAATTAATAGAGAAGTCATGCAACAAACAGGAACTGGCCCAGATATGCGAGAACACCATTGCTATTCACCATGCAGACGGAATAACCCCTCTGGACCCACATGATTTCTGGAGATGTCCTGTAGGAGAACCCCTACTGAGCAACAACCCCAATATCTCATTATTACCTGGACCAAGTCTACTTTCTGGATCTACCACAATTTCAGGATGTGTTAGACTACCTTCATTATCAATTGGTGATGCAATATATGCGTATTCATCAAACTTAATCACTCAAGGATGTGCAGATATAGGGAAGTCATATCAGGTTTTACAATTAGGTTACATATCTCTAAATTCAGATATGTATCCTGACTTAAACCCGGTAGTTTCTCATACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATGTTCTGTAATAGCTGCAGGAACAAGGGGTTATCAGTTATGCTCCTTGCCCACTGTGAATGAGACTACAGATTATTCGAGTGAAGGTATAGAGGACTTAGTATTTGACATATTAGATCTCAAAGGAAAGACAAAATCTCATCGATACAAAAATGAAGATATAACTTTTGACCATCCTTTTTCTGCAATGTATCCTAGTGTAGGAAGTGGGATAAAGATTGAAAATACACTCGTTTTTCTGGGATACGGTGGCTTAACAACTCCGCTTCAAGGCAATACCAAGTGTGTGATAAAAAGTTGTCCTAATGTTAATCAGAGTGTTTGCAATGATGCTCTTAAGATAACTTGGCTAAAGAAAAGACAAGTTGTCAACGTCTTAATTCATATTAATAATTATTTATCTGATAGGCCAAAGATTGTTGTCGAGACTATTCCAATAACTCAAAACTATCTAGGTGCCGAAGGGAGGCTGCTTAAACTAGGCAAAAAGATCTACATATATACTAGATCCTCAGGTTGGCACTCCAACCTGCAAATAGGATCAATAGACATCAACAAACCCATGACCATCAATTGGGCACCTCACAAAGTCCTGTCACGACCAGGAAACCCAGACTGCAACTGGTTCAACAAATGTCCGAGAGAATGCATATCAGGTGTATACACTGATGCATATCCACTATCCCCTGATGCATTCAATGTTGCTACAACCACACTATACGCAAATACATCGCGTGTTAATCCTACCATAATGTACTCAAGTACCTCAAAAATCATCAACATGCTAAGACTCAAAAATGGACAATTAGAAGCAGCATACACTACTACATCATGCATCACTCACTTCGGAAAGGGCTACTGCTTCCACATTGTTGAAATCAACCAAACCAGCCTTAATACCTTACAACCTATGTTGTTCAAGACAAGTATCCCTAAAATATGTAAAGTCACATCTTGAGCTGATCAAGACCTAATACTATATCAATTATTTTAAAATCAGATATAATATATAAAAATTTTAAAATAAGACATGAATAGATATTTATATGACAAATAGAATAAGAAAAA。
PIV2-HN|长度：1716：
ATGGAAGATTACAGCAATCTATCTCTTAAATCAATTCCTAAAAGGACATGTAGAATCATTTTCCGAACTGCCACAATTCTTGGCATATGCACATTAATTGTGCTATGTTCAAGTATTCTTCATGAGATAATTCATCTTGATGTTTCCTCTGGTCTTATGAATTCTGATGATTCACAGCAAGGCATTATTCAGCCTATCATAAAATCATTAAAATCATTGATTGCTTTGGCCAACCAGATTCTATATAATGTTGCAATACTAATTCCTCTTAAAATTGACAGTATCGAAACTGTAATACTCTCTGCTTTAAAAGATATGCACACCGGGAGTATGTCCAATGCCAACTGTACACCAGGAAATCTGCTTCTGCATGATGCAGCATACATCAATGGAATAAACAAATTCCTTGCACTTGAATCATACAATTGGACGCCTAAATATGGACCTCTCCTAAATATACCCAGCTTTATCCCCTCAGCAACATCTCCCCATGGGTGTACTAGAATACCATCATTTTCACTCATCAAGACCCATTGGTGTTACACTCACAACGTAATACTTGGAGATTGTCTTGATTTCACGGCATCTAACCAGTATTTATCAATGGGGATAATACAACAATCTGCTGCAGGGTTTCCAATCTTCAGGACTATGAAAACCATTTACCTAAGTGATGGAATCAATCGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACCAGGAGGCTGTGTCTTATATTGCTATGTAGCTACAAGGTCTGAAAAAGAAGATTATGCCACGACTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTATTATTATAATGATACCTTTATTGAAAGAGTCATATCTCTTCCAAATACAACAGGGCAGTGGGCCACAATCAACCCTGCAGTCGGGAGCGGGATCTATCATCTAGGCTTTATCTTATTTCCTGTATATGGTGGTCTCATAAATGGGACTACTTCTTACAATGAGCAGTCCTCACGCTATTTTATCCCAAAACATCCCAACATAACTTGTGCCGGTAACTCCAGCAAACAGGCTGCAATAGCACAGAGTTCCTATGTCATCCGTTATCACTCAAACAGGCTGATTCAGAGTGCTGTTCTCATTTGTCCATTGTCTGACATTCACACAGAAGAGTGTAATCTAGTTATGTTTAACAATTCCCAAGTCATGATGGGTGCAGAAGGTAGGCTCTATGTTATTGGTAATAATTTGTATTATTATCAACGCAGTTCCTCTTGGTGGTCTGCATCGCTCTTTTACAGGATCAATACAGATTTTTCTAAAGGAATTCCTCCGATCATTGAGGCTCAATGGGTACCGTCCTACCAAGTTCCTCGTCCTGGAGTCATGCCATGCAATGCAACAAGTTTTTGCCCTGCTAATTGCATCACAGGGGTGTACGCAGATGTGTGGCCGCTTAATAATCCAGAACTCATGTCACGTAATGCTCTGAACCCCAACTATCGATTTGCTGGAGCCTTTCTCAAAAATGAGTCCAACCGAACTAATCCCACATTCTACACTGCATCGGCTAACTCCCTCTTAAATACTACCGGATTCAACAACACCAACCACAAAGCAGCATATACATCTTCAACCTGCTTTAAAAACACTGGAACCCAAAAAATCTATTGTTTAATAATAATTGAAATGGGCTCATCTCTTTTAGGGGAGTTCCAAATAATACCATTTTTAAGGGAACTAATGCTTTAA。
PIV3-HN|长度：581：
AATGACAATAGAAAGTCATGTTCTCTAGCACTCCTAAATACAGATGTATATCAACTGTGTTCAACTCCCAAAGTTGATGAAAGATCAGATTATGCATCATCAGGCATAGAAGATATTGTACTTGATATTGTCAATTATGATGGCTCAATCTCAACAACAAGATTTAAAAATAATAATATAATTTTTGATCAACCATATGCGGCATTATACCCATCTGTTGGACCAGGGATATACTACAAAGGCAAAATAATATTTCTTGGGTATGGAGGTCTTGAACATCCAATAAATGAGAATGCAATCTGTAACACAACTGGGTGTCCTGGGAAAACACAGAGAGACTGCAATCAGGCATCTCATAGTCCATGGTTTTCAGATAGAAGGATGGTCAACTCCATTATTGTTGTTGACAAGGGTTTAAACTCAGTTCCAAAATTGAAGGTATGGACGATATCCATGAGACAAAATTACTGGGGATCAGAAGGAAGATTACTTCTACTAGGTAACAAGATCTACATATATACAAGATCTACAAGTTGGCACAGCAAGTTACAATTAGGAATAATTGATATTACTGACTACAG。
PIV4-HN|长度：1740：
ATGCAAGACTCACATAGTAATACACAAATATTCAATCAGGCAAATTCAATGGTGAAAAGAACATGGAGATTACTATTCCGAATTGCAACCTTAATATTACTTGTCTCAATATTTGTGTTATCACTCATAATTATATTACAGTCAACACCAGGGAATTTGCAAAACGATATTAATATAATTAGAAGGGAGCTCAATGAACTTATGGAGAATTTTGAAACTACGTCTAAATCACTGTTAAGCGTATCAAATCAAATTACCTACGATGTATCAGTGCTCACTCCTATAAGACAAGAAGCCATTGAAACAAACATCATTTCAAAAATAAAAGATCATTGCAAAGATAGAGTAATTAAAGAAGGAGGAACTTGTACATTGAATCGCAGCCCTTTGCATGATGTCTCCTTTCTAAAGGGAATCAACAAGTTCTATTTCACATATAAAGATAAGATGCAAATTAAGTTCAAATCATTATTAGATTATCCCAATTTTATTCCAACTGCTACAACTCCTCACGGATGCATTCGAATTCCATCATTCTCTTTAGGTCAAACCCATTGGTGTTATACCCACAATATAATCCTACAAGGATGTGCAGACACTGCACATAGTAATCAATATGTATCACTAGGAACCTTACAAGTCTTAAAAAATGGTGACCCTTATTTTAAAGTCGAGCATAGTCATTATTTAAATGACGGGAAGAATCGAAAGAGTTGTTCAGTGGTTGCTGTCCCCGATGGATGTCTGCTGTATTGTGTGATTATGACAAAAAATGAGACAGAGAATTTCAAAGATCCTCAATTGGCAACACAATTACTCACATACATATCATATAATGGTACCATTAAAGATCGTATAATAAATCCACCAGGATCATCCAGAGACTGGGTTCATATCGCACCAGGGGTAGGCTCAGGCATTTTGTATGCAAATTACATTATCTTTCCTTTGTATGGGGGTCTCACAGAAAAATCAGTGATACATAATAACCAATCAGAGAAATATTTTTTCCCTAATTCGACCAAATTGCAGTGTCGTAACAGCACTGTGGAAAAAATAAAAGGAGCAAAAGATTCATACACAATAACTTACTTCTCAGGGAGACTTATACAGAGTGCATTTTTGGTTTGTGATCTAAGAAGATTTCTTTCTGAAGATTGTGAAATTTTAATTCCTAGTAATGATTACATGATGGTCGGTGCAGAGGGTCGACTATATAATATTGAGAACAACATATTTTATTATCAGAGAGGATCCAGCTGGTGGCCTTATCCGAGCCTCTATAGAATTAGATTGAACCTTAGTAATAAATATCCTAAAATAACTGAAATTAAATTTACAAAGATTGAAATCGCCCCAAGACCAGGTAACAAAGATTGTCCAGGGAATAAAGCTTGCCCAAAAGAATGTATAACAGGAGTCTATCAAGATACATGGCCACTAAGTTATCCTAATACTGCATTCCCACACTTGAAACGAGCGTATTATACAGGTTTTTACCTCAATAATTCGCTCGAAAGACGCAATCCAACGTTTTATACTGCAGACAATCTGGACTACCATCAACAGGAAAGATTAGGCAAATTCAATCTTACTGCTGGATACTCTACTACAACCTGCTTTAAACAGACTACCACTGCGAGATTATACTGTCTCTACATAATTGAAGTGGGTGATTCAGTCATTGGGGACTCTCAGATCAACCCGTTTTTACGCTTAATAGATCAGACTGTTAATTAA。
HAdV Hexon|长度：420：
ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGGTCTGGTGCAGTTCGCCCGTGCAACAGACACCTACTTCAGTATGGGGAACAAATTTAGAAACCCCACAGTGGCGCCCACCCACGATGTGACCACCGATCGTAGCCAGCGCCTGATGCTGCGCTTCGTGCCCGTTGACCGGGAAGACAATACCTACTCTTACAAAGTTCGCTACACGCTGGCTGTAGGCGACAACAGAGTGCTTGACATGGCCAGCACATTCTTTGACATTCGGGGGGTGCTTGATAGAGGTCCTAGCTTCAAGCCATATTCCGGCACAGCTTACAATTCACTCGCTCCTAAGGGCGCGCCCAATACATCTCAGTGGATAGTTACAACGAAT。
SARS-CoV-2ORF1ab|长度：319：
GTTGTCTGTACTGCCGTTGCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGATTTTGTGACTTAAAAGGTAAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCTAATGACCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAACGGGTTTGCGGTGTAAGTGCAGCCCGTCTTACACCGTGCGGCACAGGCACTAGTACTGATGTCGTATACAGGGCTTTTGACATCTACAATGAT。
实施例中芯片在修饰上PCR扩增产物之前，皆作了亲水改性处理，亲水改性处理包括以下步骤：
(1)取一块芯片用无水乙醇(AR，≥99.7％)均匀冲洗表面；
(2)将冲洗后的芯片放置于100mL烧杯中，加50mL丙酮(AR，≥99.5％)静置浸泡3分钟，结束后更换丙酮溶液再次浸泡3分钟；
(3)丙酮浸泡结束，将芯片放置在100mL烧杯中加50mL无水乙醇静置浸泡5分钟；
(4)乙醇浸泡结束，用氮气将芯片吹干，放置在紫外-臭氧清洗机(型号：LXY-PL17-110)中处理15分钟；
(5)紫外-臭氧结束后，再次将芯片在50mL的无水乙醇中静置浸泡5分钟，结束后用氮气吹干待下一步使用。
实施例中，采用打印机将探针修饰到芯片上，探针的打印条件60％湿度，25℃环境下；使用仪器M2-Automation iTWO-300；单点打印体积10nL。
实施例中，电化学测试所用仪器为安序源生物科技(深圳)有限公司开发仪器EL100；方法为方波伏安法；扫面范围：0.1V-1.1V；频率为500Hz；测试溶液为：pH＝8.0，20mMTris-Hcl+0.5M NaCl。
实施例1
取含有以下病毒的检测样本：甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒，分组进行的多重PCR扩增反应。
其中Tube 1包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43上下游引物及探针；
Tube 2包括副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)上下游引物及探针；
Tube 3包括呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E上下游引物及探针；
Tube 4包括博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)、副流感病毒I型(PIV1)上下游引物及探针。具体反应体系如下：
A组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 1 2.5μl
待测模板 16μl(每种模板各1ul)
B组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 2 2.5μl
待测模板 16μl(每种模板各1ul)
C组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 3 2.5μl
待测模板 16μl(每种模板各1ul)
D组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 4 2.5μl
待测模板 16μl(每种模板各1ul)
上述多重PCR反应参数的设置为：逆转录：50℃、15min，热启动：95℃、2min30s，然后进行40个循环的反应，每个循环反应的条件为95℃反应5s，55℃反应40s，接着进行4℃冷却。经过多重PCR反应，得到实施例1的PCR扩增产物A-D。
将上述PCR扩增产物A-D加载到芯片上，进行电化学检测。其中，芯片封装有微流控装置用于负载混合溶液，芯片与溶液接触用于捕获溶液中的目标探针。
实施例2
取含有以下病毒的检测样本(每个样板浓度为1*105、1*104、1*103、1*102)：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43，进行多重PCR扩增反应，每个模板浓度进行一次反应，共4次反应。
其中，Tube 1包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43上下游引物及探针；
Tube 2包括副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)上下游引物及探针；
Tube 3包括呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E上下游引物及探针；
Tube 4包括博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)、副流感病毒I型(PIV1)上下游引物及探针。具体反应体系如下：
A组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 1 2.5μl
待测模板 4μl(每种模板各1ul，)
去离子水 12μl
取含有以下病毒的检测样本(每个样板浓度为1*105、1*104、1*103、1*102)：副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)，进行多重PCR扩增反应，每个模板浓度进行一次反应，反应体系如下：
B组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 2 2.5μl
待测模板 4μl(每种模板各1ul)
去离子水 12μl
取含有以下病毒的检测样本(每个样板浓度为1*105、1*104、1*103、1*102)：呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E，进行多重PCR扩增反应，每个模板浓度进行一次反应，反应体系如下：
C组：AK Taq(含有dNTP和UDG) 1.5μl
5×AK RT缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 5μl
引物预混液Tube 3 2.5μl
待测模板 4μl(每种模板各1ul)
去离子水 12μl
取含有以下病毒的检测样本(每个样板浓度为1*105、1*104、1*103、1*102)：博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)、副流感病毒I型(PIV1)，进行多重PCR扩增反应，每个模板浓度进行一次反应，反应体系如下：
Figure BDA0003618482280000151
Figure BDA0003618482280000161
上述多重PCR反应参数的设置为：逆转录：50℃、15min，热启动：95℃、2min30s，然后进行40个循环的反应，每个循环反应的条件为：95℃反应5s，55℃反应40s，接着进行4℃冷却。经过多重PCR反应，得到实施例2的PCR扩增产物A-D。
将新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43的质粒标准品稀释至1*105、1*104、1*103、1*102拷贝/μL，并使用实施例2中A组多重PCR反应体系进行反应；
将副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)的质粒标准品稀释至1*105、1*104、1*103、1*102拷贝/μL，并使用实施例2中B组多重PCR反应体系进行反应；
呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E的质粒标准品稀释至1*105、1*104、1*103、1*102拷贝/μL，并使用实施例2中C组多重PCR反应体系进行反应；
博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)、副流感病毒I型(PIV1)的质粒标准品稀释至1*105、1*104、1*103、1*102拷贝/μL，并使用实施例2中D组多重PCR反应体系进行反应。将A、B、C、D四组PCR产物混匀后，得到混合有A、B、C、D四组PCR产物的混合溶液，将其加载到芯片上，进行电化学检测。其中，芯片封装有微流控装置用于负载混合溶液，芯片与溶液接触用于捕获溶液中的目标探针。
性能测试：
实施例1的A-D组的多重PCR电化学检测结果与结果分析：
分别取1μl的1*105拷贝/μL的甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒的质粒标准品混匀后与实施例1中的A组进行反应，通过电化学检测结果见图1。检测结果表明只有新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、流感病毒甲型(IVA)、副流感病毒III型(PIV3)、冠状病毒HCoVOC43为阳性，其它病毒与反应体系中的引物不进行非特异性扩增为阴性，无任何非特异性扩增。
分别取1μl的1*105拷贝/μL的甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒的质粒标准品混匀后与实施例1中的B组进行反应，通过电化学检测结果见图2。检测结果表明只有副流感病毒IV型(PIV4)、冠状病毒(HCoV-HKU1)、流感病毒乙型(IVB)、人偏肺病毒(HMPV)为阳性，其它病毒与反应体系中的引物不进行非特异性扩增为阴性。
分别取1μl的1*105拷贝/μL的甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒的质粒标准品混匀后与实施例1中的C组进行反应，通过电化学检测结果见图3。检测结果表明只有呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、副流感病毒II型(PIV2)、冠状病毒HCoV-229E为阳性，其它病毒与反应体系中的引物不进行非特异性扩增为阴性。
分别取1μl的1*105拷贝/μL的甲乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III型、副流感病毒IV型、人腺病毒、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1)、博卡病毒的质粒标准品混匀后与实施例1中的D组进行反应，通过电化学检测结果见图4。检测结果表明只有博卡病毒(HBoV)、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒(HAdV)、副流感病毒I型(PIV1)为阳性，其它病毒与反应体系中的引物不进行非特异性扩增为阴性。
上述结果表明本发明中设计的16组引物均具有良好的特异性，且阴性对照无扩增，引物与引物之间无交叉干扰，可用于后续的多重PCR反应。
实施例2的多重PCR电化学检测结果与结果分析：
A、B、C、D四组(模板浓度分别为1*105、1*104、1*103、1*102拷贝/μL)多重PCR反应的产物混匀后经电化学检测的结果分别如图5、图6、图7、图8所示，由图可知，本发明所涉及的16种呼吸道病毒模板均为阳性，说明此电化学检测方法反应灵敏度高，可以同时检测多种呼吸道病毒。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 深圳清华大学研究院
安序源生物科技（深圳）有限公司
<120> 一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagacaagac caatyctgtc acctct 26
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcattytgga yaaarcgtct a 21
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgatcttac agtggaggat gaaga 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgaattggct ttgratgtcc tt 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccttgcgaa tgaatgtgct 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcatcacca ctgctagtac c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
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<400> 7
cgatgaggct attccgacta ggt 23
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<211> 27
<212> DNA
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<400> 8
ccttcctgag ccttcaatat agtaacc 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgtacttct attatgaagc atgatattaa 30
<210> 10
<211> 30
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<400> 10
agcagatcta atgttatact taaaactacg 30
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 11
cagtcaaatg ggctgatgca 20
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaagggctat aaagagarta aggtattct 29
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtragcagc tcygttatca ca 22
<210> 14
<211> 27
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<400> 14
cccttatttg atacataatc acacccg 27
<210> 15
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<400> 16
tattgacttg tatttctgat gtcaagc 27
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcaggactat gaaaacyatt tacct 25
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ccagggatat aytayaaagg caaaa 25
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ggtttctaaa yttgttcccc akactga 27
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catgaaggtc tcctctgcga t 21
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<211> 14
<212> DNA
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<400> 30
cyagcctgcg tggc 14
<210> 31
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgattgtgc atcagctga 19

Claims (10)

1.一种检测多种呼吸道病毒的引物对组，其特征在于：所述引物对组包括以下引物对中的至少两种：
第一引物对：所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
第二引物对：所述第二引物对包括如SEQ ID NO.3所示的正向引物和如SEQ ID NO.4所示的反向引物；
第三引物对：所述第三引物对包括如SEQ ID NO.5所示的正向引物和如SEQ ID NO.6所示的反向引物；
第四引物对：所述第四引物对包括如SEQ ID NO.7所示的正向引物和如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
第五引物对：所述第五引物对包括如SEQ ID NO.9所示的正向引物和如SEQ ID NO.10所示的反向引物；
第六引物对：所述第六引物对包括如SEQ ID NO.11所示的正向引物和如SEQ ID NO.12所示的反向引物；
第七引物对：所述第七引物对包括如SEQ ID NO.13所示的正向引物和如SEQ ID NO.14所示的反向引物；
第八引物对：所述第八引物对包括如SEQ ID NO.15所示的正向引物和如SEQ ID NO.16所示的反向引物；
第九引物对：所述第九引物对包括如SEQ ID NO.17所示的正向引物和如SEQ ID NO.18所示的反向引物；
第十引物对：所述第十引物对包括如SEQ ID NO.19所示的正向引物和如SEQ ID NO.20所示的反向引物；
第十一引物对：所述第十一引物对包括如SEQ ID NO.21所示的正向引物和如SEQ IDNO.22所示的反向引物；
第十二引物对：所述第十二引物对包括如SEQ ID NO.23所示的正向引物和如SEQ IDNO.24所示的反向引物；
第十三引物对：所述第十三引物对包括如SEQ ID NO.25所示的正向引物和如SEQ IDNO.26所示的第一反向引物或者如SEQ ID NO.27所示的第二反向引物；
第十四引物对：所述第十四引物对包括如SEQ ID NO.28所示的正向引物和如SEQ IDNO.29所示的反向引物；
第十五引物对：所述第十五引物对包括如SEQ ID NO.30所示的正向引物和如SEQ IDNO.31所示的反向引物；
第十六引物对：所述第十六引物对包括如SEQ ID NO.32所示的正向引物和如SEQ IDNO.33所示的反向引物。
2.根据权利要求1所述的引物对组，其特征在于：所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、流感病毒甲型、副流感病毒III型、冠状病毒HCoVOC43、副流感病毒IV型、冠状病毒、流感病毒乙型、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒II型、冠状病毒HCoV-229E、博卡病毒、冠状病毒HCoV-NL63、人腺病毒和副流感病毒I型中的至少两种。
3.一种检测多种呼吸道病毒的信号探针，其特征在于：所述信号探针包括以下信号探针中的至少两种：
IVA：5’-Fc-ATCAAAGCTCTCAAACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGA-3’；
IVB：5’-Fc-CAGTAATGGGCAGTATGGCCATCGGATCCTCAAYTCACTCT-3’；
HCOV-HKU1：5’-Fc-GGCTGATACGACAATGAGTGAAATAGTTATGTGTGGCGG-3’；
HCOV-OC43：5’-Fc-ACAGCGAGTCTTTTCCGCCTGGCACGGTACTCC-3’；
HCOV-NL63：5’-Fc-GTGCTCCGAACTATTGCCAAGGCTCCTAAACGTACAGGT-3’；
HCOV-229E：5’-Fc-CCAAGTCATTGACGCCCTGACGACCACGTTGTGGTTC-3’；
RSVA：5’-Fc-AACGATCTCTTGGGCTAGGAGCCATTGTGTCATGCTAT-3’；
RSVB：5’-Fc-ACTTATGGGACAACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATG-3’；
PIV1：5’-Fc-ACTTATGGGACAACCTATGACATCAACGACAACAGGAAATCATG-3’；
PIV2：5’-Fc-ATAGGAGAACAAACATGGAATCAATCGCAAAAGCTGT-3’；
PIV3-1：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGATGTTCAAGACCTCCATACCCGA-3’；
PIV3-2：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGATGTTCAAGACCTCCATATCCGAG-3’；
PIV3-3：5’-Fc-CAGTTTCGTGTAATTGGGTGTTCAAGACCTCCATATCCGA-3’；
PIV4：5’-Fc-ATATGCTCCGAACTTGGGCAAGCYTTATTYCCTGGACAATCTTT-3’；
HAdV：5’-Fc-ATAATCGATTGACATTCGCCCGTGCAACAGACACCT-3’；
HBoV：5’-Fc-TACTCTATGTTCAGAACTCCACCCCATGCCTCTCGCTCA-3’；
HMPV：5’-Fc-AGACACAATCTGATATGTTGTGCGGCARTTTTCAGACAAT-3’；
SARS-CoV-2：
5’-Fc-ATGCAACGACATTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’；
其中，R＝A或者G，Y＝C或者T。
4.一种检测多种呼吸道病毒的捕获探针，其特征在于：所述捕获探针包括以下捕获探针中的至少两种：
CP-IVB：5`-(SH)3-TTTTTCTGCCCATTACTG-3`；
CP-HKU1：5`-(SH)3-TTTTTTCGCCATTGTATTA-3`；
CP-NL63：5`-(SH)3-TTTTTAAAGTTCCTTGGAT-3`；
CP-229E：5`-(SH)3-TTTTTGTTCTAAGCATCAT-3`；
CP-PIV4：5`-(SH)3-TTTTTAGTTCGGAGCATAT-3`；
CP-PIV3：5`-(SH)3-TTTTTATTACACGAAACTG-3`；
CP-HBoV：5`-(SH)3-TTTTTCTGAACATAGAGTA-3`；
CP-HMPV：5`-(SH)3-TTTTTATCAGATTGTGTCT-3`；
CP-RSVA：5`-(SH)3-TTTTTCAATCGCACATTAT-3`；
CP-RSVB：5`-(SH)3-TTTTTTTGTCGTATCAGAT-3`；
CP-PIV2：5`-(SH)3-TTTTTGTTTGTTCTCCTAT-3`；
CP-IVA：5`-(SH)3-TTTTTTTGAGAGCTTTGAT-3`；
CP-SARS-CoV-2：5`-(SH)3-TTTTTTAATGTCGTTGCAT-3`；
CP-HAdV：5`-(SH)3-TTTTTTGTCAATCGATTAT-3`；
CP-PIV1：5`-(SH)3-TTTTTTTGTCCCATAAGT-3`；
CP-OC43：5`-(SH)3-TTTTTTTATGGACCTGTTA-3`。
5.如权利要求1所述的引物对组或权利要求3所述的信号探针或权利要求4所述的捕获探针在制备检测多种呼吸道病毒产品中的应用。
6.一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对组或者所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对组，还包括权利要求3所述的信号探针和/或权利要求4所述的捕获探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于多重不对称PCR反应的反应体系。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述用于多重不对称PCR反应的反应体系包括PCR反应预混液和病毒标准品，所述PCR反应预混液包括热启动AK Taq DNA聚合酶和反应缓冲液，所述热启动AK Taq DNA聚合酶包括dNTP和UDG。
9.一种生物芯片，其特征在于：包括亲水改性芯片与权利要求1所述的引物对组，权利要求1所述的引物对组修饰于所述亲水改性芯片的固相载体上。
10.一种如权利要求9所述的生物芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
用第一有机试剂清洗芯片，将芯片置于臭氧环境中，以紫外光照射，再将芯片置于第二有机试剂浸泡，得到亲水改性芯片；所述第一有机试剂与所述第二有机试剂独立选自乙醇和丙酮溶液中的至少两种；
将权利要求1所述的引物对组固载于所述亲水改性芯片的固相载体上。
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