CN102041317A - 基于g4dna酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法 - Google Patents
基于g4dna酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于G4DNA酶显色的可视化猪瘟病毒鉴别检测试剂的制备方法，包括选取病毒感染的细胞，经冻融裂解后，采用基因提取试剂盒提取目标基因RNA，经逆转录、灭活MMLV逆转录酶后得到cDNA；将cDNA加入不对称PCR体系，经变性、退火及延伸扩增50-100个循环得到不对称PCR产物；将上、下游探针，竞争性探针和不对称PCR产物加入到G4DNA酶显色反应缓冲液中，经变性、退火后再加入Hemin、ATBS和H2O2进行显色反应，观察有无肉眼可见的绿色出现，可以区分猪瘟强毒和疫苗C株。本发明检测速度快、精确稳定、重现性好、检测步骤简单、操作简便、可肉眼直接观察显色反应，结果直观、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因鉴别检测试剂的制备方法，具体的说，涉及基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法。该试剂不但能够快速鉴别检测猪瘟病毒，区分猪瘟强毒和疫苗毒，而且还适用于其它病原微生物核酸的鉴别检测，属于基因工程技术领域。
背景技术
核酸是决定遗传性质的关键物质，每一种生物都有自己特定的核酸序列，各种各样的生物性状最终都能在特定核酸序列中找到根源。因此，核酸分析技术在病原微生物的鉴定诊断，分型和耐药性检测，疾病诊断与预后，SNP检测等领域有着广泛的应用，并发挥着重要的作用。
这其中对核酸突变的检测正占据越来越重要的地位，因为在人类疾病中相当一部分是由于各种致病菌和病毒侵染所引起的，科学家发明了很多针对这些病原体的药物，用来治疗感染性疾病。在这些药物的广泛应用拯救了许多患者的生命的同时，细菌和病毒耐药性问题也相伴而生。由于细菌和病毒固有的选择和适应性，再加上抗感染药物的不恰当使用，造成当前细菌和病毒耐药性问题成为一个非常棘手的问题。这些细菌和病毒的耐药性很大部分是由于药物作用靶蛋白的编码基因发生突变所引起的，这些突变通常为单碱基突变，即可造成蛋白质中某个氨基酸的改变，进而药物分子不能与突变蛋白相互作用。比如，HIV是一种逆转录病毒，其复制过程突变率高，在抗病毒治疗过程中，很容易产生耐药性突变，目前抑制HIV逆转录酶、蛋白酶、整合酶和包膜蛋白的多种药物均发现有多种相应的耐药基因突变。
一个简便高效的单核苷酸鉴别检测体系在感染性疾病治疗过程中有重要价值。它能帮助医生及时了解病人体内耐药性菌株、毒株的情况，适时采取有针对性的治疗方案。另外人体基因组中包含大量的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，其中一部分SNPs与很多疾病易感性相关，对这些位点的检测技术是实现个性化医疗的关键技术之一。单碱基突变的检测和SNPs的检测技术上是一致的，都是确定一段DNA序列中的某个特定位置碱基种类。
DNA酶(DNAzyme)逐渐受到人们重视（Rich, A.; Zhang, S. Timeline: Z-DNA: the long road to biological function, Nat. Rev. Genet. 2003, 4, 566-572.）。它能够催化双氧水氧化2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiozoline)- 6-sulfonic acid, ABTS]等过氧化物酶显色底物，生成有颜色的物质，并且DNA过氧化物酶能够作为催化标签融入各种检测探针中，实现用肉眼检测目标物。DNA过氧化物酶是Dipankar Sen 课题组发现的，它是G-四链体DNA与高氯铁血红素(Hemin)形成的复合物。DNA过氧化物酶作为催化标签有着自己独特的优势，例如：DNA过氧化物酶可以在检测体系中由G-四链体与Hemin原位组装形成，不需要额外的制备纯化步骤；它是一种DNA序列，可在合成过程中直接加入核酸探针序列中，或者通过碱基对互补与探针相连，省去额外的标记步骤；DNA序列稳定，有活性的结构很容易在溶液中形成，这样在运输存储过程中不需要特殊的条件。
猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）和口蹄疫一样，是猪的一种高度致死性接触性传染病。目前，全世界仍有50多个国家和地区存在CSF。世界动物卫生组织（OIE）2005年出版的《陆生动物卫生法典》中将CSF列为必须报告疫病之一。我国是CSF高发国家，也将CSF列为“一类动物疫病”。猪瘟的防控成为养猪业的重要一环。在我国主要采用对猪只进行猪瘟兔化弱毒株疫苗，即C株疫苗进行常规免疫来对猪瘟进行防控。由于C株疫苗也是一种病毒，那么在生产实践中存在如何区分猪只是感染了野毒还是接种了疫苗的问题，因此猪瘟野毒和C株之间的鉴别判断就显得十分重要。
常见的猪瘟鉴别检测方法主要包括：病毒的分离和生物学试验、免疫荧光技术、核酸测序、荧光定量PCR等，但这些方法在应用过程中普遍存在着明显的不足，诸如周期长，操作繁琐，特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测，这给猪瘟的鉴别检测带来了巨大困难。因此，如何快速、准确对猪瘟病毒进行鉴别检测是目前面临的主要难题之一。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测方法，该试剂不但能够快速定性检测猪瘟病毒，而且还适用于病原微生物核酸的鉴别检测，方便、快捷、经济实惠。
本发明利用DNA过氧化物酶序列为G-四链体DNA，包含4段GGG序列，很容易拆分、组装的特性，将DNA过氧化物酶序列分成了两个部分，采用3∶1拆分的模式构建探针，即一条探针中含有3段GGG序列，另外一条只含有一段GGG序列，也就是说将序列d(GGGTAGGGCGGGTTGGG)不对称分为d(GGGTAGGGCGGG)和d(TGGG)分别与两条结合序列的3’和5’端融合形成探针ProbL和ProbR，这两条结合序列与靶DNA的部分序列互补。当不存在靶DNA时，探针呈游离状态，分成两个部分的DNA过氧化物酶序列不能组装成G-四链体结构，不能表现出过氧化物酶活性，故体系中没有信号的变化。在靶单链DNA存在的情况下，在变性与退火过程中，探针与模板特异性结合，两拆分部分相互靠近从而组装成G-四链体结构，与Hemin结合后表现出过氧化物酶活性，在显色体系的条件下释放肉眼可见的绿光。这样可以通过体系中DNA 过氧化物酶催化的颜色反应检测靶DNA。
为了实现区分猪瘟病毒石门强毒和猪瘟C株疫苗毒的目的，本发明将下游探针ProbR作为猪瘟强毒核苷酸的检测探针，采用竞争策略实现对单核苷酸突变的检测。即检测体系中不仅有与靶DNA序列（猪瘟强毒的cDNA）互补的探针ProbL、ProbR，还包括竞争序列ProbC，竞争序列为靶DNA突变体（猪瘟C株疫苗毒）的互补区，只有在探针ProbR的互补区与靶DNA（猪瘟强毒的cDNA）相应区域完全匹配的体系中才能组装成有活性的DNA过氧化物酶，结合Hemin后成为有活性的DNA过氧化物酶，催化双氧水氧化ABTS2-生成绿色ABTS。如果靶DNA发生突变，则竞争序列ProbC会竞争结合到靶DNA的突变体（猪瘟C株疫苗毒）序列上，探针ProbR的互补区就不能结合到靶DNA（猪瘟强毒的cDNA）的突变体相应区域，因而不能与ProbL组装成有活性的DNA过氧化物酶，也不会完成后续的显色反应形成绿色，从而实现区分猪瘟病毒石门强毒和猪瘟C株疫苗毒的目的。若反应产物变成肉眼可见的绿色，则判为阳性，即检出猪瘟石门强毒，不变色为阴性，即检出猪瘟C株疫苗毒或无猪瘟病毒存在。
通常从样品中获得的核酸量不足以直接用于分析，因此，在用G4DNA酶进行显色反应之前必需对被检测的核酸进行基因扩增。其次，由于G4DNA酶显色反应时只有一条PCR产物可以与探针杂交，而其对应的互补链由于PCR双链的自身退火，会干扰所需要的杂交反应，降低杂交信号，因此需要复制出单链。本发明选择了经济实用的不对称PCR技术来达成上述目的。使用利用浓度有明显差异的特异性上、下游引物进行不对称PCR扩增；如果目标基因是RNA，则应加上反转录的步骤。不对称PCR进行完成后，可以直接加入G4DNA酶反应液、探针等试剂，直接进行下一步的显色反应，从而实现了检测的方便、快捷。
本发明是通过采用如下的技术方案来实现发明目的的。
基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、目标基因的制备
选取经猪瘟病毒感染后的细胞，经-70℃冻融3次，每次10-30分钟后，取200μl加RNA裂解液（Trizol）1ml混匀，室温静置10-15分钟，加0.2ml氯仿，再室温静置3-5分钟，于4℃ 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10-20分钟，再于4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75%乙醇于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20μl得到目标基因RNA；
所述75%乙醇采用无菌双蒸水按体积比配制而成。
B、cDNA的制备
采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10μl，加入反向引物 W3（-）1μl（20μmol/L）和dNTPs （三磷酸脱氧核苷酸）1μl（10μmol/L），65℃孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μl（5×buffer），RNA酶抑制剂1μl，DTT（二硫苏糖醇）2μl（0.1mol/L），MMLV逆转录酶1μl，于42℃反应50分钟、75℃反应10分钟，即得到cDNA；
所述基因提取试剂盒选自Invitrogen公司生产的产品。
所述反向引物W3（-）的序列是5' GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3'。
所述逆转录反应缓冲液的组成为：250 mmol/L pH 8.3的Tris-HCl（Tris-盐酸），375 mmol/L KCl（氯化钾），15 mmol/L MgCl2（氯化镁）。
C、不对称PCR的扩增
取步骤B制好的cDNA 5μl，加入到100μl的不对称PCR体系中进行反应，循环条件为：95℃预变性2分钟；94℃ 变性15 秒，53℃退火 15秒，72℃延伸15秒，扩增50-100个循环；最后72℃延伸10分钟，得到PCR产物；
所述100μl不对称PCR体系的组成为：正向引物W3（+）2μl（0.4-4μmol/L）和反向引物W3（-）2μl（20μmol/L），PCR溶液10μl（10×buffer），MgCl2 溶液8μl（2.5mmol/L），dNTPs溶液2μl（10mmol/L），Taq DNA聚合酶2μl （2U）以及余量的无菌双蒸水。
所述不对称PCR反应体系中的正向引物W3（+）序列是：5'-gcgcgggtaacccgggat-3' ，反向引物W3（-）序列是：5' - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3'。
D、G4DNA酶显色反应
分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20μl、上游探针Prob1L 2μl（20μmol/L）、下游探针Prob1R 2μl（20μmol/L），竞争性探针Prob1C 6μl（20μmol/L），加无菌双蒸水补足为91μl，加入至步骤C所得的含有100μl不对称PCR反应液的200μl PCR管中，95℃变性5 min；30℃ 退火3min，加入Hemin底物0.5μl （50mmmol/L），放置5min，再加入8μl （50 mmol/L） ATBS和0.5μl （1mol/L）H2O2显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。结果判定：反应产物变成肉眼可见的绿色判为阳性，即样品含有猪瘟石门强毒基因，不变色为阴性，即样品含有猪瘟C株疫苗基因或无猪瘟病毒基因存在。
所述G4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括：100 mmol/L 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesμlfonic acid，HEPES）10μl，2 mol/L的氯化钠和0.2mol/L的氯化钾共10μl。
所述上游探针Prob1L的序列是5'-cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3'ProbL。
所述下游探针Prob1R的序列是5'-tgggtaattttttatttatttaggt-3'。
所述竞争性探针Prob1C的序列是5'cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3'。
所述上、下游探针的组成为G4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序列又被拆分为两个部分，一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，形成3:1拆分模式，上、下游探针分别带有拆分的G-四链体DNA序列。
在本发明的基本原理是：
利用检测体系中不仅有与靶DNA（猪瘟石门毒的cDNA）序列互补的探针ProbL、ProbR，还包括竞争序列ProbC，竞争序列为靶DNA突变体（猪瘟C株疫苗毒的cDNA）的互补区，只有在探针ProbR的互补区与靶DNA（猪瘟石门毒的cDNA）相应区域完全匹配的体系中才能组装成有活性的DNA过氧化物酶，结合Hemin后成为有活性的DNA过氧化物酶，催化双氧水氧化ABTS2-生成绿色ABTS。如果靶DNA是猪瘟C株疫苗毒的cDNA，则竞争序列Prob1C会竞争结合到靶DNA的突变体（猪瘟C株疫苗毒的cDNA）序列上，探针Prob1R的互补区就不能结合到靶DNA的突变体（猪瘟C株疫苗毒的cDNA）相应区域，因而不能与Prob1L组装成有活性的DNA 过氧化物酶，也不会完成后续的显色反应形成绿色，从而实现区分猪瘟病毒石门强毒和猪瘟C株疫苗毒的目的。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果表现在：
1、检测速度快，整个检测过程共需2-3小时，而G4DNA酶显色步骤仅需15分钟；
2、检测方法精确稳定、重现性好；
3、检测步骤简单，操作简便，只需1人即可完成整个检测过程，一次可检测1-95个样品，减少了人力资源的浪费；
4、可肉眼直接观察显色反应，结果直观；
5、无需特殊的昂贵仪器，试剂便宜，检测成本低廉，利于推广。
附图说明
图1为本发明对经猪瘟石门强毒感染后的PK-15细胞、猪瘟C株疫苗毒感染的牛睾丸细胞、空白的PK-15细胞以及无菌双蒸水进行检测的G4DNA酶显色反应结果；
图2为本发明对经猪瘟石门强毒感染后的PK-15细胞、C株感染的牛睾丸细胞、空白的PK-15细胞以及无菌双蒸水进行检测后利用紫外-可见分光光度计(UV-2550 UV-vis spectrophotometer （岛津公司产品）)分析G4DNA酶显色反应的光吸收结果（吸收波长为419nm）。
具体实施方式
基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、目标基因的提取
选取经猪瘟病毒感染后的细胞，经-70℃冻融3次，每次10-30分钟后，取200μl加RNA裂解液（Trizol）1ml混匀，室温静置10-15分钟，加0.2ml氯仿，再室温静置3-5分钟，于4℃ 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10-20分钟，再于4℃12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75%乙醇于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20μl得到目标基因RNA；
所述75%乙醇采用无菌双蒸水按体积比配制而成。
B、cDNA的制备
采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10μl，加入反向引物 W3（-） 1μl（20μmol/L）和dNTPs （三磷酸脱氧核苷酸）1μl（10μmol/L），65℃孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μl（5×buffer），RNA酶抑制剂1μl，DTT（二硫苏糖醇）2μl（0.1mol/L），MMLV逆转录酶1μl，于42℃反应50分钟、75℃反应10分钟，即得到cDNA；
所述基因提取试剂盒选自Invitrogen公司生产的产品。
所述反向引物W3（-）的序列是5' GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3'。
所述逆转录反应缓冲液的组成为：250 mmol/L pH 8.3的Tris-HCl（Tris-盐酸），375 mmol/L KCl（氯化钾），15 mmol/L MgCl2（氯化镁）。
C、不对称PCR的扩增
取步骤B制好的cDNA 5μl，加入到100μl的不对称PCR体系中进行反应，循环条件为：95℃预变性2分钟；94℃变性15 秒，53℃退火15秒，72℃延伸15秒，扩增50-100个循环；最后72℃延伸10分钟，得到PCR产物；
所述100μl不对称PCR体系的组成为：正向引物W3（+）2μl（0.4-4μmol/L）和反向引物W3（-）2μl（20μmol/L），PCR溶液10μl（10×buffer），MgCl2 溶液8μl（2.5mmol/L），dNTPs溶液2μl（10mmol/L），Taq DNA聚合酶2μl （2U）以及余量的无菌双蒸水。
所述不对称PCR反应体系中的正向引物W3（+）序列是：5'-gcgcgggtaacccgggat-3' ，反向引物W3（-）序列是：5' - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3'。
D、G4DNA酶显色反应
分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20μl、上游探针Prob1L 2μl（20μmol/L）、下游探针Prob1R 2μl（20μmol/L），竞争性探针Prob1C 6μl（20μmol/L），加无菌双蒸水补足为91μl，加入至步骤C所得的含有100μl不对称PCR反应液的200μl PCR管中，95℃变性5 min；30℃ 退火3min，加入Hemin底物0.5μl （50mmmol/L），放置5min，再加入8μl（50 mmol/L） ATBS和0.5μl（1 mol/L）H2O2显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。
所述G4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括：100 mmol/L 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesμlfonic acid，HEPES）10μl， 2 mol/L的氯化钠和0.2mol/L的氯化钾共10μl。
所述上游探针Prob1L的序列是5'-cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3'ProbL。
所述下游探针Prob1R的序列是5'-tgggtaattttttatttatttaggt-3'。
所述竞争性探针Prob1C的序列是5'cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3'。
所述上、下游探针的组成为G4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序列又被拆分为两个部分，一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，形成3:1拆分模式，上、下游探针分别带有拆分的G-四链体DNA序列。
Claims (10)
1.基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、目标基因的提取
选取经猪瘟病毒感染后的细胞，经-70℃冻融3次，每次10-30分钟后，取200μl加RNA裂解液1ml混匀，室温静置10-15分钟，加0.2ml氯仿，再室温静置3-5分钟，于4℃ 12000g/min离心10-15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10-20分钟，再于4℃ 12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml 75%乙醇于4℃ 7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的水20μl得到目标基因RNA；
B、cDNA的制备
采用基因提取试剂盒取步骤A所得到的目标基因RNA 10μl，加入反向引物 W3（-）1μl（20μmol/L）和dNTPs 1μl（10μmol/L），65℃孵育5分钟，再迅速置冰上5分钟，然后加逆转录反应缓冲液4μl（5×buffer），RNA酶抑制剂1μl，DTT 2μl（0.1mol/L），MMLV逆转录酶1μl，于42℃反应50分钟、75℃反应10分钟，即得到cDNA；
C、不对称PCR的扩增
取步骤B制好的cDNA 5μl，加入到100μl的不对称PCR体系中进行反应，循环条件为：95℃预变性2分钟；94℃变性15 秒，53℃退火15秒，72℃延伸15秒，扩增50-100个循环；最后72℃延伸10分钟，得到PCR产物；
D、G4DNA酶显色反应
分别取G4DNA酶显色反应缓冲液20μl、上游探针Prob1L 2μl（20μmol/L）、下游探针Prob1R 2μl（20μmol/L），竞争性探针Prob1C 6μl（20μmol/L），加无菌双蒸水补足为91μl，加入至步骤C所得的含有100μl不对称PCR反应液的200μl PCR管中，95℃变性5 min；30℃ 退火3min，加入Hemin底物0.5μl （50mmmol/L），放置5min，再加入8μl（50 mmol/L）ATBS和0.5μl（1 mol/L）H2O2显色，观察有无肉眼可见的绿色出现。
2.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤B所述反向引物W3（-）的序列是5' GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3'。
3.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤B所述逆转录反应缓冲液的组成为：250 mmol/L pH 8.3的Tris-HCl，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。
4.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤C所述100μl不对称PCR体系的组成为：正向引物W3（+）2μl（0.4-4μmol/L）和反向引物W3（-）2μl（20μmol/L），PCR溶液10μl （10×buffer），MgCl2 溶液8μl（2.5mmol/L），dNTPs溶液2μl（10mmol/L），Taq DNA聚合酶2μl （2U）以及余量的无菌双蒸水。
5.如权利要求1或5所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：所述不对称PCR体系中的正向引物W3（+）序列是：5'-gcgcgggtaacccgggat-3' ，反向引物W3（-）序列是：5' - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3'。
6.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述G4DNA酶显色反应缓冲液的组成包括：100 mmol/L 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸10μl，2 mol/L的氯化钠和0.2mol/L的氯化钾共10μl。
7.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述上游探针Prob1L的序列是5'-tgggtaattttttatttatttaggt-3’。
8.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述下游探针Prob1R的序列是5'-cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3'。
9.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述竞争性探针Prob1C的序列是5'cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3'。
10.如权利要求1所述基于G4DNA酶显色的可视化基因鉴别检测试剂的制备方法，其特征在于：步骤D所述上、下游探针的组成为G4DNA酶中的G-四链体DNA，包含4段GGG序列，该序列又被拆分为两个部分：一个部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Two Beijiao village, Chongyang Town, Sichuan City, Chengdu Province, China (611200), Applicant after: Chengdu Juxing Agriculture and Animal Husbandry Technology Co., Ltd. Applicant after: Wang Yi Address before: Two Beijiao village, Chongyang Town, Sichuan City, Chengdu Province, China (611200), Applicant before: Chengdu Giastar Pig Industry Co., Ltd. Applicant before: Wang Yi |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: CHENGDU GIASTAR PIG INDUSTRY CO., LTD. TO: CHENGDU GIASTAR AGRICULTURE AND PASTURE TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Two Beijiao village, Chongyang street, Sichuan City, Chengdu Province, China (611200), Patentee after: Superstar Limited by Share Ltd Patentee after: Wang Yi Address before: Two Beijiao village, Chongyang Town, Sichuan City, Chengdu Province, China (611200), Patentee before: Chengdu Juxing Agriculture and Animal Husbandry Technology Co., Ltd. Patentee before: Wang Yi |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.208, tomorrow Avenue, Chongyang street, Chongzhou City, Chengdu City, Sichuan Province Patentee after: Giant star agriculture and animal husbandry Co., Ltd Patentee after: Wang Yi Address before: Two Beijiao village, Chongyang street, Sichuan City, Chengdu Province, China (611200), Patentee before: Superstar Limited by Share Ltd. Patentee before: Wang Yi |