CN110951918A

CN110951918A - 一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110951918A
Application number: CN201911314602.3A
Authority: CN
Inventors: 李先强; 姜昕; 陈巨; 黄永伟
Original assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Current assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110951918B

Abstract

本发明公开了一种基于RNA恒温扩增‑金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使甲、乙型流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

Description

一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。

背景技术

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为18个H亚型(H1-H18)和11个N亚型(N1-N11)，目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亚型有感染人的报道。由于编码HA 和(或)NA的核苷酸序列容易发生突变，致使HA和(或)NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的改变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。按照流行特点，造成人间流感流行的流感病毒可区分为季节性流感病毒和新型甲型流感病毒。季节性流感病毒通常在年度间发生小范围的基因变异，这种基因变异会导致微小的抗原性改变，称为抗原漂移(antigenic drift)。因此，季节性流感病毒虽具有年度特异性且抗原性的改变使感染者不易获得持久免疫力，但传播范围通常局限于较小的人群范围，一般不会造成太高的发病率和死亡率，易感人群多为老年人(>65岁)和婴幼儿(<6 岁)。在过去的几十年中，季节性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亚型。近年来，新型甲型流感病毒亚型暴发流行的案例时有发生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感(H5亚型) 病毒的病例时有报道，禽类甲型H5N1亚型流感病毒被认为具有造成人间大范围流感流行的潜力。新型甲型流感病毒通常由于基因的节段性重组所致，这种大范围的基因改变易导致病毒抗原特性的重大改变，称为抗原转变(antigenic shift)。新型甲型H1N1流感病毒(2009)即同时包含了禽流感、猪流感和人季节性流感的基因片段从而导致病毒在抗原水平发生了明显改变。由于抗原性的明显改变以及可能由此造成的病毒毒力的增强，病毒的传染性和致病严重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的发病率和死亡率。

流感病毒传播途径主要以空气飞沫传播为主，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断。现在常用的甲乙型流感病毒流核酸检测都是基于 RT-PCR的方法，这些方法需要复杂的RNA提取过程，特殊的PCR扩增条件，专门的实验室和荧光定量PCR仪，而且在检测过程中极易产生污染。因此在RNA 恒温扩增技术的基础上，结合胶体金层析技术，建立单管联合检测甲、乙型流感病毒核酸的方法具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和 T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使甲、乙型流感病毒核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，包括：

1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl₂，70mM KCl， 15％DMSO，5mM DTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各 0.2μM；其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：

(1)甲型流感病毒(NP基因一段保守区序列)的扩增引物：

FluA-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTC CAGGGGCGGG；

注：本发明中的简并碱基H代表A/T/C；

FluA-F引物(5’-3’)：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；

(2)乙型流感病毒(M基因一段保守区序列)的扩增引物：

FluB-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTG GTTCGGTGGGA；

FluB-F引物(5’-3’)：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；

(3)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)的扩增引物：

内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGA CTTGCCCTCCA；

内参-F引物(5’-3’)：AGAAACGGCTACCACATCC；

由于甲流序列变异较大，在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，本发明在设计甲流扩增引物时R引物设计成简并碱基，对甲流常见流行株进行了全覆盖。在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。三对引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列。

2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；

3)细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；

4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

(1)甲型流感病毒特异探针(5’-3’)

甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttTATCTATAGCTGGTGT；

甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttTATCTATAGCTGGTGT；

注：本发明中的简并碱基Y代表T/C；

甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

注：本发明中的简并碱基R代表A/G；

甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

(2)乙型流感病毒特异探针(5’-3’)

乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTATGTATCTGTGAGT；

乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTATGTATCTGTGAGT；

乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C；

乙流LES2：CTGATATACAGAAAGCACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C；

乙流LES3：TAATTGGTGCATCTATCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAG C；

(3)内参特异探针(5’-3’)

内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

(4)C线显色探针(5’-3’)

TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

(5)金探针

金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGC TCGAGCACTGCG-3’；

5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、 NC膜、吸水纸；NC膜上有C线(质控线)和三条T线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为FluB-T、FluA-T、内参-T和C线(如图3)；FluA-T处包被FluA包被探针、FluB-T处包被FluB包被探针、内参-T处包被内参包被探针、 C线处包被C线包被探针；具体序列(5’-3’)为：

FluA包被探针：ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA；

FluB包被探针：ACTCACAGATACATAGttttACTCACAGATACATAG；

内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；

C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA。

本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒检测甲/乙型流感病毒核酸的方法，包括如下步骤：

(1)RNA恒温扩增

本发明检测指标有三个：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA 杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在 F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成 RNA分子产物。转录的RNA分子产物可以进入循环扩增过程，首先F引物会结合转录的RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA 杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA 分子产物(如图1)。

本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。

(2)金探针层析

a，设计特异探针、金探针、C线显色探针和包被探针

特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在NC膜上的包被探针集合，起到固定扩增产物 RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针也包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和标记在胶体金颗粒上的巯基化探针结合，起到富集胶体金在检测线处显色的作用，这两个部分用4～5个T 链接。

金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记到胶体金颗粒上，可以与特异探针LES系列的一端及质控线检测探针的一部分结合。

包被探针：包被探针被固定在NC膜上，可以和特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。每条包被探针含有两个拷贝，每个拷贝之间用4～5个T链接。

C线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个T链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在NC膜上的C线包被探针结合。在层析时，无论有无RNA扩增产物，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被NC膜上的C线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。

所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同金探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。

所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。

b，试纸条检测

所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括在FluA-T、FluB-T、内参-T，其中FluA-T处包被的FluA包被探针能够特异性结合甲型流感病毒CES系列探针的一端；FluB-T处包被的FluB包被探针能够特异性结合乙型流感病毒CES 系列探针的一端；内参-T处包被的内参包被探针能够特异性结合内参CES系列探针的一端。所述质控线(C线)上包被C线包被探针能特异性结合C线显色探针。将特异探针CES、特异探针LES、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效(如图2)。

结合上述原理，对本发明利用上述试剂盒的方法的工作过程介绍如下：

(1)核酸提取

采集疑似流感患者的咽拭子样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒 RNA分子。

(2)RNA恒温扩增

向17μL的含有甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有流感病毒核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。

(3)试纸条层析

a，预杂交

将RNA恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及C线显色探针) 混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同NC膜上的包被探针结合；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“CES 探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”。

b，层析检测

将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着NC膜向吸水纸方向层析，当有待测RNA扩增产物时，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被NC膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4)。

若无待测RNA产物扩增，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4)。

无论有无待测RNA产物扩增，C线显色探针都可以形成“C线显色探针 ---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着NC膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。

第二方面，提供上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒在制备甲型和/或乙型流感病毒检测试剂中的应用。

本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：

1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在同一管内能够同时扩增甲型流感病毒、乙型流感病毒和内参基因三种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。

2、由于甲流序列变异较大，本发明在设计引物时必须保证能够扩增出所有常见的亚型流行株核酸，所选基因区域较为保守，甲型流感病毒R引物设计成简并碱基，可以对甲型流感病毒常见流行株进行全覆盖。同时本发明在设计引物时同时经过多轮测试，保证了各单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰，整体扩增效果好。由表6可知本发明试剂盒对28株不同来源的常见流感病毒亚型BV、BY、甲型H1N1、季节性H1N1、H7N9、H5N1具有很好的检出能力。

3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在NC膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表4 所列的34种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对H1N1(ATCC VR-1469)的最低检测限为 1.8×102TCID50/mL、H3N2(ATCC VR-1680D)的最低检测限为9.3×10 TCID₅₀/mL、FluB(ATCC VR-1735)的最低检测限为7TCID₅₀/mL。对于452份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的甲型和/或乙型流感病毒检测灵敏度、特异性高于某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量PCR试剂盒。

4、本发明采用RNA恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了RNA恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于流感病毒核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

附图说明

图1RNA恒温扩增原理图；

图2试纸条显色原理图；

图3试纸条示意图；

图4检测阴阳性示意图；

a：FluA阴性、FluB阴性、内参阴性；

b：FluA阴性、FluB阴性、内参阳性；

c：FluA阳性、FluB阴性、内参阳性；

d：FluA阴性、FluB阳性、内参阳性；

e：FluA阳性、FluB阳性、内参阳性。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005) 中所述的条件进行。

【实施例1】核酸检测试纸条的制备

在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(NC膜)、样本垫、吸水纸、PVC底板等。

1、喷膜：

检测线FluB-T：能够捕获结合FluB特异探针CES序列，10μM FluB包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；

检测线FluA-T：能够捕获结合FluA特异探针CES序列，10μM FluA包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；

检测线内参-T：能够捕获结合内参特异探针CES序列，10μM内参包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；

质控线(C线)：能够捕获结合C线显色探针序列，10μM C线包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；

喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2 小时，存于干燥环境中备用。

2、试纸条组装

分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。

【实施例2】灵敏度测试

将ATCC来源的H1N1(ATCC编号VR-1469)、H3N2(ATCC编号VR-1680D)、 FluB(ATCC编号VR-1735)的病毒原液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～ 95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，检出结果如下：

H1N1最低检测限检测

表1.1 不同滴度H1N1的检测实验数据

表1.2 H1N1最低检测限实验数据

H3N2最低检测限检测

表2.1 不同滴度H3N2的检测实验数据

表2.2 H3N2最低检测限实验数据

FluB最低检测限检测

表3.1 不同滴度FluB的检测实验数据

表3.2 FluB最低检测限实验数据

最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：

检测指标	病毒株	最低检测限
			H1N1	ATCC VR-1469	1.8×10TCID<sub>50</sub>/mL
H3N2	ATCC VR-1680D	9.3TCID<sub>50</sub>/mL
			FluB	ATCC VR-1735	5TCID<sub>50</sub>/mL

【实施例3】特异性验证

1，测试菌株

将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：

表4 特异性验证测试菌株信息

2，测试结果

测试结果如下：

表5 特异性验证测试结果

3，结论

从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。

【实施例4】病原体检出能力验证

使用本发明试剂盒对28株常见流感病毒株进行检测，验证本试剂盒对不同流感病毒株的检出能力。检测结果如下：

表6 不同病毒株检测结果

从以上结果可以看出，本试剂盒对常见流感病毒亚型具有很好的检出能力。

【实施例5】临床样本的验证

1，临床样本信息

在湖北省预防医学科学院/疾病预防控制中心共检测样本452份，其中男性标本和女性标本分别为250例和202例，分别占比为55.31％和44.69％。452例标本中，患者年龄最大为68岁，最小为1个月，平均年龄为11.13岁，标准差为13.5 岁，中位数为6岁。入组患者的诊断结果均与呼吸道感染相关，具体分布情况如下：疑似流感195例，(急性)上呼吸道感染129例，(感染性)发热61例，(急性、喘息性)支气管炎29例，流行性感冒21例，其他17例。

2，检测结果

(1)甲型流感病毒检测结果

检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量 PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：

对452份样本采用“基因测序法”进行检测，并对阳性样本进行分型鉴定，测序成功112例，其中H1N1阳性样本71例，H3N2阳性样本40例，H7N9阳性样本2例，这112例样本与本试剂盒检测结果一一对应。

对于不一致的3例样本，某商品化检测甲、乙型流感病毒荧光定量PCR试剂盒漏检一例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本甲流检测检测灵敏度更高，特异性更强。

(2)乙型流感病毒检测结果

对452份样本采用“基因测序法”进行检测，测序成功122例，其中包括 117例两种方法学共同阳性样本，4例本发明试剂盒检测阳性某商品化荧光定量 PCR试剂盒检测阴性样本，1例本发明试剂盒检测阴性某商品化荧光定量PCR 试剂盒检测阳性样本。

对于不一致的10例样本进行测序结果分析，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本时乙流检测灵敏度更高，特异性更强。

序列表

<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司

<120> 一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒的试剂盒及其应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)

<223> h=a或t或c

<400> 1

taatacgact cactataggg agatgtchtt ccaggggcgg g 41

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tactcctctg cattgtctcc 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taatacgact cactataggg agacactgtt ggttcggtgg ga 42

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcctggtct ttgggtttt 19

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatacgact cactataggg agacaccaga cttgccctcc a 41

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaacggct accacatcc 19

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccaggggc ggggagtttt tatctatagc tggtgt 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)

<223> y=t或c

<400> 8

tcttygagct ctcggatttt tatctatagc tggtgt 36

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)

<223> r=a或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)

<223> r=a或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)

<223> r=a或g

<400> 9

cgaaarggca rcgarctttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)

<223> y=t或c

<400> 10

ccgatcgtgc cytccttttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)

<223> r=a或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)

<223> y=t或c

<400> 11

ttgacatgar taaygatttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagaatttga cctagacttt ttctatgtat ctgtgagt 38

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgccttgga atggataatt ttctatgtat ctgtgagt 38

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaacaaaag atgcttaatt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgatataca gaaagcactt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taattggtgc atctatcttt ttcgcagtgc tcgagctctg agc 43

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaggaaggca gcaggctttt atctgtatag tgtctg 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgcaaatta cccacttttt atctgtatag tgtctg 36

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cccgacccgg ggaggttttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agtgacgaaa aataactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aatacaggac tctttctttt ccgcagtgct cgagctctga gc 42

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcagatcact atgtactttt cgcagtgctc gagctctgag c 41

<210> 23

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctactctgc agtgctccat cgtacgtctg tcatttttgc tcagagctcg agcactgcg 59

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acaccagcta tagatatttt acaccagcta tagata 36

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

actcacagat acatagtttt actcacagat acatag 36

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagacactat acagattttt cagacactat acagat 36

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtacatagtg atctgatttt gtacatagtg atctga 36

Claims

1.一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测甲、乙型流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl₂，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM，其中扩增引物包括三对：甲型流感病毒、乙型流感病毒和人内参基因，具体的：

（1）甲型流感病毒的扩增引物：

FluA-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGATGTCHTTCCAGGGGCGGG；其中，H=A/T/C；

FluA-F引物（5’-3’）：TACTCCTCTGCATTGTCTCC；

（2）乙型流感病毒的扩增引物：

FluB-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACTGTTGGTTCGGTGGGA；

FluB-F引物（5’-3’）：TTCCTGGTCTTTGGGTTTT；

（3）内参基因的扩增引物：

内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGACACCAGACTTGCCCTCCA；

内参-F引物（5’-3’）：AGAAACGGCTACCACATCC；

2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；

3）细胞裂解液：购至美国Signosis公司，货号CL-0001；

4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸金探针、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：

（1）甲型流感病毒特异探针（5’-3’）

甲流CES1：TTCCAGGGGCGGGGAGttttTATCTATAGCTGGTGT；

甲流CES2：TCTTYGAGCTCTCGGAttttTATCTATAGCTGGTGT，

其中，Y=T/C；

甲流LES1：CGAAARGGCARCGARCttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

其中，R=A/G；

甲流LES2：CCGATCGTGCCYTCCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

甲流LES3：TTGACATGARTAAYGAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（2）乙型流感病毒特异探针（5’-3’）

乙流CES1：AAGAATTTGACCTAGACTttttCTATGTATCTGTGAGT；

乙流CES2：CTGCCTTGGAATGGATAAttttCTATGTATCTGTGAGT；

乙流LES1：AAAACAAAAGATGCTTAAttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

乙流LES2：CTGATATACAGAAAGCACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

乙流LES3：TAATTGGTGCATCTATCTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（3）内参特异探针（5’-3’）

内参CES1：AAGGAAGGCAGCAGGCttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参CES2：GCGCAAATTACCCACTttttATCTGTATAGTGTCTG；

内参LES1：CCCGACCCGGGGAGGTttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参LES2：AGTGACGAAAAATAACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

内参LES3：AATACAGGACTCTTTCttttCCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（4）C线显色探针（5’-3’）

TCAGATCACTATGTACttttCGCAGTGCTCGAGCTCTGAGC；

（5）金探针（5’-3’）

金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：

5’-CCTACTCTGCAGTGCTCCATCGTACGTCTGTCATTTTTGCTCAGAGCTCGAGCACTGCG-3’；

5）试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有C线（质控线）和三条T线（检测线），从样品垫到吸水纸方向分别为FluB-T、FluA-T、内参-T和C线；FluA-T处包被FluA包被探针、FluB-T处包被FluB包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针；具体序列为（5’-3’）：

FluA包被探针：ACACCAGCTATAGATAttttACACCAGCTATAGATA；

FluB包被探针：ACTCACAGATACATAGttttACTCACAGATACATAG；

内参包被探针：CAGACACTATACAGATttttCAGACACTATACAGAT；

C线包被探针：GTACATAGTGATCTGAttttGTACATAGTGATCTGA。

2.权利要求1所述的试剂盒在制备甲型和/或乙型流感病毒检测试剂中的应用。