CN101458251A - 高通量检测生物大分子的磁性颗粒微阵列装置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将磁性纳米颗粒、生物芯片与微流体技术相结合，所建立的一种磁性颗粒微阵列生物大分子检测平台。该种磁性颗粒微阵列应用磁性纳米颗粒作为生物大分子载体。通过在磁性颗粒表面固定DNA探针或者抗体，然后将磁性颗粒与待检测样本杂交或反应后，各个待测样本固定到磁性颗粒表面，然后将磁性颗粒点样在具有磁性基片上的微流体反应池中，构成磁性颗粒微阵列。向微流体反应池中加入荧光探针或者荧光标记抗体，经过反应、洗涤后，通过荧光生物芯片扫描仪获得各个样本的信息。
Description
一、技术领域
本发明属于生物信息检测技术领域，特别涉及一种检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列装置及其使用方法。
二、背景技术
随着科技的发展和人们对健康问题的持续关注，人们越来越需要能够方便、快捷的对感兴趣的生物大分子进行各种检测，这种需要促使人们开发出各种各样的生物检测方法来满足不同领域的需要。
上世纪九十年代以来，生物芯片技术越来越多的引起人们的广泛关注。生物芯片芯片技术通过在一微小的基片表面固定大量的分子识别探针，或构建微分析单元和系统，实现对化合物、蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分准确、快速、大信息量的筛选或检测。它可以将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。基因芯片诊断技术具有高通量、大规模、高度并行性、快速高效、高灵敏度的优点，成为一项现代化诊断新技术。
传统的生物芯片技术，通过机器点样或者原位合成的方法将样本或者寡核苷酸探针固定在固相载体表面。此类生物芯片制备方法中，作为固相载体的玻片往往需要进行复杂的化学修饰；同时，生物大分子固定在功能化载体表面往往需要复杂的固定过程。此外，生物芯片进行检测前，往往需要对待检测的样本进行纯化、浓缩，这些均导致生物芯片的操作复杂，且成本较高。
随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。由于磁性纳米颗粒分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可重复使用、操作简单、易实现功能基团、易实现自动化以及不影响分离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测等。
三、发明内容
技术问题：本发明针对现有技术缺点，提出了一种高通量检测生物大分子的磁性颗粒微阵列装置及其使用方法，该微阵列将磁性纳米颗粒、生物芯片与微流体技术相结合，建立一种新型的简单、高准确性、低成本、高通量的磁性颗粒微阵列生物大分子检测平台。该种磁性颗粒微阵列，整个方法能够实现从自动化分行，且与传统方法相比该方法应要具有很高的实用性和灵活性。
技术方案：一种高通量检测生物大分子的磁性颗粒微阵列装置，包括微流体反应池盖片、待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列、聚二甲基硅氧烷微流体反应池、载玻片和磁体，所述微流体反应池盖片上设有缓冲液进口和缓冲液出口，微流体反应池盖片设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池之上，缓冲液进口和缓冲液出口与聚二甲基硅氧烷微流体反应池相通，待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池之内，载玻片设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池之下，磁体设于载玻片的下方。
一种检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列装置的使用方法，向固定有生物大分子的磁性颗粒中加入待检测样本，通过连接在磁性颗粒表面的生物大分子，将待检测分子结合到磁性颗粒表面得待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物；将待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物通过点样设备，点样到聚二甲基硅氧烷微流体反应池内，形成待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列，微阵列由磁体的磁性固定；聚二甲基硅氧烷微流体反应池通过微流体反应池盖片封闭后，向聚二甲基硅氧烷微流体反应池中加入荧光标记探针，或荧光标记抗体使其与待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物进行反应；反应完成后，经洗涤，去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。
所述固定有生物大分子的磁性颗粒为无荧光背景的磁性纳米颗粒。
有益效果：本发明首次提出了一种结合纳米技术、生物芯片技术和微流体技术的“新一代”自动化、高通量生物芯片。该种磁性颗粒微阵列应用磁性纳米颗粒作为生物大分子载体。通过在磁性颗粒表面固定DNA探针或者抗体，然后将磁性颗粒与待检测样本杂交或反应后，各个待测样本固定到磁性颗粒表面，然后将磁性颗粒点样在具有磁性基片上的微流体反应池中，构成磁性颗粒微阵列。向微流体反应池中加入荧光探针或者荧光标记抗体，经过反应、洗涤后，通过荧光生物芯片扫描仪获得各个样本的信息。
在本发明所描述的磁性颗粒微阵列技术中，使用无荧光背景的磁性纳米颗粒来捕获待检测样本的生物大分子。在颗粒表面较小的空间区域内固定更大量的荧光标记物，从而实现信号放大。同时，利用磁性颗粒作为反应与检测载体，易于实现洗涤、分离步骤，易于实现对待检测样本的纯化、浓缩。同时应用磁性颗粒易于应用自动工作站实现自动化，检测快速，灵敏度高等优点。磁性颗粒微阵列中，磁性颗粒通过磁场固定到玻片表面，与常规生物芯片制备相比，无需对玻片进行任何特殊修饰，大大简化了芯片的制备过程，大大降低了实验成本。
兼具生物芯片和磁性颗粒在生物大分子检测中的优点，磁性颗粒微阵列是一种新型的简单、自动化、高准确性、低成本、高通量的生物信息检测方法，且与传统生物芯片相比具有很高的实用性和灵活性，有较高的应用价值。
四、附图说明
图1是实施例1中磁性颗粒微阵列的示意图；
图2是实施例1中磁性颗粒微阵列的分解示意图。其中1、微流体反应池盖片；2、固定有生物大分子的磁性颗粒；3、聚二甲基硅氧烷微流体反应池；4、载玻片；5、永磁体；6、缓冲液进口；7、缓冲液出口。
五、具体实施方式
实施例1：
一种检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列装置，包括微流体反应池盖片1、待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列2、聚二甲基硅氧烷微流体反应池3、载玻片4和磁体5，所述微流体反应池盖片1上设有缓冲液进口6和缓冲液出口7，微流体反应池盖片1设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池3之上，缓冲液进口6和缓冲液出口7与聚二甲基硅氧烷微流体反应池3相通，待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列2设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池3之内，载玻片4设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池3之下，磁体5设于载玻片4的下方。
实施例2：
一种检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列装置的使用方法，向固定有生物大分子的磁性颗粒中加入待检测样本，通过连接在磁性颗粒表面的生物大分子，将待检测分子结合到磁性颗粒表面得待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物；将待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物通过点样设备，点样到聚二甲基硅氧烷微流体反应池内，形成待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列，微阵列由磁体的磁性固定；聚二甲基硅氧烷微流体反应池通过微流体反应池盖片封闭后，向聚二甲基硅氧烷微流体反应池中加入荧光标记探针，或荧光标记抗体使其与待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物进行反应；反应完成后，经微流体反应池盖片上设有缓冲液进口和缓冲液出口对反应池内反应物进行洗涤，再去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。所述固定有生物大分子的磁性颗粒为无荧光背景的磁性纳米颗粒。
实施例3：
磁性颗粒微阵列的制备：
磁性颗粒微阵列示意图附图1所示，包括载玻片、永磁体、聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体反应池(制备方法参见：Pantoja et al，Biosensors and Bioelectronics，2004，vol 20，3，509-517)、磁性颗粒、微流体反应池盖片五部分组成。其中用磁铁粘附在玻片点样区的背面，磁性颗粒点样在PDMS制备的微流体反应池中。微流体盖片上包含缓冲液入口和出口，可以使各种缓冲液、反应液流入、流出微流体反应池。
应用磁性颗粒微阵列进行SNP分型
1、本实施例中我们以检测MTHFR基因(亚甲基四氢叶酸还原酶基因)C677T SNP位点为例，引物序列为上游引物：5’-TGAAGGAGAAGG TGTCTGCGGGA-3’，生物素标记的下游引物：5’-Biotin-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’；等位基因特异性检测探针序列为野生型探针：Cy3-CGGGAGCCGATTT，突变型探针：Cy5-CGGGAGTCGATTT。
2、扩增MTHFR基因C677T多态位点生物素标记的PCR产物。PCR反应体系30μL，其中含10×的PCR反应缓冲液3μL，25mmol/L的Mg2+溶液2μL，10mmol/L的dNTP 0.6μL，10mmol/L的上、下游引物各1μL，1.25U的Taq DNA聚合酶(5U/μL)，基因组DNA 2μL，其余用水补齐.在PTC 220型PCR扩增仪上进行如下扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后，72℃再延伸7min.待反应结束后，将PCR混合物95℃变性5min，置于冰上骤冷，变性。
3、反应完成后，加入120μg亲和素标记的Invitrogen MyOne磁性颗粒，常温反应15分钟，将生物素标记的引物全部捕获到磁性颗粒表面。将磁性颗粒-ssDNA复合物重复洗涤后，分散于10μL PH值7.4的PB缓冲液中。
4、将载玻片清洗干净，在玻片背面粘附永磁体，玻片正面制备PDMS微流体槽。
5、利用点样装置，将磁性颗粒-ssDNA复合物点样到玻片表面，点样区域位于微流体反应池中。使用用反应池盖片将PDMS微流体反应池封闭。
6、将杂交液加入磁性颗粒微阵列，其中包含：10mmol/L荧光标记探针677CC和677TT探针各1μL，杂交液7μL和灭菌去离子水11μL，混匀后37℃杂交1h.杂交后的磁性纳米粒子经2×柠檬酸三钠-氯化钠缓冲液(SSC)-0.1％十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecvlsulfate，SDS)、0.1×SSC-0.1％ SDS和3×SSC各振荡、清洗3min。
7、杂交后的颗粒微阵列，出去盖片和永磁体，利用配有Cy3和Cy5滤色片的扫描微阵列分析系统(Axon，USA)扫描、叠加以获得样品分型图像。实现对样本的分型。
实施例4：
磁性颗粒微阵列的制备：
磁性颗粒微阵列示意图附图1所示，包括载玻片、永磁体、聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体反应池(制备方法参见：Pantoja et al，Biosensors and Bioelectronics，2004，vol 20，3，509-517)、磁性颗粒、微流体反应池盖片五部分组成。其中磁铁粘附在玻片点样区的背面，磁性颗粒点样在PDMS制备的微流体反应池中。反应池盖片上包含缓冲液入口和出口，可以使各种缓冲液、反应液流入、流出微流体反应池。
应用磁性颗粒微阵列检测O157：H7大肠埃希菌：
1、按照Kouassi等的方法(Anal.Chem.2006，78，3234-3241)制备亲合素修饰的金包磁性纳米颗粒。亲合素标记的磁性纳米颗粒与生物素标记的兔抗O157:H7多克隆抗体结合制备得到多抗免疫磁珠。制备好的多抗免疫磁珠以4mg/ml浓度分散于TTBS-casein缓冲液中。
2、取10μL免疫磁珠，吸上清后分别加入1mL样本细菌溶液，以及1mL TTBS-casein，涡旋混匀后室温振荡反应30min。用TTBS-casein清洗3次，最终颗粒分散与10μL PH7.4的PB缓冲液之中。
3、将载玻片清洗干净，在玻片背面粘附永磁体，玻片正面制备PDMS微流体槽。利用点样装置，将磁性颗粒-ssDNA复合物点样到玻片表面，点样区域位于微流体槽中。然后，利用微流体槽盖片将PDMS微流体槽封闭。
4、向反应池中加入1mL 100μL1:100稀释的鼠抗O157:H7单抗，涡旋混匀后室温振荡反应30min。用1mL TTBS-casein清洗。
5、加入100μ L1:10000稀释的Cy3标记的马抗鼠O157:H7二抗，涡旋混匀后室温振荡反应30min。用1mL TTBS-casein清洗。
6、反应后的颗粒微阵列，出去盖片和永磁体，利用扫描微阵列分析系统扫描获得各个样本的荧光信号强度。实现对样本的检测。
Claims (3)
1.一种高通量检测生物大分子的磁性颗粒微阵列装置，其特征在于包括微流体反应池盖片(1)、待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列(2)、聚二甲基硅氧烷微流体反应池(3)、载玻片(4)和磁体(5)，所述微流体反应池盖片(1)上设有缓冲液进口(6)和缓冲液出口(7)，微流体反应池盖片(1)设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池(3)之上，缓冲液进口(6)和缓冲液出口(7)与聚二甲基硅氧烷微流体反应池(3)相通，待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列(2)设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池(3)之内，载玻片(4)设于聚二甲基硅氧烷微流体反应池(3)之下，磁体(5)设于载玻片(4)的下方。
2.一种检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列装置的使用方法，其特征在于：
a.向固定有生物大分子的磁性颗粒中加入待检测样本，通过连接在磁性颗粒表面的生物大分子，将待检测分子结合到磁性颗粒表面得待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物；
b.将待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物通过点样设备，点样到聚二甲基硅氧烷微流体反应池内，形成待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物组成的微阵列(2)，微阵列由磁体的磁性固定；
c.聚二甲基硅氧烷微流体反应池通过微流体反应池盖片封闭后，向聚二甲基硅氧烷微流体反应池中加入荧光标记探针，或荧光标记抗体使其与待检测样本-生物大分子-磁性颗粒复合物进行反应；
d.反应完成后，经洗涤，去除微流体反应池盖片和磁体，应用生物芯片扫描仪获得所检测样本的生物信息。
3.根据权利要求1所述的检测高通量生物大分子的磁性颗粒微阵列，其特征在于所述固定有生物大分子的磁性颗粒(2)为无荧光背景的磁性纳米颗粒。
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