CN101142325A - 制备用于分析的多核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种分析具有独特核酸序列单元的靶多核苷酸的方法包括：(i)形成一个第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是具有多个重复靶多核苷酸序列的一个多联体；(ii)在第一核苷酸上形成与一个或多个靶核苷酸的一部分杂交的一个第二核苷酸，使得杂交的部分或未杂交的部分对应于靶标上一个序列单元，并且测定靶标上的该序列单元。

Description

制备用于分析的多核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及修饰多核苷酸从而更容易地对所述多核苷酸进行分析的方法。

背景技术

用于表征分子或其生物学反应的技术改进在一定程度上推动了分子研究的进展。特别是，对核酸DNA和RNA的研究就受益于序列分析和杂交反应研究方面的技术发展。

WO-A-00/39333描述了一种通过将靶多核苷酸序列转换成第二种多核苷酸来对多核苷酸进行测序的方法，所述第二种多核苷酸其中含有确定的序列和位置信息。据报道靶标的序列信息在第二种多核苷酸中“放大”，从而使得可更容易地区分靶分子中的单个碱基。这可通过使用具有预定核酸序列单元的“放大标签”来实现。靶分子上的每种碱基即腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶用各自的放大标签表示，由此将原始靶序列转换为放大的序列。接下来再利用常规技术测定放大标签的顺序，并由此确定靶多核苷酸的具体序列。

在一种优选的测序方法中，每个放大标签包括一个标记，例如一种荧光标记，其可以随后被识别并且用于表征该放大标签。

WO-A-04/094664描述了WO-A-00/39333所公布的转换方法的一种改进方法。在两种方法中，优选地每个放大标签包括独特序列的两个单元，所述两个单元可被用作一个二元系统，其中一个单元表示“0”，另一个表示“1”。靶标上的每个碱基由这两个单元的一种组合所表征，例如，腺嘌呤可用“0”+“0”表示，胞嘧啶可用“0”+“1”表示，鸟嘌呤可用“1”+“0”表示，胸腺嘧啶可用“1”+“1”表示。

现有技术方法的一个困难是，由于需要区别不同的放大标签或单元而使得最终的读出步骤常常受到妨碍。因此需要改进识别方法以使得可以进行区别。

发明内容

本发明提供了一种分析多核苷酸的方法，优选由独特的多核苷酸序列单元所形成的那些多核苷酸，每个所述单元表示一个特定的特征。该方法利用了所述靶多核苷酸的一种多联体，即重复所述靶多核苷酸的序列，然后在其上形成另一个多核苷酸，所述另一个多核苷酸被杂交到靶标的特定部分上，使得杂交的或未杂交的序列可以被识别，并且杂交(或未杂交)的顺序表明了该靶多核苷酸的单元的特征和/或顺序。优选地，目的是连续地识别多联体上每个靶多核苷酸的一个单元。如果与原靶多核苷酸的单元被直接测序相比，通过这种方式，待识别的单元更为分散。间隔的增加使得最终的读出技术可区分出各单元，因此提高了最终测序/识别步骤的效率。或者可以通过附加的核酸序列将重复的靶多核苷酸分隔开的方式来实施所述方法，所述附加的多核苷酸用于分隔开靶标，从而可进行分析。

根据本发明的第一方面，一种分析具有独特的核酸序列单元的靶多核苷酸的方法包括：

(i)形成一个第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是具有多个重复靶多核苷酸序列的一个多联体；

(ii)将所述第一多核苷酸的一部分与一个第二多核苷酸杂交，使得杂交的部分或未杂交的部分对应所述靶标上的至少一个序列单元，并且测定所述靶标上的所述序列单元。

在本发明的第二方面中，在一个第二多核苷酸上直接形成所述多联体，所述第二多核苷酸上具有一个预定顺序的确定的第一和第二核酸序列单元。所述第二多核苷酸被设计用于与靶标上特定的序列单元杂交。所述多联体和所述第二多核苷酸之间发生的特定相互作用使得形成杂交部分，可以通过分析这些杂交部分来揭示序列单元的特征。

根据本发明的第二方面，一种将具有独特的核酸序列单元的靶多核苷酸转换成为一个多核苷酸的方法，所述多核苷酸具有将一个或多个独特的核酸序列单元分隔开的核酸序列，所述方法包括：

(i)形成一个第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有预定顺序的确定的第一和第二序列单元；

(ii)在所述第二多核苷酸上形成一个由一系列靶多核苷酸构成的第一多核苷酸，其中所述第一和第二序列单元的顺序使得所述第一和第二多核苷酸之间可发生特异性相互作用，由此可以通过相互作用的程度将所述第一多核苷酸上的独特核酸序列单元与其他独特单元区分开；和任选地

(iii)基于相互作用，测定所述序列和/或所述独特序列单元的顺序，从而测定所述靶多核苷酸上的一个或多个特定序列单元。

根据本发明的第三方面，一种形成双链多核苷酸的方法，包括：

(i)形成一个第一多核苷酸；

(ii)用附着到所述第一多核苷酸上的引物分子进行滚环扩增反应，其中所述扩增反应利用了一个环状多核苷酸分子，所述环状多核苷酸分子具有与所述第一多核苷酸的重复单元互补的一个序列。

附图说明

参照附图描述本发明，其中：

图1(a)示出了使用不同的核苷酸序列来表示“0”或“1”的特征，和会或不会杂交到所述序列的第二多核苷酸上的序列；

图1(b)是滚回PCR(roll back PCT)的图示；

图2示出了靶多核苷酸的掩蔽和去掩蔽；

图3示出了在对“未掩蔽”的核酸序列进行分析时使用挂锁探针；

图4示出了靶多核苷酸和第二多核苷酸的设计；

图5示出了具有核酸序列确定单元的靶多核苷酸的形成；

图6示出了靶标和附加的间插核酸序列之间的连环化；

图7(a)示出了用于捕获和表征靶多核苷酸的一系列第二多核苷酸的使用

图7(b)示出了使用挂锁探针来分析靶核苷酸序列。

图8示出了连环化的靶多核苷酸与第二多核苷酸之间的杂交作用，以及错配(未掩蔽)序列的存在。

图9示出了使用挂锁探针来杂交连环化的靶多核苷酸的未掩蔽区域。

图10至12的每个都示出了使用限制性内切酶底物序列来分析靶多核苷酸序列；和

图13为显示了图10至12中所示杂化物的限制性内切酶产物的电泳凝胶图。

具体实施方式

术语“多核苷酸”是本领域所熟知的，用于指一系列连接的核酸分子，例如DNA或RNA。核酸模拟物，例如PNA、LNA(锁核酸)和2’-O-methRNA也在本发明范围内。

如本领域中所知，本文提及的碱基A、T(U)、G和C是指核苷酸碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶)、鸟嘌呤和胞嘧啶。当多核苷酸为RNA时以尿嘧啶替代胸腺嘧啶，或者用dUTP将尿嘧啶引入DNA中，这也是本技术领域所熟知的。

本文所用术语“第一多核苷酸”是指连环化的靶多核苷酸，即所述第一多核苷酸包括重复的靶多核苷酸序列。各靶多核苷酸可以是连续连接的，或者是可以有附加的核酸序列将靶多核苷酸分隔开。

本文所用术语“第二多核苷酸”是指用于杂交到第一多核苷酸区域上的一种多核苷酸。由于第二多核苷酸可以用于阻止对与其杂交的第一多核苷酸上的那些区域的分析，而被称为掩蔽多核苷酸。没有被杂交的第一多核苷酸上的区域被称为“未掩蔽的”。

本发明的方法被用于将具有独特核酸序列单元的靶多核苷酸转换成为这样一种多核苷酸，在该多核苷酸中所述独特核酸序列单元可以以一定的间隔被分析，所述间隔大于靶标上的间隙。这就有益于将各单元分隔开以使所执行的最终读出步骤的准确率和辨别率更高。本发明有赖于靶多核苷酸的多联体的形成，这使得可以随后对选定的单元进行分析；被分析的单元代表了原靶多核苷酸上的独特单元。

形成多联体之后，可以用各种方式分析靶多核苷酸的独特单元，用于揭示一个或多个单元的特征，或确定靶标上特定序列是否存在。

优选的分析多联体的方式是将多联体与一个或多个具有确定序列的第二多核苷酸杂交，使得该第二多核苷酸可用于掩蔽多联体的各部分，使得未掩蔽的部分(序列单元)可以用例如特异针对该部分的经标记的多核苷酸分析。对所述经标记的多核苷酸的识别可揭示该序列单元的特征。可以用这种方式来识别多联体的每个靶多核苷酸上的不同序列单元。

本发明的方法有赖于靶多核苷酸的使用，所述靶多核苷酸包括确定的核酸序列“单元”，其中每个单元都表示一个早期分子的一个特定特征。例如，每个单元可以表示一个具有未知序列的原多核苷酸分子上的一个特定的碱基。每个单元将优选地包括2个或多个核苷酸碱基，优选地2至50个碱基，更优选地5至20个碱基，最优选地5至10个碱基，例如6个碱基。优选地在每个单元中包含至少两个不同的碱基。该单元的设计使得能够在“读出”步骤中区分不同的单元，例如涉及在一个聚合反应中，或在互补寡核苷酸杂交时掺入可检测标记的核苷酸。一个分子被转换成为一个靶多核苷酸的方法是本技术领域所熟知的，例如WO-A-00/39333和WO-A-04/094664中所述，每一文献的内容都通过引用的方式纳入本说明书。然而，如果需要，一个单元可以是单一的碱基。

在一个优选实施方案中，靶多核苷酸包括一系列独特的单元，所述单元的组合构成了序列或赋予了其他信息。例如，两个单元可以被用作一个二元系统，其中一个单元表示“0”另外一个表示“1”。不同单元的组合可以表示被测序的原多核苷酸上的碱基。WO-A-04/094664中公开了这一内容。

因此多联体包括重复的核酸序列单元。

设计靶多核苷酸使得每个“单元”的一部分表示所研究的原分子的特征，但是所述每个单元也包括已知序列的核酸序列。对于每个单元来说，所述已知序列可以是不同的，这样，分析之前，至少靶标的一部分序列是已知的。这样使得可以设计出第二序列用于与靶标杂交。在图4和5中对此进行了更加详细的说明，其中靶标上每个单元位置有两个可能的单元序列；每个单元可以表示“0”或“1”，这取决于所述两个核苷酸的序列。然而，对于“0”或“1”来说，每个位置余下的八个核苷酸是相同的，但是与下一个单元位置不同。通过这种方式，可以设计出最终的分析以使在进行与特定单元的杂交时，使特定位置处的单元不被杂交，从而可以进行对未杂交单元的分析。在一个实施方案中，目的是分析多联体的每个靶多核苷酸上不同的单元位置，从而使得单元可以被进一步分隔，进而提高最终读出步骤区分各序列单元的能力。

或者，如果靶序列是未知的，则在连环化之前靶多核苷酸可以被连接到一个已知的序列上，从而使得多联体包括靶多核苷酸序列和已知序列，使得多联体和第二多核苷酸之间可以发生杂交。在本实施方案中，所述已知序列应具有足够的长度从而可与第二多核苷酸杂交。例如，已知序列应超过100个核苷酸，优选地超过500个核苷酸。这就将杂交的序列和未杂交(靶)的序列分隔开，然后对这些序列进行分析。

进行本发明的方法的所需条件，包括温度、pH、缓冲剂组成等，这些条件对于本领域的技术人员来说是显而易见的。

本发明的方法依据三个基本步骤进行：

i.靶多核苷酸的连环化；

ii.将多联体与另一个(第二个)具有确定已知序列的多核苷酸杂交；

iii.识别多联体上被杂交的单元，或优选地，识别多联体上未被杂交的单元。

可以按照任何适合的方式形成多联体。在一个优选实施方案中，靶多核苷酸被环化，并且进行聚合酶反应以形成多联体。

环化作用

可以按照任何便利的方式环化靶标。在一个实施方案中，单链靶标被杂交到第二多核苷酸的3’端。该靶标分子的3’和5’端将会杂交到第二多核苷酸上，并且被连接到一起形成一个单链环。通过提高互补性使得环连接的效率更高，优选地使用至少六个互补核苷酸，优选地至少9个互补核苷酸用于与第二多核苷酸杂交。连接酶可以是任何可用的连接酶，但是优选T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶或Taq DNA连接酶。

在另一个方法中，一个支持寡核苷酸(support oligonucleotide)可以被用于与靶标杂交并与第二多核苷酸连接。在这一方法的一个实施方案中，杂合体形成一个部分双链分子，所述双链分子带有一个与第二多核苷酸3’端互补的突出部。这样支持寡核苷酸可以被连接到第二多核苷酸的3’端。靶标的5’端也与第二多核苷酸互补，所以靶标会杂交到第二多核苷酸上，将靶标的两端就位使得连接酶可以把靶标的两端连接起来形成一个环。所述支持寡核苷酸用于帮助将现已环化的靶标维持在第二多核苷酸处，准备用于连环化。

在另一个实施方案中，所述支持寡核苷酸被用作薄板寡核苷酸(splint oligonucleotide)。该薄板寡核苷酸与靶标的3’和5’区域互补，并且使得这两端接近到可发生连接酶反应。然后使现已环化的靶标和薄板寡核苷酸的杂化物与第二多核苷酸接触，且靶标在第二多核苷酸的末端处，以一种设计用于使薄板寡核苷酸与第二多核苷酸接近的方式杂交。然后薄板寡核苷酸会与第二多核苷酸可发生连接反应，该连接反应通过提供足够数量的碱基来辅助以后的聚合酶扩增反应，在又一轮的扩增之前环状靶标可与上述碱基杂交。

所述支持寡核苷酸应具有足够的大小以与辅助靶标的杂交和环化。

在第三种方法中，用到了薄板寡核苷酸。该寡核苷酸是与靶标的3’和5’端互补的短单链分子。因此，该薄板寡核苷酸会使靶标的末端就位以使连接酶将两端连接起来形成环。然后通过使用例如外切核酸酶I和外切核酸酶III等外切核酸酶消化薄板寡核苷酸来移除所述薄板。

连环化作用

可以使用聚合酶反应将靶多核苷酸连环化。在一个实施方案中，环化的靶多核苷酸用作聚合酶反应的模板。由于模板是环状分子，所用的技术通常被称为滚环扩增(RCA)。如Richardson et al.，Geneticengineering，25，51-63中所述，这一方法存在几种变换形式。线性RCA利用了一种引物，该引物根据每个模板生成一个多联体。指数RCA利用两种引物，其中一种与待扩增的靶标互补，而另一种与第一种引物生成的产物互补。因此，第二种引物启动了由一个靶多核苷酸合成多个连环化拷贝。多引物RCA利用了一系列随机的六聚物作为引物。这些引物启动了由一个靶多核苷酸合成多个连环化拷贝。随后在初始RCA步骤的置换产物链上发生了第二次非特异性的引物反应。聚合酶活性可以在第二多核苷酸的3’端被启动。可以使用几种聚合酶，包括测序酶、Bst DNA聚合酶(大片段)、Klenow外-DNA聚合酶，它们都是在37℃下起作用并且具有重要的链置换能力的聚合酶，所述链置换能力是产生多联体所需的。也可以使用热稳定的Vent外-DNA聚合酶。然而文献中记载的作用于环状模板上最有效率的酶是phi29聚合酶，并且优选这种酶。

或者，通过连接靶分子的多个拷贝以形成一个连续的单链分子来进行连环化。根据这种方式，环化的靶多核苷酸不是必需的。

如图6所示，还可存在间插核酸序列。这样通常是理想的形式，因为间插核酸可以是已知的序列，从而有助于与第二多核苷酸杂交。

与掩蔽(第二)多核苷酸的杂交

由于在连环化完成之后，生成了多联体或者可使用单链封闭分子并且用外切核酸酶移除该单链封闭分子时，因此可以直接进行与第二多核苷酸的杂交。因此，在形成所述多联体的过程中可以存在第二多核苷酸。下面对此进行解释。

当在多联体上进行聚合酶反应时，可以同时进行多联体与第二多核苷酸之间的杂交。在本实施方案中，如上所述环状靶标可以被附着(连接)到第二多核苷酸上，使得该聚合酶产物在第二多核苷酸附近形成，从而有助于杂交。

在另一种方法中，通过用互补的分子“封闭”第二多核苷酸也可以将杂交和连环化反应分开。封闭分子或者可以在单独的反应中合成，并在连环化反应之前与第二多核苷酸退火。或者，封闭分子可通过利用一个短引物用聚合酶在第二多核苷酸上直接合成。在连环化反应之后，用外切核酸酶移除封闭分子，这样第二多核苷酸可用于与连环化的靶分子及其聚合产物杂交。

第二多核苷酸至少与多联体具有部分互补性。通过对靶标上序列单元的部分序列的认识，或通过将互补序列掺入到形成的多联体中来实现上述互补性。目的是将靶标杂交到第二多核苷酸上，由此产生可分析的未杂交部分。或者，可以通过分析杂交的部分来实施该方法。例如，可以设计该方法来使得在第二多核苷酸选定区域发生完全的杂交作用时形成限制性内切酶底物位点，并且用限制性内切酶来处理双链体。监测任何切割产物将会揭示在靶标上是否存在互补序列，从而揭示原分子的特征。如图10至13所示。

优选地，认为第二多核苷酸包括具有预定顺序的第一和第二序列单元。目的是使用第一和第二序列单元之一或两者来掩蔽第一多核苷酸上的序列，使得可以对第一多核苷酸进行选择性分析。在一个实施方案中，第二多核苷酸被用于掩蔽第一多核苷酸上的选定单元，从而分隔开第一多核苷酸上的各单元并且使得分析更容易进行。第一多核苷酸的“未掩蔽”单元可以具有某一顺序，该顺序表示了原靶多核苷酸上单元的顺序；或者所述“未掩蔽”单元可以被用于形成具有新顺序的单元，所述具有新顺序的单元代表了靶多核苷酸上特定的序列。例如，参照图2，第一与第二多核苷酸之间进行相互作用以表明第一与第二多核苷酸上完全互补的序列中存在限制性内切酶位点。尽管在非互补部分(见黑体的序列)也发生杂交作用，但是这样的杂交不会产生限制性内切酶消化。

如果发生完全的杂交，则限制性内切酶底物可以被切割。如果发生一个或多个错配，则不会有切割。当存在一个或两个错配时，一些限制性内切酶可以切割底物。如果这些酶被用于表征靶多核苷酸，则优选地，设计第二多核苷酸使得存在两个或多个错配。

或者，如图3所示，第一和第二多核苷酸之间的相互作用导致了未杂交的单元，所述未杂交的单元可以通过与后续寡核苷酸杂交来分析。下面对此进行更详细的阐释。

还可以在一个可寻址阵列中使用多个第二多核苷酸，其中多联体杂交到几个第二多核苷酸上，随后的分析可对杂交情况进行识别。上述内容如图7所示，并且下面对此进行更详细的阐释。

分析靶多核苷酸

如上所述，靶多核苷酸包括核酸序列‘单元’，这些单元代表了特定的特征(例如原分子上的序列信息)。本发明的方法被用于识别该单元，从而测定原分子的特征。如果分析是在单个靶多核苷酸上进行的，则用多联体识别间隔大于可形成的间隔的各单元。为了实施这一步骤，优选地选择性‘掩蔽’多联体上每个靶多核苷酸拷贝上的单元，并对未掩蔽的单元进行分析和识别。

通过使用第二多核苷酸来实现掩蔽，所述第二多核苷酸将会掩蔽(杂交到)第一多核苷酸上每个靶多核苷酸(地址)中的大部分，然后让每个地址暴露一个特定的位元(bit)位置。如图8所示。地址1将会暴露位元位置1，等等。然后用于揭示每个位元位置内容的方法会将位元与挂锁探针连接起来，该探针带有例如一个信号部分，用具有可检测标记的核苷酸进行聚合酶填入反应。当所有的位元位置都被适当地标记时，就可以进行读出步骤来表征每个位元。下面对这一方法进行详细描述。

步骤1

在本实例中，靶多核苷酸包括核酸序列的至少40个“位元”，所述核酸序列编码待分析的天然(原)DNA序列。每个位元位置可以具有数值0或1中两者之一。每个位置的两个可能位元至少长10bp，其中两个碱基是唯一的。这些两碱基可以位于所述位元编码序列的任何位置，并且确定了位元的数值。如图4所示，对于每个位置处的二位元-数值来说，余下的碱基(至少8个)优选地是相同的，但是对于每个位元位置来说余下的碱基是不同的。

掩蔽分子(第二多核苷酸)是含有靶多核苷酸或互补序列的至少40个拷贝的单链分子。如图4所示，由于每个靶多核苷酸相对于位元数值序列是不同的，所以掩蔽分子(第二多核苷酸)不含有0或1位元序列，但是“通用位元”与数值-编码位元有一个碱基对不同。

在靶多核苷酸被连环化以后，进行聚合酶反应。

步骤2

所得的掩蔽分子与多联体的杂合体由在每一个位元序列中具有一个错配的双链DNA组成。然而，由于掩蔽分子的设计，靶多核苷酸拷贝1中的位元位置1不会杂交，而是使得该位元序列暴露出来。此外，靶多核苷酸拷贝2中的位元位置2也不会杂交，从而将位置2的位元序列暴露出来。如图8所示，这一机制被用于揭示原靶多核苷酸中所有位元的序列。被揭示的位元数值也被一个靶多核苷酸的长度实际分隔开，将信号链放大至少40倍。可以设计第二多核苷酸，使得在待分析的位元(单元)位置上不存在杂交。所以，例如，在靶标1的位元位置1中，第二多核苷酸的序列可以没有任何互补区域。同样地，在靶标2的位元位置2中也可以没有互补序列。这样有助于将待分析的位元位置分开。

步骤3

可以使用任何方便的读出技术来分析所得的杂合体。在一个实施方案中，优选地使用挂锁技术(Nilsson et al.，Science，1994；265(5181)：2085-8and Baner et al.，Curr.Opin.Biotechnol.，2001；12(1)：11-15)。挂锁探针是指一种寡核苷酸，在存在适当的多核苷酸序列时，所述寡核苷酸可以通过DNA连接反应被环化。为了发生连接反应，该反应要求寡核苷酸的两端杂交到靶标上邻近的核苷酸上；因此它具有高度特异性。如图9所示，由于每个位元的数值都是由两个邻近的碱基对编码的，所以这些两碱基对可以被用于进行挂锁探针与未掩蔽位元之间的序列特异性连接反应。如果位元位置1编码为数值1，则只有1-特异探针能够与它的两个末端碱基杂交并且可用于连接反应。如果0-特异探针被杂交到1-位元上，则该挂锁探针将不能用于连接反应，因此该探针会被洗去。当所有的位元位置都被连接到其对应的挂锁探针上时，可以用标准图像采集系统识读所得的分子，条件是0-特异和1-特异挂锁探针被0-或1-特异荧光基团所标记。

一旦实施了转换方法，则可以进行“读出步骤”以获得其中编码的序列信息。

可以使用任何适合的技术执行读出步骤，例如WO-A-00/39333和WO-A-04/094663所述的技术。

一种读出方法是使用短的具有可检测标记的寡核苷酸与经转换的多核苷酸(第一或第二多核苷酸)上的单元杂交，并且检测任何的杂交情况。所述短的寡核苷酸具有与经转换的多核苷酸的特定单元互补的序列。如图7(a)中所示。

下面的实施例对本发明作了阐释。

实施例

为了说明“滚回”原理，一个114nt的单链分子被用作第二多核苷酸底物和38bp的环状靶标模板。利用生物素将底物分子固定在用1μM链霉亲和素包被的顺磁珠上，来“锚定”第二多核苷酸。

靶分子被杂交到第二多核苷酸上，并且加入phi29DNA聚合酶。该聚合酶以靶标为模板进行延伸反应。延伸链与第二多核苷酸互补，并且根据滚回理论，延伸链将会与第二多核苷酸杂交形成一个114bp的双链分子。根据靶标的序列，所述双链分子将含有某些限制性内切核酸酶的识别位点(图10、11和12)。

如图10所示，具有单元序列0100的靶标在靶多核苷酸拷贝2的位元位置2处形成BamHI的识别位点。拷贝1和3中的位元位置2由在识别位点处的两个单独的碱基对错配杂交而失活。若滚回确实存在，则用BamHI消化将会产生64bp的分子，该分子可以在凝胶上被显示。

如图11所示，具有单元序列0010的靶标在靶标拷贝3的位元位置3处形成HindIII的识别位点。拷贝1和2中的位元位置3由在识别位点处的单一碱基对错配而失活。若滚回确实存在，用HindII消化将会产生96bp的分子，该分子可以在凝胶上被显示。

如图12所示，具有单元序列0110的靶标分别在靶标拷贝2的位置2和靶标拷贝3的位置3处形成BamHI和HindIII的识别位点。多联体中其他潜在的限制位点的失活如靶标0100和0010的失活方式。

结果

对于所有实验中的靶标0100，在凝胶上60bp标记附近出现一个条带(见泳道3，图13)。

对于靶标0010，在所有实验中，当使用HindIII消化时在凝胶上100bp标记附近均会出现一个条带。但是除了预期的96bp条带，还在胶上50和40bp附近出现其他条带(见泳道4，图13)。这些结果表明HindIII的消化作用没有因一个碱基对的错配而完全被抑制。如果在靶标拷贝2中存在部分消化作用，则预期的分子是96、54和38。在靶标拷贝1中的消化作用产生38和16个碱基对的两个条带。我们没有在凝胶上观察到这些条带的事实可能说明限制位点距离分子末端太近而不能在任何可检测的程度上进行切割。但是，检测到54和38个碱基对条带的事实说明在滚回过程中形成了双链DNA。

对于靶标0110，在所有实验中，当使用BamHI和HindIII切割时，会分别观察到与靶标0100和0010相同的限制性模式(见泳道5和6，图13)。

本文提及的所有出版物的内容都通过引用的方式纳入本说明书。

Claims (18)

1.一种分析具有独特核酸序列单元的靶多核苷酸的方法包括：

(i)形成一个第一多核苷酸，所述第一多核苷酸是具有多个重复靶多核苷酸序列的一个多联体；

(ii)将所述第一多核苷酸的一部分与一个第二多核苷酸杂交，使得杂交的部分或未杂交的部分对应所述靶标上的至少一个序列单元，并且测定所述靶标上的所述序列单元。

2.一种将具有独特核酸序列单元的靶多核苷酸转换成为一个多核苷酸的方法，所述多核苷酸具有将一个或多个独特的核酸序列单元分隔开的核酸序列，所述方法包括：

(i)形成一个第二多核苷酸，所述第二多核苷酸具有预定顺序的确定的第一和第二序列单元；

(ii)在所述第二多核苷酸上形成一个由一系列靶多核苷酸构成的第一多核苷酸，其中所述第一和第二序列单元的顺序使得所述第一和第二多核苷酸之间可发生特异性相互作用，由此可以通过相互作用的程度将所述第二多核苷酸上的独特核酸序列单元与其他独特单元区分开；和任选地

(iii)基于相互作用，测定所述序列和/或所述独特序列单元的顺序，从而测定所述靶多核苷酸上的一个或多个特定序列单元。

3.根据权利要求1的方法，其中所述多联体可通过环化所述靶多核苷酸并且用所述环状靶多核苷酸作为模板进行聚合酶反应来形成。

4.根据权利要求3的方法，其中所述环状靶多核苷酸包括附加的核酸序列。

5.根据权利要求3或权利要求4的方法，其中所述靶多核苷酸通过将所述靶多核苷酸与所述第二多核苷酸杂交而被环化，其中所述靶多核苷酸的5’和3’区域与所述第二多核苷酸杂交以使所述5’和3’端接近，并且连接所述5’和3’端。

6.根据权利要求3或权利要求4的方法，其中所述靶多核苷酸通过将一个寡核苷酸与所述靶多核苷酸杂交而被环化，其中所述寡核苷酸与所述靶标的5’和3’区域都互补，从而使得所述5’和3’端接近，并且连接所述5’和3’端。

7.根据权利要求6的方法，其中所述寡核苷酸在所述聚合酶反应之前用一种外切核酸酶移除。

8.根据权利要求2的方法，其中步骤(ii)通过所述第一和第二多核苷酸之间的杂交进行，其中所述第一多核苷酸包括与所述第二多核苷酸的所述第一序列单元而非所述第二序列单元相互作用的序列单元，并且其中所述第一和第二序列单元的顺序使得所述第一多核苷酸上未杂交序列单元的顺序可以代表所述靶多核苷酸上序列单元的确定顺序。

9.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述靶多核苷酸上的核酸序列单元是一个第一确定序列或一个第二确定序列。

10.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述靶多核苷酸上的每个单元包括至少4个核苷酸，优选地至少6个核苷酸，并且其中所述第一序列和所述第二序列有两个核苷酸不同。

11.根据权利要求2的方法，其中所述第二多核苷酸通过滚环聚合酶反应形成。

12.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述靶多核苷酸包括至少40个，优选地至少50个核酸序列单元。

13.根据权利要求1至9任一项的方法，其中所述靶标上的所述序列单元是该单元位置唯一的。

14.根据权利要求13的方法，其中所述第二多核苷酸被设计用于与所述第一多核苷酸的每个靶多核苷酸杂交，但是不与每个靶标上的一个预定序列单元杂交，由此使得在杂交后在未杂交的一个或多个靶多核苷酸中有一个序列单元。

15.根据权利要求15的方法，其中一个或多个靶多核苷酸中的未杂交的所述序列单元被测定。

16.一种形成双链多核苷酸的方法，包括：

(i)形成一个第一多核苷酸；

(ii)用附着到所述第一多核苷酸上的引物分子进行滚环扩增反应，其中所述扩增反应利用了一个环状多核苷酸分子，所述环状多核苷酸分子具有与所述第一多核苷酸的重复单元至少部分互补的一个序列。

17.根据权利要求16的方法，其中所述环状多核苷酸通过将一个单链多核苷酸杂交到所述第一多核苷酸上来环化，其中所述单链多核苷酸的所述5’和3’区域与所述第一多核苷酸杂交以使所述5’和3’端接近，并且连接所述5’和3’端。

18.根据权利要求16的方法，其中所述环状多核苷酸通过将一个寡核苷酸杂交到所述单链形式的所述多核苷酸上来环化，其中所述寡核苷酸与所述多核苷酸的5’和3’区域都互补，从而使得所述5’和3’端接近，并且连接所述5’和3’端。

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