JPWO2020213700A5 - - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は、
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットを提供する。
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットを提供する。
また、本発明は、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットを提供する。
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットを提供する。
＜第一の態様＞
＜標的核酸検出キット＞
本発明の第一の態様における第一の形態にかかる標的核酸検出キットは、
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットである。
＜標的核酸検出キット＞
本発明の第一の態様における第一の形態にかかる標的核酸検出キットは、
（i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キットである。
＜第１一本鎖環状DNA＞
第１一本鎖環状DNAは、標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基のプライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む。
第１一本鎖環状DNAは、標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基のプライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む。
図１を参照して説明する（標的核酸の第２の部位に該遺伝子変異を含む場合には図１６を参照のこと。ただし、図１の符号２１、２１１、２１２、２２、２２１、２２２は、それぞれ、図１６の符号２７、２７１、２７２、２８、２８１、２８２に対応する。）。ただし、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。また、便宜上、担体は記載して
いない。
第１一本鎖環状DNA２０は標的核酸２１の第1の部位２１１に相補的な配列２０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列
２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。
いない。
第１一本鎖環状DNA２０は標的核酸２１の第1の部位２１１に相補的な配列２０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列
２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。
＜第２一本鎖環状DNA＞
第２一本鎖環状DNA２４は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補
配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列２４２と、
を含む。
配列２０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基であ
る。第２一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化す
ることによって得ることができる。
第２一本鎖環状DNA２４は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補
配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列２４２と、
を含む。
配列２０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基であ
る。第２一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化す
ることによって得ることができる。
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３はその前後、すなわち、第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列２４１との間および第２プライマー結合配列２
４２との間に任意の配列を含んでもよい。
４２との間に任意の配列を含んでもよい。
＜第２オリゴヌクレオチドプライマー＞
第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に
相補的な配列２５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、
を含む。
第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に
相補的な配列２５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、
を含む。
増幅産物２３は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３に相補的な配列２３３を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２一本鎖環状DNA２４は、第１増幅産物２３の配列２３３に、配列２４１を介してハイブリダイズ
する。
このようにしてできた、第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNA２４の複合体に、第２
オリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
する。
このようにしてできた、第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNA２４の複合体に、第２
オリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一
本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５
１を有するので、第１増幅産物２３の、第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的な
領域２３４に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２一
本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５
１を有するので、第１増幅産物２３の、第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的な
領域２３４に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２一
本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
この第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNA４４と、第２のオリゴヌクレオチドプ
ライマー４５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物４６（伸長鎖）が増幅さ
れる。第２の増幅産物４６はグアニン四重鎖を含む配列４６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬４７によって検出される。本形態では、第１の増幅産物４３に含まれる領域４３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA４４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
ライマー４５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物４６（伸長鎖）が増幅さ
れる。第２の増幅産物４６はグアニン四重鎖を含む配列４６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬４７によって検出される。本形態では、第１の増幅産物４３に含まれる領域４３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA４４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
＜第二の態様＞
＜標的分子の検出方法＞
本発明の第二の態様にかかる標的分子の検出方法は、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチ
ドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２
一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含み
、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配
列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２一本鎖環状DNAは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補
配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環
状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接
した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列に相補的な配
列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、方法である。
＜標的分子の検出方法＞
本発明の第二の態様にかかる標的分子の検出方法は、
標的分子と、キャプチャーオリゴヌクレオチドと、第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、第１一本鎖環状DNAとからなる第１の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第１の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、
当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチ
ドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のオリゴヌクレオチドプライマーと第２一本鎖環状DNAとからなる第２の複合体を形成させる工程、
ローリングサークル増幅によって前記第２の複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸を検出する工程、を含み、
前記第１一本鎖環状DNAは、第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２
一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含み
、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチドは、第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配
列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含み、
前記第２一本鎖環状DNAは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補
配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環
状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接
した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列に相補的な配
列とを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、方法である。
＜第２一本鎖環状DNA＞
第２一本鎖環状DNA３４は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配
列３０３と同一の配列３４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列３４２と、
を含む。
配列３０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列３４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA３４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２一本鎖環状DNA３４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
第２一本鎖環状DNA３４は、第１一本鎖環状DNA３０の第２一本鎖環状DNA結合配列相補配
列３０３と同一の配列３４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列３４２と、
を含む。
配列３０３の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列３４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２一本鎖環状DNA３４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２一本鎖環状DNA３４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
本発明の他の態様は、前記標的分子の検出キットである。
前記標的分子の検出キットは、上述したような、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットである。
前記標的分子の検出キットは、上述したような、
第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマ
ーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キットである。
２０・・・一本鎖環状DNA、２１・・・標的核酸、２２・・・第１オリゴヌクレオチドプ
ライマー、２３・・・第１増幅産物、２４・・・第２一本鎖環状DNA、２５・・・第２オ
リゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２増幅産物、２０１・・・第１の部位に相補的な配列、２０２・・・第１プライマー結合配列、２０３・・・第２一本鎖環状DNA結合
配列の相補配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した部位、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬、２１１・・・第１の部位、２１２・・・第２の部位、２２１・・・第２の部位に相補的な配列、２２２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列、２３１・・・、２０３の相補領域、２３２・・・部位２０４に相補的な領域、２３３・・・配列２０３に相補的な配列、２３４・・・第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的
な領域、２４１・・・第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列、２４
２・・・第２プライマー結合配列、２５１・・・部位２０４と同一の配列、２５２・・・第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列、２７・・・変異を
含む標的miRNA、２７１・・・第１の部位、２７２・・・第２の部位、２８・・・第１オ
リゴヌクレオチドプライマー、２８１・・・第２の部位に相補的な配列、２８２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列
ライマー、２３・・・第１増幅産物、２４・・・第２一本鎖環状DNA、２５・・・第２オ
リゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２増幅産物、２０１・・・第１の部位に相補的な配列、２０２・・・第１プライマー結合配列、２０３・・・第２一本鎖環状DNA結合
配列の相補配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した部位、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬、２１１・・・第１の部位、２１２・・・第２の部位、２２１・・・第２の部位に相補的な配列、２２２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列、２３１・・・、２０３の相補領域、２３２・・・部位２０４に相補的な領域、２３３・・・配列２０３に相補的な配列、２３４・・・第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的
な領域、２４１・・・第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列、２４
２・・・第２プライマー結合配列、２５１・・・部位２０４と同一の配列、２５２・・・第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列、２７・・・変異を
含む標的miRNA、２７１・・・第１の部位、２７２・・・第２の部位、２８・・・第１オ
リゴヌクレオチドプライマー、２８１・・・第２の部位に相補的な配列、２８２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列
４０・・・一本鎖環状DNA、４１・・・キャプチャーオリゴヌクレオチド、４２・・・miRNA、４３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、４４・・・第２の一本鎖環状DNA、４５・
・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、４６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、４７・・・グアニン四重鎖検出試薬、４０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、４
０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、４０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、４０４・・・４０３の５’側に隣接した領域、４１１・・・一本鎖環状DNAの第２
の領域に相補的な配列、４１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、４２１・・・miRNAの第１の領域、４２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、４３１・・・４０３の
相補領域、４３２・・・領域４０４に相補的な領域、４３３・・・配列４０３に相補的な配列、４３４・・・第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域、４４１・・
・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列４０３と同一の配列、４４２・・・第２のプラ
イマー結合配列、４４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、４５１・・・領域４０４と同一の配列、４５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列
４４２に相補的な配列、４６１・・・グアニン四重鎖形成配列
・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、４６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、４７・・・グアニン四重鎖検出試薬、４０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、４
０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、４０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、４０４・・・４０３の５’側に隣接した領域、４１１・・・一本鎖環状DNAの第２
の領域に相補的な配列、４１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、４２１・・・miRNAの第１の領域、４２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、４３１・・・４０３の
相補領域、４３２・・・領域４０４に相補的な領域、４３３・・・配列４０３に相補的な配列、４３４・・・第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域、４４１・・
・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列４０３と同一の配列、４４２・・・第２のプラ
イマー結合配列、４４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、４５１・・・領域４０４と同一の配列、４５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列
４４２に相補的な配列、４６１・・・グアニン四重鎖形成配列
Claims (2)
- （i）標的核酸の第１の部位に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７～８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１一本鎖環状DNAと、
（ii）標的核酸の、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNAの第１プライマー結合部位に相補的な７
～８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配
列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
核酸検出用キット。 - 第１の領域と、その３’側に連結された第２の領域と、第２一本鎖環状DNA結合配列の相
補配列と、を含む、第１一本鎖環状DNA、
標的分子に結合する第１のアプタマー配列とその３’側に連結された、第１一本鎖環状DNAの第１の領域に相補的な配列と、を含む、第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
第１一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列とその３'側に連結された標的分子に結合する第２のアプタマー配列と、を含む、キャプチャーオリゴヌクレオチド、
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のオリゴヌクレオチドプライマー結合配列と、を含む、第２一本鎖環状DNA、及び
第１一本鎖環状DNAにおける第２一本鎖環状DNA結合配列相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２のオリゴヌクレ
オチドプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、
前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、担体と結合しており、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端を介して、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド及び／又は前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが結合している前記担体と結合している、
標的分子の検出キット。
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-
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