CN112129736A - 粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光poct检测方法 - Google Patents

粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光poct检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种粘蛋白以及循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，涉及癌症检测技术领域，包括以下步骤：QDs选择性识别Ag+和C‑Ag+‑C的现象；选择性识别反应在mucin 1和CTCs可视化和荧光检测中的应用；核酸序列的设计。本发明的检测方法具有以下优点：选择mucin 1作为CTCs新型标志物；均相策略，简化操作步骤，易于实现；使用无酶核酸信号放大技术，可在室温下操作和反应；采用发光纳米材料作为信号分子，实现可视化快速分析；使用低成本高亲和力的核酸适配体作为识别探针，无酶核酸信号放大，均相操作，发光纳米材料作为信号分子，其成本可极大地降低。

Description

粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法
技术领域
本发明涉及癌症检测技术领域，尤其是涉及一种粘蛋白和循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法。
背景技术
恶性肿瘤对人类的生产生活带来了极大地影响，其活跃生长的肿瘤通常会向外周血中释放循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，简称CTCs)。越来越多的证据支持以CTCs作为一种液态活检标本来早期检测癌症复发，预后和监测治疗效果。CTCs数目非常稀少，良性疾病患者体内和正常人体内没有，早期肺癌患者体内数目稀少，但在整个癌症发展过程中均可被检测到，在疾病早期，CTCs可被用于预测复发风险，治疗过程中，可作为标志物评估治疗反应和指导治疗方案。从而实现早期诊断，早期治疗，复发检测，实现真正的个体化医疗。
现有医院CTCs检测方法和原理为：主要由免疫磁珠富集纯化、靶向探针标记和荧光定量PCR检测三个步骤组成。
(1)免疫磁珠富集纯化的作用是去除红细胞和绝大多数的白细胞；在获得患者血样后，采用红细胞裂解、离心的方法去除红细胞，然后用免疫磁珠的方式去除绝大多数的白细胞，得到样品中剩余的稀有细胞包括叶酸受体阳性细胞，达到对目标细胞富集的目的。
(2)靶向探针标记使用特异性小分子探针对叶酸受体阳性细胞进行标记，这种特异性小分子探针由识别叶酸受体的化学小分子与寡聚核苷酸偶联形成。在小分子探针与叶酸受体阳性细胞充分结合后，洗涤去除未结合的探针；然后洗脱受体结合的探针，用于后续定量检测。
(3)荧光定量PCR检测利用针对小分子探针设计的特异性引物，结合Taqman探针，采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对叶酸受体结合的小分子探针中的寡聚核苷酸进行定量检测；最终依据校准曲线定量检测，评估样品中叶酸受体细胞水平。
存在以下不足之处：以叶酸受体为CTCs标志物，然而部分细胞对叶酸受体的表达水平较低，即叶酸受体作为CTCs标志物，覆盖面不全；使用叶酸和叶酸受体识别对，捕获CTCs，使用磁珠辅助分离，检测过程为非均相，其操作复杂，影响实验结果准确性：使用聚合酶链式反应(PCR)作为信号放大技术，其需要蛋白酶参与，且反应为变温过程，需要成熟仪器；难以实现POCT分析，以及可视化读取：成本较高，单次收费2000-4000元，且仅仅可在大型医院内完成，其覆盖面较窄。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，以解决现有技术中采用叶酸受体作为循环肿瘤细胞的标志物时，由于部分细胞对叶酸受体的表达水平较低，导致覆盖面不全；检测过程非均相，操作复杂，影响实验结果准确性；以及难以实现POCT分析等技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种以粘蛋白作为标志物的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法。
为了实现上述目的之一，本发明一实施例提供了一种粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，包括以下步骤：
在MOPS缓冲液中加入HP-DNA，AgNO3或者Hg2+溶液，室温下避光反应，形成具有C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构的A液；
直接向A液中加入不同浓度的粘蛋白，室温下反应后，加入发光QDs，反应后测定荧光值；
或者在MOPS缓冲液中加入P1-DNA和核酸适配体，室温下反应，形成双链DNA后，加入不同浓度的粘蛋白，完成竞争反应，释放游离P1-DNA链，形成B液，将B液加入A液，再加入Helper-DNA，室温反应，最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
POCT，即时检验(point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测((bedside testing)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。
本发明的核酸序列可以修改，核酸信号放大技术可换为杂交链式反应(HCR)等，本发明对此不做限定。
优选地，当直接向A液中加入不同浓度的粘蛋白时，荧光信号强度变化与0.25-10ng/mL浓度范围内的粘蛋白呈现线性关系，其线性方程为Y＝-633C+9664，线性相关性系数R2＝0.990。
优选地，当将B液加入A液时，粘蛋白在1fg/mL-1pg/mL浓度范围内，紫外灯照射下，肉眼可区分fg/mL级别的粘蛋白，颜色由红色逐渐变浅，然后逐渐变为蓝色。
优选地，当将B液加入A液时，粘蛋白在1fg/mL-1pg/mL浓度范围内，荧光信号降低与粘蛋白浓度的对数呈现线性关系，其线性方程为Y＝-922LogC-8329，线性相关性系数R2＝0.976。
优选地，所述发光QDs为CdTe QDs或者CdSe QDs。
为了实现上述目的之二，本发明一实施例提供了一种循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，包括以下步骤：
缓冲液中加入HP-DNA和AgNO3/Hg2+溶液，室温下避光反应，形成具有C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构的A液；
缓冲液中加入P1-DNA和核酸适配体，室温下反应一段时间，加入不同浓度的循环肿瘤细胞，继续反应，释放游离P1-DNA，形成B液：
将B液加入A液，再加入Helper-DNA，室温反应；
最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
优选地，其特征在于，荧光信号的降低与100-105cells/mL范围内循环肿瘤细胞浓度的对数呈线性关系，其线性方程为Y＝-1029LogN+7771，线性相关系数R2为0.994。
优选地，所述HP-DNA包括HP1-DNA和HP2-DNA；
在含有AgNO3/Hg2+的缓冲溶液中分别加入HP1-DNA和HP2-DNA，形成两种C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构，室温下避光反应后混合，形成A液；
在缓冲液中加入P1-DNA、P2-DNA和核酸适配体，室温下反应形成适配体-P1-P2双链DNA，加入待测不同浓度的循环肿瘤细胞反应，释放出游离P1链和P2链，形成B液；
将B液加入A液，再加入Helper-DNA1和Helper-DNA2，室温反应；
最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
优选地，循环肿瘤细胞在100-105cells/mL浓度范围内，紫外灯照射下，肉眼可见颜色由红色逐渐变浅。
优选地，荧光信号的降低与100-105cells/mL范围内循环肿瘤细胞浓度的对数呈线性关系，其线性方程为Y＝-1171LogN+8608，线性相关系数R2为0.976。
优选地，所述发光QDs为CdTe QDs或者CdSe QDs。
本发明提供的粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，具有以下技术效果：
(1)可视化/荧光分析方法，用于粘蛋白的检测，其分析灵敏度较高，均相策略，简化操作步骤，易于实现自动化，满足现有医学检测需要。
(2)使用无酶核酸信号放大技术，可在室温下操作和反应；
(3)采用发光纳米材料作为信号分子，实现可视化快速分析；
(4)使用低成本高亲和力的核酸适配体作为识别探针，无酶核酸信号放大，均相操作，发光纳米材料作为信号分子，其成本可极大地降低。
本发明提供的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，具有以下技术效果：
(1)采用粘蛋白作为循环肿瘤细胞新型标志物，克服了以叶酸受体为循环肿瘤细胞标志物，部分循环肿瘤细胞对叶酸受体的表达水平较低，即叶酸受体作为循环肿瘤细胞标志物，覆盖面不全的缺陷；
(2)采用粘蛋白作为循环肿瘤细胞新型标志物，克服了使用叶酸和叶酸受体识别对，捕获循环肿瘤细胞，使用磁珠辅助分离，检测过程为非均相，操作复杂，影响实验结果准确性的缺陷；
(3)采用粘蛋白作为循环肿瘤细胞新型标志物，克服了使用聚合酶链式反应(PCR)作为信号放大技术，其需要蛋白酶参与，且反应为变温过程，需要成熟仪器的缺陷，以及克服了难以实现POCT分析，以及可视化读取的缺陷；同时降低成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为基于QDs选择性识别Ag+和C-Ag+-C现象的粘蛋白的可视化和荧光检测原理图；
图2所示为无放大粘蛋白分析条件优化图；
图3所示为无放大粘蛋白分析性能和选择性荧光图；
图4所示为基于QDs选择性阳离子交换和催化发卡组装放大辅助的mucin1和循环肿瘤细胞的高灵敏可视化和荧光检测原理图；
图5所示为CHA辅助mucin 1分析形成C-Ag+-C发卡结构和阳离子交换反应条件优化图；
图6所示为CHA辅助mucin 1分析CHA反应条件优化图；
图7所示为CHA辅助mucin 1分析性能荧光图；
图8所示为CHA辅助A549细胞分析荧光图；
图9所示为基于QDs选择性阳离子交换和并联催化发卡组装放大辅助的细胞的高灵敏可视化和荧光检测原理图；
图10所示为并联CHA辅助A549细胞分析荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1：CdTe QDs的合成
CdTe QDs是根据一锅法合成的：
首先，将0.5mmol CdCl2和0.20g的柠檬酸三钠溶解在50毫升的水中，向以上溶液中加入的52μL巯基丙酸(MPA)，使用NaOH溶液，将以上混合物溶液pH调节至10.5。
然后，将0.1mmol Na2TeO3和50mg KBH4加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈红色，在紫外灯下呈现出强烈的红色荧光。
最后，通过沉淀(使用正丙醇)和离心(11000rpm，30分钟)纯化CdTe QDs溶液。
以上合成的MPA-CdTe QDs在使用前保存在4℃。
实施例2：粘蛋白(mucin 1)的无放大检测
图1所示为无核酸信号放大时的策略，其粘蛋白特异性识别C-Ag+-C发卡结构中的适配体链，将其打开释放出游离的Ag+，随后Ag+淬灭QDs，即通过监测反应前后溶液的荧光信号变化或者溶液颜色改变，图1所示，红色逐渐变浅，可实现对mucin 1浓度的检测和半定量分析。
分析步骤：在200μL 10mM MOPS缓冲液中加入40μL 1μM HP-DNA和48μL 5μM AgNO3溶液，室温下避光反应1小时，形成C-Ag+-C结构。
再向溶液中加入40μL不同浓度的mucin 1，室温下反应30min后加入10μL CdTeQDs，反应10min后测定荧光值。
条件优化：为了获得更优的分析性能，先对实验条件进行了优化，如图2所示，(A)所示为探针DNA和Ag+的比例；(B)所示为形成C-Ag+-C发卡结构时间；(C)所示为粘蛋白和C-Ag+-C发卡结构竞争反应时间；(D)所示为阳离子交换反应时间；(E)和(F)所示为QDs的体积，其中误差线源于三次以上重复测量。
实验结果显示最优的实验条件分别为：探针DNA和Ag+的比例为1:6，如图2A所示；60分钟为C-Ag+-C发卡结构的形成时间，如图2B所示；粘蛋白和C-Ag+-C发卡结构竞争反应时间为30分钟，如图2C所示；阳离子交换反应可在10分钟内完成，如图2D所示；QDs的体积选择为1微升原液时可获得最大的信号差值，即经过稀释后为10微升，如图2E和图2F所示。
分析性能：在以上优化后的条件下，对该体系的分析性能进行了考察。如图3A和3B所示，其中图3A和图3B为分析性能，随着目标mucin 1浓度增大，溶液的荧光信号在逐渐降低。线性拟合后，荧光信号强度变化与0.25-10ng/mL浓度范围内的mucin 1呈现良好的线性关系，其线性方程为Y＝-633C+9664，线性相关性系数为R2＝0.990。
随后，选择高浓度的共存蛋白作为潜在干扰物，对该体系的选择性进行了考察，如图3C和图3D，高浓度的干扰蛋白未引起显著的荧光信号降低，与空白溶液信号相似，而低浓度的目标mucin 1引起了较大的信号降低，即该体系具有良好的目标选择性。
实施例3：Mucin 1和A549细胞的CHA辅助放大检测
在本实施例中循环肿瘤细胞采用A549细胞。
如图4所示，为了进一步改善分析灵敏度，将无酶催化发卡组装核酸信号放大引入，将目标蛋白和细胞的检测，转化为对核酸链的分析，同时重复使用核酸探针链，即目标蛋白和A549细胞浓度增大时，探针核酸被重复使用，释放出尽可能多的Ag+，导致QDs荧光信号降低显著，实现信号放大的目的。
Mucin 1分析步骤：
A液：在200μL 10mM MOPS缓冲液中加入40μL 1μM HP-DNA和48μL 5μM AgNO3溶液，室温下避光反应1小时，形成C-Ag+-C结构。
B液：在10μL 10mM MOPs缓冲液中加入4μL 10μM P1-DNA和4μL 10μM Aptamer，室温下反应30min形成双链DNA后，再加入4μL不同浓度的mucin 1蛋白，反应30min完成竞争反应释放出游离P1-DNA链。
将B液加入A液，再加入4μL 10μM的Helper-DNA，室温下反应1.5小时完成CHA放大反应。
最后加入10μL的CdTe QDs，反应10min后测荧光值。
A549细胞分析步骤：
A液：在50μL 10mM MOPS缓冲液中加入4μL 10μM HP-DNA和12μL 20μM AgNO3溶液，室温下避光反应1小时，形成C-Ag+-C结构。
B液：在50μL 10mM MOPs缓冲液中加入4μL 10μM P1-DNA和4μL 10μM Aptamer，室温下反应30min后，加入50μL不同浓度的活细胞，继续反应30min释放出游离P1-DNA。
随后，将B液加入A液，再加入4μL 10μM的Helper-DNA，室温下反应1.5小时。
最后加入10μL的CdTe QDs，反应10min后测荧光值。
条件优化：同样，对实验条件进行了优化，如图5所示，(A)形成C-Ag+-C发卡结构时间，(B)和(C)探针DNA和Ag+的比例；(D)和(E)QDs的体积，(F)阳离子交换反应时间；误差线源于三次以上重复测量。
最优的实验条件分别为：60分钟的形成C-Ag+-C发卡结构时间，如图5A所示；6:1的Ag+和HP-DNA比例，如图5B和图5C所示；10微升的稀释10倍的QDs体积，如图5D和图5E所示；10分钟的阳离子交换反应时间，如图5F所示。
条件优化：CHA辅助mucin 1分析CHA反应条件优化，如图6所示，(A)形成P1-适配体dsDNA时间；(B)mucin 1打开P1-适配体dsDNA时间；(C)helper DNA的浓度；(D)CHA反应时间。误差线源于三次以上重复测量。
最优的实验条件分别为：30分钟用于形成探针DNA-适配体双链，如图6A所示；mucin 1与适配体结合，打开双链时间为30分钟，如图6B所示；helper DNA浓度为10微摩尔每升，如图6C所示；CHA反应时间为2小时，如图6D所示。
在CHA放大技术的辅助下，mucin 1的分析灵敏度得到了极大的提高，如图7所示，(A)Mucin 1可视化分析；(B)和(C)荧光分析；(D)和(E)分析选择性。误差线源于三次以上重复测量。
如图7A和7B所示，溶液荧光信号随着mucin 1浓度的增加在逐渐降低，即由深红色变为浅红色，再变为蓝色，且在fg/mL浓度级别时就较为显著。首先考察了可视化分析的可行性，如图7A所示，在紫外灯照射下，肉眼可轻松区分fg/mL级别的mucin 1蛋白，且在1fg/mL-1pg/mL范围内颜色在逐渐变浅，即可视化分析是可行的。
随后，使用成熟荧光仪对以上溶液信号进行监测，且线性拟合后可发现，在1fg/mL-1pg/mL浓度范围内，溶液荧光信号降低与mucin 1浓度的对数呈现良好的线性关系，其线性方程为Y＝-922LogC-8329，R2＝0.976，如图7B所示。
在使用高浓度干扰蛋白进行分析时，发现其引起的溶液荧光信号变化与空白相似，而低浓度(10-13和10-12g/mL)的目标mucin 1可引起显著的荧光信号降低，即该方法的选择性良好，其主要源于目标mucin 1与核酸适配体的高特异性识别，以及核酸信号放大策略可将较小的体系差距扩大。
随后，鉴于循环肿瘤细胞表面会大量表达mucin 1蛋白，尝试将以上mucin 1体系直接用于细胞检测，使用A549细胞作为代表，其检测结果如图8所示，(A)可视化分析；(B)和(C)荧光分析，误差线源于三次以上重复测量。
该CHA辅助的mucin 1分析体系可成功用于A549细胞的定量分析。如图8A，该体系可裸眼读取1000cells/mL浓度的细胞，其A549细胞数量为50cells。随后，使用成熟荧光仪检测时，发现荧光信号的降低与100-105cells/mL范围内细胞浓度的对数呈现良好线性关系，其线性方程为Y＝-1029LogN+7771，线性相关系数R2为0.994，如图8B和8C所示。该实验结果表明，使用mucin 1作为肿瘤细胞的生物标志物是可行的，且其可用于肿瘤细胞的定量分析。
实施例4：A549细胞的并联CHA辅助放大检测
在以上实验结果的启发下，随后使用A549细胞的适配体链作为识别探针，设计并联CHA信号放大策略，探讨其用于A549细胞定量的可行性。如图9所示，设计P1和P2链，其与A549适配体链互补，形成Aptamer-P1-P2双链。在A549细胞存在时，细胞与适配体结合，释放出P1和P2链。
释放出的P1和P2链，分别与两个包含C-Ag+-C的发卡结构H1和H3结合，释放出游离的Ag+，同时形成P1-H1和P2-H3双链DNA。随后，两个Helper DNA(H2和H4)分别与P1-H1和P2-H3双链DNA发生竞争杂化反应，形成更加稳定的H1-H2和H3-H4双链DNA，同时释放出P1和P2。
释放出的游离P1和P2继续发生以上反应，引发第二轮的CHA放大反应，即重复使用P1和P2，触发释放出尽可能多的Ag+，淬灭QDs的荧光。即该策略依然是将细胞的检测转化为对P1和P2链的分析，其依然保持均相操作等优点。
A549细胞分析步骤：
A液：向含12μL 20μM AgNO3的50μL 10mM MOPS缓冲液中分别加入4μL 10μM HP1或者4μL 10μM HP3，形成两种C-Ag+-C结构，室温下避光反应1小时后混合。
B液：在50μL 10mM MOPS缓冲液中加入4μL 10μM P1-DNA、4μL 10μM P2-DNA和4μL10μM Aptamer，室温下反应30min形成适配体-P1-P2双链DNA。
随后，将50μL不同浓度的活细胞加入，反应30分钟，释放出游离P1和P2链。
将B液加进A液，再加入4μL 10μM Helper-DNA1和4μL 10μM Helper-DNA2，室温下反应1.5小时。
最后加入19μL CdTe QDs，反应10min后测荧光值。
将该策略用于A549细胞的分析，其分析结果如图10所示。首先，考察了其可视化分析的灵敏度，如图10A，其100和1000cells/mL浓度，可以轻松肉眼区分，即可视化检测下限为1000cells/mL，即50cells。
使用荧光仪监测荧光信号后，发现在100-105cells/mL浓度(即5-5000cells)范围内呈现良好关系，其分析性能与使用mucin 1作为生物标志物直接检测细胞时相似，如图10B和图10C所示。
综合实施例1、实施例2、实施例3以及实施例4，得出以下结论：
(1)该低成本均相可视化和荧光分析策略，可成功用于mucin 1和肿瘤细胞的检测，且其分析灵敏度较高(可视化50cells，荧光仪检测5cells)，可满足现有医学检测需要。
(2)Mucin 1可作为肿瘤生物标志物，将其用于肿瘤细胞定量分析。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
在MOPS缓冲液中加入HP-DNA，AgNO3或者Hg(NO3)2/HgCl2溶液，室温下避光反应，形成具有C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构的A液；
直接向A液中加入不同浓度的粘蛋白，室温下反应后，加入发光QDs，反应后测定荧光值；
或者在MOPS缓冲液中加入P1-DNA和核酸适配体，室温下反应，形成双链DNA后，在加入不同浓度的粘蛋白，完成竞争反应，释放游离P1-DNA链，形成B液，将B液加入A液，再加入Helper-DNA，室温反应，最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
2.根据权利要求1所述的粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：当直接向A液中加入不同浓度的粘蛋白时，荧光信号强度变化与0.25-10ng/mL浓度范围内的粘蛋白呈现线性关系，其线性方程为Y＝-633C+9664，线性相关性系数R2＝0.990。
3.根据权利要求1所述的粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：当将B液加入A液时，粘蛋白在1fg/mL-1pg/mL浓度范围内，紫外灯照射下，肉眼可区分fg/mL级别的粘蛋白，颜色由红色逐渐变浅，然后逐渐变为蓝色。
4.根据权利要求1所述的粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：当将B液加入A液时，粘蛋白在1fg/mL-1pg/mL浓度范围内，荧光信号降低与粘蛋白浓度的对数呈现线性关系，其线性方程为Y＝-922LogC-8329，线性相关性系数R2＝0.976。
5.根据权利要求1所述的粘蛋白均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：所述发光QDs为CdTe QDs或者CdSe QDs。
6.一种循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
缓冲液中加入HP-DNA和AgNO3/Hg2+溶液，室温下避光反应，形成具有C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构的A液；
缓冲液中加入P1-DNA和核酸适配体，室温下反应一段时间，加入不同浓度的循环肿瘤细胞，继续反应，释放游离P1-DNA，形成B液：
将B液加入A液，再加入Helper-DNA，室温反应；
最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于，荧光信号的降低与100-105cells/mL范围内循环肿瘤细胞浓度的对数呈线性关系，其线性方程为Y＝-1029LogN+7771，线性相关系数R2为0.994。
8.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于，所述HP-DNA包括HP1-DNA和HP2-DNA；
在含有AgNO3/Hg2+的缓冲溶液中分别加入HP1-DNA和HP2-DNA，形成两种C-Ag+-C结构或者T-Hg2+-T结构，室温下避光反应后混合，形成A液；
在缓冲液中加入P1-DNA、P2-DNA和核酸适配体，室温下反应形成适配体-P1-P2双链DNA，加入待测不同浓度的循环肿瘤细胞反应，释放出游离P1链和P2链，形成B液；
将B液加入A液，再加入Helper-DNA1和Helper-DNA2，室温反应；
最后加入发光QDs，反应后测定荧光值。
9.根据权利要求8所述的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于，循环肿瘤细胞在100-105cells/mL浓度范围内，紫外灯照射下，肉眼可见颜色由红色逐渐变浅。
10.根据权利要求8所述的循环肿瘤细胞的均相可视化/荧光POCT检测方法，其特征在于，荧光信号的降低与100-105cells/mL范围内循环肿瘤细胞浓度的对数呈线性关系，其线性方程为Y＝-1171LogN+8608，线性相关系数R2为0.976。
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