CN112048547A - 一种脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于生物传感器的脊肌萎缩症(SMA)致病基因(SMN1和SMN2)检测的试剂盒，该试剂盒选用SMA的致病基因SMN1和SMN2为检测模块，基于链置换反应和DNA构象转变，结合荧光染料NMM(N‑甲基卟啉二丙酸IX)与G‑四链体的特异性识别作用，构建若干荧光生物传感器，可以特异性识别目标分子SMN1和SMN2，实现了荧光和可视化区分SMN1和SMN2的单碱基差异。此外，该方法可应用于对SMA的基因诊断，从而为SMA的临床诊断和产前基因诊断带来帮助和突破。与现有技术相比，本发明的检测手段为免标记的荧光检测法和紫外‑可见光透射照射法，该检测手段高效灵敏、简单、快速、廉价、选择性好、且信号识别简单，在实际应用中通过荧光图谱以及颜色变化即可进行识别。

Description

一种脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及DNA分子检测及应用，具体涉及一种基于DNA构象转变的荧光生物传感器的构建，以及其在脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1和SMN2等基因检测中的应用。
背景技术
脊肌萎缩症(Spinal Muscular AtropHy，SMA)是一种常染色体隐性遗传病，以脊髓前角运动神经元退行性病变为病理特征。发病率约为1:6000～1:10000，携带者的发生率约为1:40，是导致儿童死亡的主要原因之一，至今无有效的治疗方法。鉴于SMA的严重性其给患者家庭带来的巨大悲痛。
SMA的主要致病基因为运动神经元存活基因(survival motor neuron，SMN)，它有两个同源拷贝，SMN1和SMN2。由于二者7号外显子第6个碱基的不同(SMN1为C，SMN2为T)，直接影响了外显子剪接增强子的活性，导致二者有着完全不同的剪接模式，即SMN1进行全长转录产生全长(fl)SMN mRNA，编码正常的全长SMN蛋白；而SMN2基因仅有少量全长转录，大部分为跳过外显子7的选择性剪接，并产生大量缺少外显子7的产物SMNΔ7mRNA，它所编码的蛋白是一个“截短蛋白(SMNΔ7蛋白)”，该蛋白不稳定且功能有缺陷。在SMN1基因功能完全丧失时，SMN2基因的表达对SMN蛋白的功能具有一定的补充作用，被定义为SMA的修饰基因。研究显示：约95％的SMA患者表现为SMN1基因7号外显子甚至7、8号外显子同时缺失，或SMN1突变为SMN2。普遍认为，SMN1是SMA的决定基因，表达完整而稳定的SMN功能蛋白。SMN2作为SMA的修饰基因，所表达的具有生物活性SMN蛋白量虽然较少，但随着其拷贝数增加会有表达量的累积效应，使患者的临床症状有一定程度的减轻，从而SMN2基因的拷贝数同SMA疾病相关。因此实现检测SMN1和SMN2基因目的片段的突变、缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA,并且对分析估测SMA的临床表型十分必要。
此外，由于SMA携带者的高发生率，疾病的严重性以及有效治疗措施的缺乏等种种原因，对携带者的筛查就变的非常重要。而高度同源的SMN2基因干扰了对SMN1基因拷贝数的检测，同时也增加了SMA携带者的筛查难度。因此找到一种可以快速区分SMN1和SMN2单碱基差异的方法对实现脊髓性肌萎缩疾病的基因诊断有十分重要的意义。
目前有多种方法用于SMA的诊断，但大多依赖凝胶电泳分析DNA构象或DNA测序法，存在特异性差、灵敏度不高、操作复杂、检测高成本等弊端。如应用最广泛的限制性片段长度多态性分析法(PCR-restriction fragment length PolymorpHism，PCR-RFLP)，无法检测SMN1的杂合缺失，亦不能检测SMN1的拷贝数，因此无法区分正常人和携带者；变相高效液相色谱法(Denaturing High-performance Liquid ChromatograpHy，PCR-DHPLC)，通过洗脱峰来判断是否存在碱基差异的不同拷贝，仍需结合DNA测序判断是否存在SMN1的缺失；还未开发出可商业应用的软件工具进行客观计算，峰型诊断较为困难。荧光实时定量PCR技术能够检测SMN1的拷贝数，但是该方法程序复杂，所需的荧光标记的探针相对比较昂贵，检测成本高，结果分析难度大等原因而难以在临床上推广使用。多重连接依赖性探针扩增(Mutiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA)，需要通过变性、杂交、连接、PCR扩增及毛细管电泳，步骤繁多。因此，建立一种快速、高效、低廉的SMN1和SMN2基因的检测及区分SMN1和SMN2单碱基差异的方法尤为重要。
荧光检测法是目前公认的最灵敏的光化学信号检测方法之一，在生物分析检测领域应用广泛。G-四链体是一种高级DNA结构，具有很强的多态性和可调节构象，本身为负电性，带正电的金属离子(K+、Na+和Pb2+等)或有机小分子可以对其起到稳定作用。N-甲基卟啉二丙酸IX(N-Methyl mesoporpHyrin IX，NMM)是带负电的卟啉，对G-四链体螺旋结构具有显著的特异性，只能与G-四链体结合，而不识别双链、三链或单链结构。NMM本身荧光极弱，但是嵌入G-四链体结构中其荧光信号就有20倍增强。
发明内容
本发明由上海市卫生和计划生育委员会科研课题20164Y0044、国家自然科学基金青年项目81401053、同济大学中央高校基本科研业务费专项资金-学科交叉类1380219168、国家自然科学基金21671150和国家自然科学基金21877084资助完成。
本发明的目的是提供了一种高效灵敏、简单、快速、廉价、选择性好的基于生物传感器的基因检测试剂盒及其应用。
具体的，发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明第一方面公开了一种基于生物传感器的脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：荧光DNA分子探针HP-G2、荧光DNA分子探针G1、带正电的金属离子溶液和荧光染料溶液；
所述HP-G2具有发夹结构；加入靶DNA后，G1和HP-G2在带正电的金属离子溶液中能够形成分子间G-四链体DNA结构，所述荧光染料溶液能特异性识别G-四链体DNA结构。
优选的，所述HP-G2包括a链、b链和c链；所述a链为辅助互补DNA链，b链与靶DNA互补配对，c链包含三个重复G片段，并将其设计在分子信标探针的互补区域；所述G1探针包括d链和e链，d链包含一个重复G片段，e链与靶DNA能够互补配对。所述HP-G2和G1的结构示意图如图1所示，c链包含三个重复G片段，并将其设计在分子信标探针的互补区域，更好的降低了体系背景信号。
优选的，所述带正电的金属离子为K+、Na+和Pb2+。在本发明的一具体实施例中，带正点的金属离子为K+，G1和HP-G2作为荧光分子探针在K+溶液体系中形成分子间G-四链体DNA结构。
更优选的，所述带正电的金属离子溶液为TEK缓冲液，所述TEK缓冲溶液中含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钾盐和氯化钾。
应当理解，本发明的带正电的金属离子溶液并不限于TEK缓冲液，本领域技术人员根据需要能够选择任意合适的缓冲液来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
在本发明的一具体实施例中，所述TEK缓冲溶液中含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA-2K)和氯化钾(KCl)，其中，Tris的浓度为8～12mmol/L，EDTA-2K的浓度为0.5～1.5mmol/L，KCl的浓度为80～120mmol/L，并且TEK缓冲溶液的pH为7.0～7.5。
在本发明的一些具体实施例中，所述HP-G2包括HP1-G2和HP2-G2，HP1-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGAAACCCTGTAATGGGTAGGGCGGG-3’；HP2-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGTTTAAAACCCTTGGGTAGGGCGGG-3’；G1的核苷酸序列为：5’-TGGGTAAGATGAGATGTCTT-3’。
本发明第二个方面公开了上述的试剂盒检测脊肌萎缩症致病基因的方法，包括以下步骤：
S1：设计并合成荧光DNA分子探针HP-G2和G1；
S2、构建基于DNA构象转变的荧光生物传感器：选用基因SMN1和SMN2作为DNA模板，选用可以特异性识别G-四链体DNA的荧光染料，分别构建SMN1和SMN2基因检测的生物传感器，分别对SMN1和SMN2进行基因检测，通过荧光和可视化区分SMN1和SMN2的单碱基差异。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
优选的，步骤S2中的检测包括如下步骤：
S21：根据被检测SMN1和SMN2基因的实际长度设计分子信标探针中所需要的各部分DNA序列，并对分子信标探针环状部分碱基错配位置进行筛选，得到筛选后的DNA分子探针HP1-G2和HP2-G2；
S22：分别选用荧光DNA分子探针HP1-G2、HP2-G2和G1，分别与单碱基差异的SMN1和SMN2基因一起加入带正电的金属离子溶液中，震荡均匀、离心后，在室温下进行培养，得到培养好的样品；
S23：向S22得到的培养好的样品中加入荧光染料，室温下避光培养一段时间后，测荧光光谱。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S21之前、步骤S21和S22之间、步骤S22和S23之间、步骤S23之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
在本发明的一具体实施例中，在S21中，所述DNA分子探针环状部分18个碱基，并且碱基错配设计在环状部分，其中检测SMN1时，碱基错配的位置处在靠近5′端的第4个碱基处；检测SMN2时，碱基错配的位置处在靠5′端的第8个碱基处。
优选的，S22中，室温下的培养时间为35-45min；S23中，荧光染料为NMM(N-甲基卟啉二丙酸IX)，所述NMM的浓度为1.8～2.2μmol/L，G-四链体DNA结构与NMM的摩尔浓度比例为1：(1～3)。
应当理解，本发明的荧光染料并不限于NMM，本领域技术人员根据需要能够选择任意合适的荧光染料来完成本发明，并且在本发明的保护范围之内。
在本发明的一具体实施例中，该方法是构建了基于DNA构象转变的生物传感器，选用脊髓性肌萎缩症(SMA)的致病基因(SMN)作为DNA模板，选用可以特异性识别G-四链体DNA的荧光染料NMM(N-甲基卟啉二丙酸IX)。该构建方法既实现了分别对SMN1和SMN2基因的检测，又实现了荧光和可视化区分SMN1和SMN2的单碱基差异。
反应原理为：利用NMM(N-甲基卟啉二丙酸IX)是带负电的卟啉，对G-四链体螺旋结构具有显著的特异性，只能与G-四链体结合，而不识别双链、三链或单链结构，NMM本身荧光极弱，但是嵌入G-四链体结构中其荧光信号就有20倍增强的特性。
优选的，S23中，所述1.8～2.2μmol/L的NMM溶液是由100μmol/L的NMM存储液稀释所得；所述100μmol/L的NMM存储液是通过以下步骤制得：将购买的粉状NMM溶于二甲基亚砜溶剂中，混合得到5mmol/L的NMM存储液，-20℃避光保存，备用；然后取适量5mmol/L的NMM存储液，加入超纯水，配制成浓度为100μmol/L的NMM存储液，4℃避光保存，备用。
本发明第三个方面公开了上述的试剂盒或上述的方法具有如下应用：
a)用于检测致病基因的单碱基错配、缺失或插入；
b)用于脊肌萎缩症的基因诊断。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明直接选用了脊髓性肌萎缩疾病(SMA)致病基因SMN作为DNA模板，为了克服现有技术中在SMN1、SMN2基因及区分SMN1、SMN2基因单碱基差异上的困难，本发明人进行了深入研究，设计了基于DNA构象转变的生物传感器，选用了一种荧光DNA分子探针及可以特异性识别G-四链体DNA的荧光染料NMM，使体系中对比加入单碱基差异的SMN1与SMN2致病基因会产生不同的荧光信号，最终体系实现了既可检测SMN1基因，也可检测SMN2基因，并同时实现了对SMN基因单碱基差异的区分，本发明方法在疾病基因诊断及临床诊断中具有重要的应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在如下几个方面：
(1)本发明的检测手段为免标记的荧光检测法，具有高效灵敏、简单、快速、廉价、选择性好、且信号的识别简单的特点，在实际应用中通过颜色以及荧光图谱就可进行识别，解决了在之前的检测技术中存在复杂操作或者使用精密的仪器观察的困难。
(2)本发明直接选用脊髓性肌萎缩疾病(SMA)致病基因SMN作为DNA模板，并可分别实现快速检测SMN1和SMN2及快速区分SMN1和SMN2的单碱基差异，利用本发明方法可进一步实现对SMA进行临床诊断，对SMA疾病的研究有良好的指导作用。
附图说明
图1为本发明实施例2中设计的一种荧光DNA分子探针结构示意图；
图2为本发明实施例2中基于DNA构象转变对SMN1基因检测的原理示意图；
图3为本发明实施例2中DNA探针链筛选的结果图；
图4为本发明实施例2中体系培养温度优化的结果图；
图5为本发明实施例2中SMN1基因检测的荧光光谱图；
图6为本发明实施例2中单碱基差异的SMN1和SMN2基因紫外-可见光照射的结果图(左图和右图分别为加了SMN1基因和SMN2基因的反应体系)；
图7为本发明实施例2中检测SMN1基因荧光传感器的选择性结果图；
图8为本发明实施例3中基于DNA构象转变对SMN2基因检测的原理示意图；
图9为本发明实施例3中DNA探针链筛选的结果图；
图10为本发明实施例3中体系培养温度优化的结果图；
图11为本发明实施例3中SMN2基因检测的荧光光谱图；
图12为本发明实施例3中单碱基差异的SMN1和SMN2基因紫外-可见光照射的结果图(左图和右图分别为加了SMN2基因和SMN1基因的反应体系)；
图13为本发明实施例3中检测SMN2基因荧光传感器的选择性结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的实施例中主要是通过选用与脊髓性肌萎缩症(SMA)直接相关的基因SMN1和SMN2作为DNA模板，分别构建了SMN1和SMN2基因检测的生物传感器，并同时实现了对SMN1和SMN2基因单碱基差异的区分，利用其方法可进一步实现对SMA进行临床诊断，对SMA疾病的研究有着良好的指导作用。
实施例1
本实施例公开了一种基于生物传感器的脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：荧光DNA分子探针HP-G2、荧光DNA分子探针G1、带正电的金属离子溶液和荧光染料溶液；
所述HP-G2具有发夹结构；加入靶DNA后，G1和HP-G2在带正电的金属离子溶液中能够形成分子间G-四链体DNA结构，所述荧光染料溶液能特异性识别G-四链体DNA结构。
所述HP-G2包括a链、b链和c链；所述a链为辅助互补DNA链，b链与靶DNA互补配对，c链包含三个重复G片段，并将其设计在分子信标探针的互补区域；所述G1探针包括d链和e链，d链包含一个重复G片段，e链与靶DNA能够互补配对。
所述带正电的金属离子溶液为TEK缓冲液，所述TEK缓冲溶液中含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钾盐和氯化钾。
所述HP-G2包括HP1-G2和HP2-G2，HP1-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGAAACCCTGTAATGGGTAGGGCGGG-3’(SEQ N0:1)；HP2-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGTTTAAAACCCTTGGGTAGGGCGGG-3’(SEQ N0:2)；G1的核苷酸序列为：5’-TGGGTAAGATGAGATGTCTT-3’(SEQN0:3)。
实施例2
本实施例公开了一种利用实施例1所述的试剂盒检测脊肌萎缩症致病基因的方法，包括以下步骤：
第一步，体系所用缓冲溶液及荧光染料存储液的配制：
TE缓冲液的配制(Tris(三羟甲基氨基甲烷)：10mM；EDTA(乙二胺四乙酸)：1mM；pH＝7.4)：分别准确称取Tris 0.6057g，EDTA-2K 0.2022g于500mL烧杯中，用400mL超纯水将其完全溶解，在pH计指示下，用稀盐酸溶液慢慢调节pH值至7.4，转移至500mL容量瓶中，然后用超纯水三次清洗烧杯及玻璃棒，润洗液全部转入容量瓶，最后用超纯水定容，混合均匀后备用。
TEK缓冲液的配制(Tris：10mM；EDTA：1mM；KCl(氯化钾)：100mM，pH＝7.4)：分别准确称取Tris 0.6057g，EDTA-2K 0.2022g，KCl 3.7275g于500mL烧杯中，用400mL超纯水将其完全溶解，在pH计指示下，用稀盐酸溶液慢慢调节pH值至7.4，转移至500mL容量瓶中，然后用超纯水三次清洗烧杯及玻璃棒，润洗液全部转入容量瓶，最后用超纯水定容，混合均匀后备用。
NMM存储液(2mL，100μM)的配制：将购买的5mg粉状NMM溶于1.72mL DMSO溶剂中，混合均匀，即可得到5mM的NMM存储液，-20℃避光保存，备用；然后再取40μL已配好的NMM(5mM)存储液，加入1960μL超纯水，混合均匀，即配制成浓度为100μM的NMM存储液，4℃避光保存，备用。
第二步，荧光DNA分子探针的设计与形成：
首先设计了如图1所示的荧光DNA分子探针，其中检测SMN1所用为发卡结构HP1-G2探针，包括a、b、c链三个部分，a链为辅助DNA链，b链可与靶DNA互补配对，c链包含三个重复G片段，并将其设计在分子信标探针的互补区域，更好地降低了体系背景信号；G1探针包括d、e链两个部分，d链包含一个重复G片段，e链可与靶DNA互补配对；加入靶DNA后，G1和HP-G2可以作为荧光分子探针在K+溶液体系中形成分子间G4链体DNA结构。图2为基于DNA构象转变对SMN1基因检测的原理示意图。
此外，对b链的碱基错配位置进行了筛选，筛选结果如图3所示，其中涉及到的核苷酸序列如表1所示，最终碱基错配的位置处在靠近5′端的第4个碱基处时，检测信号最佳。
表1检测SMN1方案中，DNA序列的碱基位置设计表
Figure BDA0002086951690000081
分子发卡结构的HP1-G2探针的形成：将购买的1离心管HP1-G2(10OD)引物，在离心机中以12000r/min离心2min,再加入相应体积的TEK缓冲溶液溶解，用振荡器使其混合均匀，密封，于90℃恒温箱中处理10min，然后缓慢冷却至室温。处理冷却后的DNA浓度为100μM，放入4℃冰箱中保存备用。
第三步，检测SMN1基因荧光生物传感器的构建：
准备好已加入相应体积TEK缓冲溶液的a、b、c三个样品管，然后，a中分别加入G1(1μM)和HP1-G2(1μM)，b中分别加入G1(1μM)、HP1-G2(1μM)和SMN1(1μM)，c中分别加入G1(1μM)、HP1-G2(1μM)和SMN2(1μM)，充分混合均匀、离心，室温静置培养40min(培养时间优化见图4)后，依次加入NMM(2μM)，室温避光静置40min，测荧光光谱，检测结果如图5所示，其中加了SMN1基因的实验组，其荧光强度明显高于加了SMN2基因的对照组。由此我们可以推断，由于SMN2基因存在单碱基错配，与体系所加荧光DNA分子探针不易形成G4链体DNA。加入NMM后，体系荧光强度很低，与实验组的荧光信号相差近4倍，说明设计的荧光生物传感器既可以实现对SMN1基因检测，又能区别SMN1与SMN2基因的单碱基差异。
体系所用DNA序列：
G1：5’-TGGGTAAGATGAGATGTCTT-3’(SEQ N0:3)；
HP1-G2：5’-GCCCTACTTTGAAACCCTGTAATGGGTAGGGCGGG-3’(SEQ N0:1)；
SMN1：5’-AAGACATCTCATCTTTTTACAGGGTTTCAAA-3’(SEQ N0:4)；
SMN2：5’-AAGACATCTCATCTTTTTACAGGGTTTTAAA-3’(SEQ N0:5)；
基于DNA构象转变对SMN1基因检测的原理如图2所示。
紫外-可见光照射法可视化检测SMN1：取两个已加入相应体积TEK缓冲液的样品管(分别标记为1和2)，固定G1(1μM)、HP1-G2(1μM)和NMM(2μM)，分别向1中加入SMN1(1μM)，2中加入SMN2(1μM)，室温下进行培养。然后，将培养好的溶液转移至石英比色皿中，在紫外灯下用365nm波长进行照射。实验结果如图6所示，加了SMN1基因的反应体系发出红色荧光，加了SMN2基因的反应体系基本不发荧光，说明基于本发明的设计方案，可以利用紫外-可见光照射实现SMN1的可视化检测，以及实现了用裸眼区分SMN1和SMN2的单碱基差异。检测SMN1基因荧光传感器的选择性结果图如图7所示，其中涉及到的核苷酸序列如表2所示。
表2检测SMN1基因荧光出传感器涉及的核苷酸序列
Figure BDA0002086951690000091
实施例3
本实施例公开了一种利用实施例1所述的试剂盒检测脊肌萎缩症致病基因的方法，基于DNA构象转变对SMN2基因检测的原理示意图如图8所示检测SMN2方案中，DNA探针链筛选的结果图如图9所示，图9中涉及到的核苷酸序列如表3所示。
表3图9中涉及到的核苷酸序列
Figure BDA0002086951690000101
具体包括以下步骤：
第一步，采用与实施例2相同的缓冲溶液及荧光染料存储液。
第二步，采用与实施例2相同结构的荧光DNA分子探针，不同之处在于碱基错配位置不同，具体区别在于：
(1)对b链的碱基错配位置进行了筛选，筛选结果如图9所示，最终碱基错配的位置处在靠近5′端的第8个碱基处时，检测信号最佳。
(2)所用探针序列：
HP2-G2：5’-GCCCTACTTTGTTTAAAACCCTTGGGTAGGGCGGG-3’(SEQ N0:2)；
采用与实施例2相同的方法形成HP2-G2探针，处理冷却后的DNA浓度为100μM，放入4℃冰箱中保存备用。
第三步，检测SMN2基因荧光生物传感器的构建：采用与实施例2相同的构建方法，培养时间优化见图10，不同之处在于所选用的SMN2和SMN1的基因序列略有差异，以及分别加入SMN1和SMN2信号产生强度与实施例2恰好相反，具体区别在于：
(1)所用基因序列为：
SMN2：5’-AAGACATCTCATCTTCAGGGTTTTAAACAAA-3’(SEQ N0:6)；
SMN1：5’-AAGACATCTCATCTTCAGGGTTTCAAACAAA-3’(SEQ N0:7)；
基于DNA构象转变对SMN2基因检测的原理如图8所示。
(2)检测结果如图11所示，其中加了SMN2基因的实验组(b)，其荧光强度明显高于加了SMN1基因的对照组(c)，a为体系背景信号。由此我们可以推断，由于SMN1基因存在单碱基错配，与体系所加荧光DNA分子探针不易形成G4链体DNA。加入NMM后，体系荧光强度很低，与实验组的荧光信号相差4倍多，说明设计的荧光生物传感器既可以实现对SMN2基因检测，又能区别SMN2与SMN1基因的单碱基差异。
紫外-可见光照射法可视化检测SMN2：采用与实施例2相同的构建方法，不同之处在于，分别向1中加入SMN2(1μM)，2中加入SMN1(1μM)，室温下进行培养。然后，将培养好的溶液转移至石英比色皿中，在紫外灯下用365nm波长进行照射。结果如图12所示，加了SMN2基因的反应体系发出红色荧光，加了SMN1基因的反应体系基本不发荧光，说明基于我们设计的方案，可以利用紫外-可见光照射实现SMN2的可视化检测，以及实现了用裸眼区分SMN2和SMN1的单碱基差异。检测SMN1基因荧光传感器的选择性结果图如图13所示，其中涉及到的核苷酸序列如表4所示。
表4图13中涉及到的核苷酸序列
Figure BDA0002086951690000121
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 同济大学
<120> 一种脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccctacttt gaaaccctgt aatgggtagg gcggg 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccctacttt gtttaaaacc cttgggtagg gcggg 35
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggtaagat gagatgtctt 20
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagacatctc atctttttac agggtttcaa a 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagacatctc atctttttac agggttttaa a 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagacatctc atcttcaggg ttttaaacaa a 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aagacatctc atcttcaggg tttcaaacaa a 31
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgggtaagag atgtctt 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtaagat gagatgtctt 20
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccctacgat tttgtttgaa actgggtagg gcggg 35
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aagacatctc atctttgttt caaacaaaat c 31
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagacatctc atctttgttt taaacaaaat c 31
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgggttttta agatgagatg tctt 24
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccctacgat tttgtttgaa actttttggg tagggcggg 39
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctatttg aaaccctgta atgggtaggg cggg 34
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aagacatctc atctttttac agggtttcaa a 31
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aagacatctc atctttttac agggttttaa a 31
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccctacgaa accctgtaag gatgggtagg gcggg 35
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aagacatctc atcttttcct tacagggttt c 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aagacatctc atcttttcct tacagggttt t 31
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccctacttt gtttgaaacc cttgggtagg gcggg 35
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aagacatctc atcttcaggg tttcaaacaa a 31
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aagacatctc atcttcaggg ttttaaacaa a 31
<210> 24
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagacatctc atctttttac agggattcaa a 31
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aagacatctc atctttttac atggtttcaa a 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aagacatctc atctttttac aggctttcaa a 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aagacatctc atctttttac aggcttttaa a 31
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aagacatctc atctttttac atgcttttaa a 31
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagacatctc atctttttcc atgcatttaa a 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctagactac gacattatct ctacacttac t 31
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gccctacttt gtttaaaacc cttgggtagg gcggg 35
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aagacatctc atcttcaggg ttttaaacaa a 31
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aagacatctc atcttcaggg tttcaaacaa a 31
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gccctacaaa accctgtaag gatgggtagg gcggg 35
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aagacatctc atcttctcct tacagggttt t 31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aagacatctc atcttctcct tacagggttt c 31
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gccctacgtt taaaaccctg tatgggtagg gcggg 35
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagacatctc atcttctaca gggttttaaa c 31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aagacatctc atcttctaca gggtttcaaa c 31
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gccctacttt tgattttgtt tatgggtagg gcggg 35
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aagacatctc atcttctaaa caaaatcaaa a 31
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aagacatctc atcttccaaa caaaatcaaa a 31
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gccctactga ttttgtttaa aatgggtagg gcggg 35
<210> 44
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
aagacatctc atcttctttt aaacaaaatc a 31
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
aagacatctc atcttctttc aaacaaaatc a 31
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aagacatctc atcttcaggg cttcaaacaa a 31
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aagacatctc atcttcaggg cttctaacaa a 31
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
aagacatctc atcttcaggt cttctaacaa a 31
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tctagactac gacattatct ctacacttac t 31

Claims (10)

1.一种基于生物传感器的脊肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，包括：荧光DNA分子探针HP-G2、荧光DNA分子探针G1、带正电的金属离子溶液和荧光染料溶液；
所述HP-G2具有发夹结构；加入靶DNA后，G1和HP-G2在带正电的金属离子溶液中能够形成分子间G-四链体DNA结构，所述荧光染料溶液能特异性识别G-四链体DNA结构。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述HP-G2包括a链、b链和c链；所述a链为辅助互补DNA链，b链与靶DNA互补配对，c链包含三个重复G片段，并将其设计在分子信标探针的互补区域；所述G1探针包括d链和e链，d链包含一个重复G片段，e链与靶DNA能够互补配对。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述带正电的金属离子溶液为TEK缓冲液，所述TEK缓冲溶液中含有三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钾盐和氯化钾。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述HP-G2包括HP1-G2和HP2-G2，HP1-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGAAACCCTGTAATGGGTAGGGCGGG-3’；HP2-G2的核苷酸序列为：5’-GCCCTACTTTGTTTAAAACCCTTGGGTAGGGCGGG-3’；G1的核苷酸序列为：5’-TGGGTAAGATGAGATGTCTT-3’。
5.利用权利要求1-4中任意一项所述的试剂盒检测脊肌萎缩症致病基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：设计并合成荧光DNA分子探针HP-G2和G1；
S2、构建基于DNA构象转变的荧光生物传感器：选用基因SMN1和SMN2作为DNA模板，选用可以特异性识别G-四链体DNA的荧光染料，分别构建SMN1和SMN2基因检测的生物传感器，分别对SMN1和SMN2进行基因检测，通过荧光和可视化区分SMN1和SMN2的单碱基差异。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2中的检测包括如下步骤：
S21：根据被检测SMN1和SMN2基因的实际长度设计分子信标探针中所需要的各部分DNA序列，并对分子信标探针环状部分碱基错配位置进行筛选，得到筛选后的DNA分子探针HP1-G2和HP2-G2；
S22：分别选用荧光DNA分子探针HP1-G2、HP2-G2和G1，分别与单碱基差异的SMN1和SMN2基因一起加入带正电的金属离子溶液中，震荡均匀、离心后，在室温下进行培养，得到培养好的样品；
S23：向S22得到的培养好的样品中加入荧光染料，室温下避光培养一段时间后，测荧光光谱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在S21中，所述DNA分子探针环状部分18个碱基，并且碱基错配设计在环状部分，其中检测SMN1时，碱基错配的位置处在靠近5′端的第4个碱基处；检测SMN2时，碱基错配的位置处在靠5′端的第8个碱基处。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S22中，室温下的培养时间为35-45min；S23中，荧光染料为NMM，所述NMM的浓度为1.8～2.2μmol/L，G-四链体DNA结构与NMM的摩尔浓度比例为1：(1～3)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S23中，所述1.8～2.2μmol/L的NMM溶液是由100μmol/L的NMM存储液稀释所得；所述100μmol/L的NMM存储液是通过以下步骤制得：将购买的粉状NMM溶于二甲基亚砜溶剂中，混合得到5mmol/L的NMM存储液，-20℃避光保存，备用；然后取适量5mmol/L的NMM存储液，加入超纯水，配制成浓度为100μmol/L的NMM存储液，4℃避光保存，备用。
10.根据权利要求1-4任意一项所述的试剂盒或权利要求5-9任意一项所述的方法具有如下应用：
a)用于检测致病基因的单碱基错配、缺失或插入；
b)用于脊肌萎缩症的基因诊断。
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