WO2018020831A1 - 遺伝子変異を有するポリヌクレオチド配列の簡便検出法 - Google Patents

遺伝子変異を有するポリヌクレオチド配列の簡便検出法 Download PDF

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正靖 桑原
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Definitions

  • the present invention relates to a method for easily and efficiently detecting a polynucleotide containing a single nucleotide polymorphism (Single Nucleotide Polymorphism: SNP), a gene mutation such as base insertion or base deletion, and the like.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • SNP analysis methods include the use of SNP-specific primers and SNP-specific probes to examine SNP types based on the presence or absence of amplification or hybridization, and methods to examine SNP types based on the presence or absence of restriction enzyme cleavage.
  • SNP analysis methods include the use of SNP-specific primers and SNP-specific probes to examine SNP types based on the presence or absence of amplification or hybridization, and methods to examine SNP types based on the presence or absence of restriction enzyme cleavage.
  • SNP types based on the presence or absence of restriction enzyme cleavage.
  • directly sequencing sequences There are also known methods for directly sequencing sequences. However, these methods are expensive and expensive to use for simple inspections and self-medication in clinics, and the operation is complicated.
  • Patent Document 1 discloses a method for detecting RNA by a rolling circle amplification method. However, since analyte RNA is used as a primer, the sequence that can be detected is restricted to the 3 ′ end. Also, the amplification efficiency and detection efficiency are not sufficient.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently detecting gene mutations such as SNPs, base insertions and base deletions existing at specific positions on a target polynucleotide by a simple technique.
  • Non-Patent Document 1 Using a target polynucleotide containing a gene mutation such as the above, and designing a primer in the region containing the gene polymorphism, it was found that the type and presence of the gene mutation can be efficiently discriminated by the presence or absence of amplification, and the present invention was completed. I let you.
  • a method for detecting a genetic mutation comprising
  • the single-stranded circular DNA is A 10-30 base sequence complementary to the first region of the capture polynucleotide; A primer binding sequence adjacent to the 5 ′ side of the sequence; Preferably a sequence complementary to the detection reagent binding sequence;
  • Including The oligonucleotide primer is A region having a sequence of 8 to 15 bases complementary to the second region of
  • a method for detecting a genetic mutation comprising: A step of hybridizing a single-stranded circular DNA and a primer to a target polynucleotide comprising a first region and a second region containing a mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region; A step of performing a nucleic acid amplification reaction based on complex formation of a nucleotide, a primer, and a single-stranded circular DNA, and a step of detecting a detection reagent binding sequence contained in the amplified nucleic acid, preferably in the amplified nucleic acid, by a detection reagent; Including The single-stranded circular DNA is A 10-30 base sequence complementary to the first region of the target polynucleotide; A primer binding sequence adjacent to the 5 ′ side of the sequence; Prefer
  • a method for detecting a genetic mutation comprising: Hybridizing a first single-stranded circular DNA and a first primer to a target polynucleotide comprising a first region and a second region containing a mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region; Performing a nucleic acid amplification reaction based on complex formation of a target polynucleotide, a first primer, and a first single-stranded circular DNA by rolling circle amplification; a second single strand on an extended strand generated by the nucleic acid amplification reaction; A step of hybridizing a circular DNA and a second oligonucleotide primer to perform a nucleic acid amplification reaction based on the complex formation of the extended strand, the second primer and the second single-stranded circular DNA, and an
  • the oligonucleotide primer (the first oligonucleotide primer in the second embodiment) is a base that hybridizes with a mutant base present in the second region of the target polynucleotide. It is preferable to have it at the most 3 ′ position of the region having a sequence of 8 to 15 bases complementary to the region.
  • a method for detecting a genetic mutation comprising: A step of hybridizing a single-stranded circular DNA and a capture polynucleotide to a miRNA comprising a first region and a second region containing a 3 ′ mutation thereof, one capture polynucleotide and one miRNA by rolling circle amplification A step of performing a nucleic acid amplification reaction based on the formation of a complex of strand circular DNA, and a step of detecting the amplified nucleic acid, preferably a detection reagent binding sequence with a detection reagent, a miRNA binding region complementary to the second region of the miRNA and a 3 ′ second region thereof, preferably a sequence complementary to the detection reagent binding sequence; Including The capture polynucleotide is A sequence complementary to the second region of the single-strand
  • a method for detecting a genetic mutation comprising: A step of hybridizing a first single-stranded circular DNA and a capture polynucleotide to a miRNA containing a first region and a second region containing a mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region, rolling circle amplification A step of performing a nucleic acid amplification reaction based on the complex formation of miRNA, capture polynucleotide and first single-stranded circular DNA, and the second single-stranded circular DNA and the second A step of hybridizing an oligonucleotide primer to perform a nucleic acid amplification reaction based on the complex formation of the extended strand, the second primer, and the second single-stranded circular DNA, and in the amplified nucleic acid, preferably in the amplified nucleic acid
  • the detection reagent binding sequence is a guanine quadruplex forming sequence
  • the detection reagent is preferably a guanine quadruplex binding reagent
  • the guanine quadruplex binding reagent is a ThT derivative described later. preferable.
  • a single-stranded circular DNA and a primer hybridize, from which a number of detection reagent binding sequences such as guanine quadruplex-containing sequences are arranged in series.
  • a connected DNA strand is generated, and this is stained with a detection reagent such as ThT (derivative), whereby the target polynucleotide sequence can be specifically detected.
  • ThT detection reagent
  • the RCA method in which the reaction proceeds at a constant temperature is used instead of the PCR method that requires a temperature cycle such as temperature increase / decrease, so that it can be applied to a simple detection method.
  • the asterisk indicates the SNP site.
  • the asterisk indicates the SNP site.
  • Complex formation of the target polynucleotide of Example 1 (samples b2 to b7), the first single-stranded circular DNA, and various first primers, the extension product thereof and the second single-stranded circular DNA, and The figure which shows the composite_body
  • Example 2 Complex formation of the target polynucleotide, single-stranded circular DNA, and various primers of Example 2 (sa2, a4, b2, b4, b5, b6), the extension product thereof, and the second single-stranded circular DNA,
  • the figure which shows the complex formation of a 2nd primer The figure (photograph) which shows the target polynucleotide detection result in Example 2.
  • FIG. The figure which shows the difference in the fluorescence spectrum at the time of targeting double stranded DNA and single stranded DNA in Example 2.
  • Example 3 Complex formation of the target polynucleotide, single-stranded circular DNA, and various primers of Example 3 (samples b2, b3, b4, b5, c2, c3, c4, c5), the extension product thereof, and the second one
  • FIG. which shows the structure of the composite_body
  • FIG. The schematic diagram of the polynucleotide amplification method concerning the 3rd aspect of this invention.
  • the asterisk indicates the SNP site.
  • the asterisk indicates the SNP site.
  • FIG. 6 The figure which shows the structure of the composite_body
  • FIG. 7 The figure which shows the structure of the target polynucleotide (miRNA) of Example 7 (miR-13 (u)), single strand circular DNA, a capture polynucleotide, and a primer.
  • a method for detecting a genetic mutation comprising
  • the single-stranded circular DNA is A 10-30 base sequence complementary to the first region of the capture polynucleotide; A primer binding sequence adjacent to the 5 ′ side of the sequence; Preferably a sequence complementary to the detection reagent binding sequence;
  • Including The oligonucleotide primer is A region having a sequence of 8 to 15 bases complementary to the second region of
  • the method for detecting a genetic mutation comprises: Using a target polynucleotide comprising a first region and a second region comprising a mutation adjacent to its 3 ′ side, (I) a sequence of 10 to 30 bases complementary to the first region of the target polynucleotide; A primer binding sequence adjacent to the 5 ′ side of the sequence; A sequence complementary to the detection reagent binding sequence; A single-stranded circular DNA containing, (Ii) a sequence of 8 to 15 bases complementary to a second region containing a mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region of the target polynucleotide; A sequence complementary to the primer binding sequence of single-stranded circular DNA adjacent to the 3 ′ side of the sequence; An oligonucleotide primer comprising: (Iii) a detection reagent; Is used.
  • the target polynucleotide is not particularly limited as long as it is a sequence containing a gene mutation such as SNP, and may be DNA or RNA.
  • the DNA may be a single-stranded DNA or a double-stranded DNA consisting of a sense strand and an antisense strand (complementary strand).
  • the region containing the target gene mutation is set as the second region
  • the region adjacent to the 5 ′ side is set as the first region
  • the sequence including these can be set as the target polynucleotide. Based on the sequences of the first region and the second region, the following single-stranded circular DNA and primers can be designed.
  • the target polynucleotide may be prepared or isolated from a sample derived from a biological species.
  • a sample containing such a target polynucleotide can be a virus, a prokaryotic or eukaryotic individual itself, or a part thereof.
  • feces, urine, or excrement such as sweat, blood, semen, saliva, gastric fluid, bodily fluids such as bile, and the like.
  • it may be a tissue surgically removed from a living body, or a tissue removed from a living body such as body hair.
  • it may be a polynucleotide-containing preparation prepared from a processed product such as food.
  • it may be an RNA-containing preparation prepared by further fractionating the sample and removing a part thereof.
  • the sample contains the target polynucleotide, it can be used whether the polynucleotide is purified or not.
  • the length of the target polynucleotide is not particularly limited as long as the single-stranded circular DNA and the primer can hybridize. Since a single-stranded circular DNA is likely to hybridize to the loop portion of the stem loop structure, a polynucleotide having a stem loop structure is preferable.
  • the single-stranded circular DNA has a sequence of 10 to 30 bases complementary to the first region of the target polynucleotide, A primer binding sequence, preferably 7-8 bases, adjacent to the 5 ′ side of the sequence; And a sequence complementary to a detection reagent binding sequence such as a guanine quadruplex forming sequence.
  • the target polynucleotide is a double-stranded DNA
  • the single-stranded circular DNA has 10 to 30 bases complementary to the first region of the target polynucleotide, as shown in c2, c3, and c5 in FIG. It is preferable to further include a sequence complementary to the 3 ′ end of the sequence adjacent to the 3 ′ end of the sequence. Thereby, the complementary strand of double-stranded DNA can be hybridized, and the complex is more stabilized.
  • the single-stranded circular DNA 10 comprises a sequence 101 complementary to the first region 111 of the target polynucleotide 11, a primer binding sequence 102 linked to its 5 ′ side, and a sequence 103 complementary to the guanine quadruplex forming sequence.
  • the length of the sequence 101 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the sequence 102 is preferably 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • 22mer DNA 22AG: 5′-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 27) and 22 Kit: 5′-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 28)), 26mer DNA (26Tel: 5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3 ′ (SEQ ID NO: 29)), 27mer DNA (27Myc: 5'-TGGGGAGGGTGGGGGGAGGGTGGGGA AGG-3 '(SEQ ID NO: 30)), 20mer DNA (20Src: 5′-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 31)), 18mer RNA (18Ras: 5′-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 32)).
  • the sequence complementary to the guanine quadruplex forming sequence may include any sequence before and after that, that is, between the primer binding sequence 102 and the sequence 101 complementary to the first region of the target polynucleotide. .
  • the total length of the single-stranded circular DNA 10 is preferably 35 to 100 bases.
  • the detection reagent binding sequence may be an aptamer sequence or a molecular beacon (a fluorescent group (donor) that generates FRET and a quenching group). It is also possible to detect by using an aptamer-binding chromogenic molecule or molecular beacon as a detection reagent with a (hairpin-like oligonucleotide having (acceptor)) binding sequence. It is also possible to detect using a labeled probe that hybridizes to the detection reagent binding sequence.
  • a molecular beacon a fluorescent group (donor) that generates FRET and a quenching group. It is also possible to detect by using an aptamer-binding chromogenic molecule or molecular beacon as a detection reagent with a (hairpin-like oligonucleotide having (acceptor)) binding sequence. It is also possible to detect using a labeled probe that hybridizes to the detection reagent binding sequence.
  • the amplified nucleic acid is detected using a nucleic acid staining reagent such as Cyber Gold (trade name) that binds to DNA non-sequence-specifically and emits fluorescence as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the single-stranded circular DNA is not essential.
  • a nucleic acid staining reagent such as Cyber Gold (trade name) that binds to DNA non-sequence-specifically and emits fluorescence as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the single-stranded circular DNA is not essential.
  • Single-stranded circular DNA 10 can be obtained by circularizing single-stranded DNA (ssDNA).
  • the circularization of single-stranded DNA can be performed by any means.
  • CircLigase registered trademark
  • CircLigase II registered trademark
  • ssDNA Single-stranded DNA
  • ThermoPhage ligase registered trademark
  • the primer 12 has 8 to 15 bases complementary to the second region 112 containing a genetic mutation (star mark in FIG. 1) such as SNP adjacent to the 3 ′ side of the first region 111 of the target polynucleotide 11.
  • the primer may be immobilized on the carrier by immobilization. This also enables detection on a solid phase. Examples of the immobilization method include a method of labeling a primer with biotin or the like and immobilizing the primer by interaction with avidin or the like.
  • the oligonucleotide primer has a base that hybridizes to the mutant base present in the second region of the target polynucleotide at the 3′-most position of the sequence 121 complementary to the second region of the target polynucleotide. Is preferred. For example, when the polymorphism of the target polynucleotide is a single nucleotide polymorphism of A / G and A is to be detected, T corresponding to A is positioned at the 3 ′ end of the target polynucleotide binding sequence. It is particularly preferred to design oligonucleotide primers.
  • ⁇ Amplification method> After the single-stranded circular DNA 10 and the primer 12 are hybridized to the target polynucleotide 11 to form a triple complex, a nucleic acid amplification reaction based on the target polynucleotide is performed by a rolling circle amplification (RCA) method.
  • RCA rolling circle amplification
  • the RCA method is described in Lizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998); U.S. Pat. Nos. 5,854,033 and 6,143,495; PCT application WO97 / 19193, etc. .
  • RCA methods include, for example, phi29 polymerase, Klenow DNA Polymerase (5'-3 ', 3'-5' exo minus), Sequenase (registered trademark) Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB), Bsu DNA Polymerase, Large Fragment ( NEB) medium temperature strand displacement DNA synthetase, Bst DNA-Polymerase (Large Fragment), Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas), BcaBEST DNA-polymerase (TakaraBio), Vent DNA-polymerase (NEB) , Deep Vent DNA polymerase (NEB), DisplaceAce (registered trademark) DNA Polymerase (Epicentre), and the like.
  • the extension reaction of DNA by RCA does not need to use a thermal cycler, and is performed at a constant temperature in the range of 25 ° C. to 65 ° C., for example.
  • the reaction temperature is appropriately set by a normal procedure based on the optimum temperature of the enzyme and the denaturation temperature based on the primer chain length (temperature range in which the primer binds (anneals) / dissociates with the template DNA). Furthermore, it is also carried out at certain relatively low temperatures. For example, when phi29 DNA polymerase is used as the strand displacement type DNA synthase, the reaction is preferably performed at 25 to 42 ° C, more preferably at about 30 to 37 ° C.
  • the RCA amplifies a nucleic acid (amplification product 13) including a guanine quadruplex forming sequence (corresponding to the sequence 103) from the primer 12 along the single-stranded circular DNA 10 depending on the target polynucleotide 11.
  • the amplification product 13 includes a sequence 104 containing a guanine quadruplex and is detected by a guanine quadruplex detection reagent 105.
  • the detection method of the present invention can identify the type of gene mutation such as SNP of the target polynucleotide and the presence or absence of the gene mutation.
  • the stability of the complex is designed based on hybridization with a primer having a base corresponding to the mutation, designed so that the second region of the target polynucleotide contains the mutation.
  • the method of analyzing the extension reaction from the primer based on the stability of the body is also included in the method of the present invention.
  • the gene mutation detection method comprises: Using a target polynucleotide comprising a first region and a second region comprising a mutation adjacent to its 3 ′ side, (I) a sequence of 10 to 30 bases complementary to the first region of the target polynucleotide; A first primer binding sequence adjacent 5 ′ of the sequence; A complementary sequence of a second single-stranded circular DNA binding sequence; A first single-stranded circular DNA comprising: (Ii) a sequence of 8 to 15 bases complementary to a second region containing a mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region of the target polynucleotide; A sequence complementary to the first primer binding region of the first single-stranded circular DNA adjacent to the 3 ′ side of the sequence; A first oligonucleotide primer comprising: (Iii) a sequence identical to
  • the target polynucleotide is as described in the first aspect.
  • the first single-stranded circular DNA has a sequence of 10 to 30 bases complementary to the first region of the target polynucleotide; A primer binding sequence, preferably 7-8 bases, adjacent to the 5 ′ side of the sequence; A complementary sequence of a second single-stranded circular DNA binding sequence; including.
  • the target polynucleotide is a double-stranded DNA
  • the first single-stranded circular DNA has 10 to 10 complementary to the first region of the target polynucleotide, as shown by c2, c3, and c5 in FIG. It is preferable to further include a sequence complementary to the 3 ′ end of the 30-base sequence and adjacent to the 3 ′ end of the sequence. Thereby, the complementary strand of double-stranded DNA can be hybridized, and the complex is more stabilized.
  • the first single-stranded circular DNA 20 has a sequence 201 complementary to the first region 211 of the target polynucleotide 21; It includes a primer binding sequence 202 linked to its 5 ′ side and a complementary sequence 203 of the second single-stranded circular DNA binding sequence.
  • the length of the sequence 201 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the sequence 202 is 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the entire length of the first single-stranded circular DNA 20 is preferably 35 to 100 bases.
  • the first single-stranded circular DNA 20 can be obtained by circularizing single-stranded DNA (ssDNA) by the method described above.
  • the first oligonucleotide primer 22 comprises a sequence 221 of 8 to 15 bases complementary to the second region 212 containing the gene mutation adjacent to the 3 ′ side of the first region 211 of the target polynucleotide 21; And a sequence 222 preferably of 7 to 8 bases complementary to the primer binding region 202 of the first single-stranded circular DNA 20 linked to the 3 ′ side.
  • the base that hybridizes with the mutant base present in the second region of the target polynucleotide is the 3′-most side of the sequence 221 complementary to the second region of the target polynucleotide. It is preferable to have it in the position.
  • T corresponding to A is positioned at the most 3 ′ position of the target polynucleotide binding sequence 221.
  • the second single-stranded circular DNA 24 has a sequence 241 identical to the complementary sequence 203 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 20; A second primer binding sequence 242 adjacent to the sequence 5 '; A sequence 243 complementary to a guanine quadruplex forming sequence; including.
  • the length of the sequence 241 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the sequence 242 is 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the sequence 243 complementary to the guanine quadruplex forming sequence is the same as described in the first embodiment.
  • the total length of the second single-stranded circular DNA 24 is preferably 35 to 100 bases.
  • the second single-stranded circular DNA 24 can be obtained by circularizing single-stranded DNA (ssDNA) by the method described above.
  • the detection reagent binding sequence is a guanine quadruplex formation sequence.
  • the detection reagent binding sequence is an aptamer sequence or a molecular beacon (a fluorescent group (donor) that generates FRET and a quenching group (acceptor). It is also possible to detect using an aptamer-binding chromogenic molecule or molecular beacon as a detection reagent (ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803; J. Am. Chem) Soc. 2013, 135, 7430-7433).
  • the amplified nucleic acid is detected using a nucleic acid staining reagent such as Cyber Gold (trade name) that emits fluorescence by binding to DNA non-specifically as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the second single-stranded circular DNA is not essential.
  • a nucleic acid staining reagent such as Cyber Gold (trade name) that emits fluorescence by binding to DNA non-specifically as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the second single-stranded circular DNA is not essential.
  • the second oligonucleotide primer 25 has the same sequence 251 (preferably 8) as the region 204 adjacent to the 5 ′ side of the complementary sequence 203 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 20. And a sequence 252 (preferably a sequence of 7 to 8 bases) complementary to the second primer binding sequence 242 of the second single-stranded circular DNA adjacent to the 3 ′ side of the sequence. And including.
  • ⁇ Amplification method> As shown in FIG. 2, first, a first single-stranded circular DNA 20 and a primer 22 are hybridized to a target polynucleotide 21 to form a triple complex, followed by rolling circle amplification (RCA) method. A nucleic acid amplification reaction based on the target polynucleotide is performed. Reaction conditions and the like are the same as in the first embodiment. The first amplification product 23 is amplified along the first single-stranded circular DNA 20 from the primer 22 by the RCA, depending on the target polynucleotide 21.
  • RCA rolling circle amplification
  • the amplification product 23 includes a sequence 231 complementary to the complementary sequence 203 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 20, a second sequence 241 that includes the same sequence 241 as the sequence 203 is obtained.
  • Single-stranded circular DNA 24 hybridizes to the sequence 231 of the first amplification product 23 via the sequence 241.
  • the second oligonucleotide primer 25 hybridizes to the complex of the first amplification product 23 and the second single-stranded circular DNA thus produced, thereby forming a triple complex.
  • the second oligonucleotide primer 25 has the same sequence 251 as the region 204 adjacent to the 5 ′ side of the complementary sequence 203 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 20. Therefore, it hybridizes via the sequence 251 to the region 232 complementary to the region 204 of the first single-stranded circular DNA 20 of the first amplification product 23.
  • the second oligonucleotide primer 25 has a sequence 252 complementary to the second primer binding sequence 242 of the second single-stranded circular DNA 24 on the 3 ′ side of the sequence 251, the second single primer It also hybridizes to the strand circular DNA 24 via the sequence 252.
  • the second amplification product 26 (extended strand) is amplified by RCA.
  • the second amplification product 26 includes a sequence 261 containing a guanine quadruplex and is detected by the guanine quadruplex detection reagent 262.
  • the detection sensitivity can be significantly improved.
  • the detection method of the present invention can identify the type of gene mutation such as SNP of the target polynucleotide or the presence or absence of the gene mutation.
  • the method for detecting a genetic mutation comprises: MiRNA containing a first region and a second region containing a 3 ′ mutation thereof as a target polynucleotide, (I) a single-stranded circular DNA comprising a miRNA binding region complementary to the second region of miRNA, a second region on the 3 ′ side thereof, and a sequence complementary to a detection reagent binding sequence such as guanine quadruplex; , (Ii) a template binding sequence complementary to the second region of the single-stranded circular DNA; a capture polynucleotide comprising a miRNA binding sequence complementary to a first region of the miRNA; (Iii) a detection reagent; The reaction is performed using
  • the target polynucleotide is an miRNA containing a genetic mutation such as SNP.
  • a miRNA having a mutation on the 3 ′ side that is, a one containing a first region and a second region containing the 3 ′ mutation is used.
  • the mutation is preferably present at the 3 ′ end of the miRNA or at a position within 1 to 3 bases from the 3 ′ end.
  • the length of miRNA is preferably 15 to 30 bases, more preferably 15 to 25 bases, and further preferably 15 to 23 bases.
  • the single-stranded circular DNA includes a miRNA binding region complementary to the second region of miRNA, a second region on the 3 ′ side thereof, and a sequence complementary to a detection reagent binding sequence such as a guanine quadruplex forming sequence. .
  • the single-stranded circular DNA 30 is complementary to a sequence (miRNA binding region) 301 complementary to the second region 322 of the target miRNA 32, a second region 302 linked to the 3 ′ side thereof, and a guanine quadruplex forming sequence.
  • the sequence 303 is included.
  • the length of the sequence 301 is preferably 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the second region 302 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the miRNA binding region 301 complementary to the second region 322 of the miRNA 32 of the single-stranded circular DNA 30 contains a base complementary to the miRNA mutation (mutation to be detected: asterisk in FIG. 14). If the mutation is different from the detection target, it will not hybridize. Therefore, the presence or absence of the target mutation can be detected based on the presence or absence of hybridization.
  • the sequence 303 complementary to the guanine quadruplex forming sequence may include any sequence before and after that, that is, between the second region 302 and the miRNA binding region 301.
  • the total length of the single-stranded circular DNA 30 is preferably 35 to 100 bases.
  • the guanine quadruplex forming sequence can be replaced with other detection reagent binding sequences.
  • the amplified nucleic acid is detected using a nucleic acid staining reagent such as CyberC Gold (trade name) that binds to DNA non-specifically and emits fluorescence as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the single-stranded circular DNA is not essential.
  • the capture polynucleotide includes a template binding sequence complementary to the second region of the single-stranded circular DNA and a miRNA binding sequence complementary to the first region of the miRNA.
  • the capture polynucleotide 31 includes a sequence 311 complementary to the second region 302 of the single-stranded circular DNA 30 and a miRNA binding sequence 312 complementary to the first region 321 of the miRNA 32.
  • the length is usually 10-30 bases, preferably 15-25 bases, the GC content is preferably 30-70%, the length of the sequence 312 is usually 8-15 bases, and the GC content Is preferably 30 to 70%.
  • the 3 ′ end of the capture polynucleotide is preferably modified with a phosphate machine or the like.
  • a single-stranded circular DNA 30 and a capture polynucleotide 31 are hybridized to a target polynucleotide (miRNA) 32 to form a triple complex, and then a nucleic acid amplification reaction based on the target polynucleotide by rolling circle amplification (RCA) method I do.
  • miRNA target polynucleotide
  • RCA rolling circle amplification
  • the amplification product 33 is amplified from the target polynucleotide (miRNA) 32 along the single-stranded circular DNA 30 by RCA.
  • the amplification product 33 includes a sequence 331 including a guanine quadruplex, and is detected by the guanine quadruplex detection reagent 34.
  • the detection method of the present invention can identify the type of gene mutation such as SNP of the target polynucleotide and the presence or absence of the gene mutation.
  • the method for detecting a genetic mutation comprises: MiRNA containing a first region and a second region containing a 3 ′ mutation thereof as a target polynucleotide, (I) a first single strand comprising a miRNA binding region complementary to the second region of the miRNA, a second region on the 3 ′ side thereof, and a complementary sequence of the second single-stranded circular DNA binding sequence Strand circular DNA, (Ii) a capture polynucleotide comprising a template binding sequence complementary to the second region of single-stranded circular DNA, and a miRNA binding sequence complementary to the first region of miRNA; (Iii) a sequence identical to the complementary sequence of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA, a second primer binding sequence adjacent to the 5 ′ side of the sequence,
  • ⁇ Target polynucleotide> The target polynucleotide and the capture polynucleotide are as described in the third embodiment.
  • the single-stranded circular DNA includes a miRNA binding region complementary to the second region of the miRNA, a 3 ′ second region, and a second single-stranded circular DNA binding sequence complementary sequence.
  • the miRNA binding region complementary to the second region of miRNA contains a sequence complementary to the mutated portion of miRNA, and the presence or absence of mutation can be detected by the presence or absence of hybridization.
  • the single-stranded circular DNA 40 includes a sequence (miRNA binding region) 401 complementary to the second region 422 of the target miRNA 42, a second region 402 linked to the 3 ′ side thereof, and a second single-stranded circular DNA bond.
  • sequence 403 of the sequence is included.
  • the length of the sequence 401 is preferably 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the sequence 402 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the entire length of the first single-stranded circular DNA 40 is preferably 35 to 100 bases.
  • the first single-stranded circular DNA 40 can be obtained by circularizing single-stranded DNA (ssDNA) by the method described above.
  • the second single-stranded circular DNA 44 is adjacent to the sequence 441 identical to the complementary sequence 403 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 40, and adjacent to the 5 ′ side of the sequence.
  • a second primer binding sequence 442 and a sequence 443 complementary to the guanine quadruplex forming sequence are included.
  • the length of the sequence 441 is usually 10 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, and the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the length of the sequence 442 is preferably 7 or 8 bases, and the sequence is not particularly limited, but the GC content is preferably 30 to 70%.
  • the sequence 443 complementary to the guanine quadruplex forming sequence is the same as described in the first embodiment.
  • the entire length of the second single-stranded circular DNA 44 is preferably 35 to 100 bases.
  • the second single-stranded circular DNA 44 can be obtained by circularizing single-stranded DNA (ssDNA) by the method described above.
  • FIG. 15 illustrates the case where the detection reagent binding sequence is a guanine quadruplex formation sequence.
  • the detection reagent binding sequence may be an aptamer sequence or a molecular beacon (a fluorescent group (donor) that generates FRET and a quenching group (acceptor)). Hairpin-shaped oligonucleotide) can be detected using an aptamer-binding chromogenic molecule or molecular beacon as a detection reagent (ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803; J. Am. Chem) . Soc. 2013, 135, 7430-7433).
  • nucleic acid amplified using a nucleic acid staining reagent such as CyberC Gold (trade name) that binds to DNA non-specifically and emits fluorescence as a detection reagent. Therefore, the presence of a sequence complementary to the detection reagent binding sequence in the second single-stranded circular DNA is not essential.
  • the second oligonucleotide primer 45 has the same sequence 451 (preferably 8) as the region 404 adjacent to the 5 ′ side of the complementary sequence 403 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 40.
  • a sequence 452 (preferably a sequence of 7 to 8 bases) complementary to the second primer binding sequence 442 of the second single-stranded circular DNA adjacent to the 3 ′ side of the sequence. And including.
  • a capture oligonucleotide 41 and a first single-stranded circular DNA 40 are hybridized to a target polynucleotide (miRNA) 42 to form a triple complex, and then a rolling circle is formed.
  • a nucleic acid amplification reaction based on the target polynucleotide is performed by the amplification (RCA) method. Reaction conditions and the like are the same as in the first embodiment.
  • the first amplification product 43 is amplified along the first single-stranded circular DNA 40 by RCA depending on the target polynucleotide (miRNA) 42.
  • the amplification product 43 includes a sequence 431 complementary to the complementary sequence 403 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 40
  • the second amplified product 43 includes a sequence 441 identical to the sequence 403.
  • Single-stranded circular DNA 44 hybridizes to the sequence 431 of the first amplification product 43 via the sequence 441.
  • the second oligonucleotide primer 45 is hybridized with the complex of the first amplification product 43 and the second single-stranded circular DNA thus produced to form a triple complex.
  • the second oligonucleotide primer 45 has the same sequence 451 as the region 404 adjacent to the 5 ′ side of the complementary sequence 403 of the second single-stranded circular DNA binding sequence of the first single-stranded circular DNA 40. Therefore, it hybridizes via the sequence 451 to the region 432 complementary to the region 404 of the first single-stranded circular DNA 40 of the first amplification product 43. Further, since the second oligonucleotide primer 45 has a sequence 452 complementary to the second primer binding sequence 442 of the second single-stranded circular DNA 44 on the 3 ′ side of the sequence 451, the second one It also hybridizes to the strand circular DNA 44 via the sequence 452.
  • the second amplification product 46 (extended strand) is amplified by RCA.
  • the second amplification product 46 includes a sequence 461 including a guanine quadruplex, and is detected by a guanine quadruplex detection reagent 462.
  • the detection sensitivity can be significantly improved.
  • the detection method of the present invention can identify the type of gene mutation such as SNP of the target polynucleotide or the presence or absence of the gene mutation.
  • a nucleic acid staining reagent such as Cyber Gold (trade name) that binds to DNA non-specifically and emits fluorescence can also be used as a detection reagent.
  • a molecule that emits light or develops color by binding to a specific nucleic acid sequence is preferable.
  • the combination of the detection reagent binding sequence and the detection reagent can be arbitrarily determined, the aptamer sequence and the aptamer binding coloring molecule combination, the molecular beacon binding sequence and the molecular beacon combination, the specific sequence and the labeled probe that hybridizes to it.
  • a combination of guanine quadruplex and guanine quadruplex binding reagent is preferable.
  • the guanine quadruplex binding reagent include the following reagents.
  • H-aggregate “Yan, JW; Ye, WJ; Chen, SB; Wu, WB; Hou, JQ; Ou, TM; Tan, JH; Li, D .; Gu, LQ; Huang, ZS Anal. Chem 2012, 84, 6288-6292.
  • TMPyP4 “Yaku, H .; Fujimoto, T .; Murashima, T .; Miyoshi, D .; Sugimoto, N.
  • ThT derivative represented by the following general formula (I) can be used (Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084). JP2016-079132.
  • R 1 represents hydrogen or a hydrocarbon group having 1 to 10 (preferably 1 to 5) carbon atoms which may contain one or more selected from O, S and N.
  • the hydrocarbon group may be linear or branched, may be saturated or unsaturated, may be an aliphatic hydrocarbon group such as an alkyl group, or may be an aromatic hydrocarbon group such as an aryl group or an arylalkyl group.
  • “It may contain one or more selected from O, S and N” means that the hydrocarbon group is an amino group (—NR 2 ) (where R is independently hydrogen or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms). ), Nitro group (—NO 2 ), cyano group (—CN), isocyanate group (—NCO), hydroxyl group (—OH), aldehyde group (—CHO), carboxyl group (—COOH), mercapto group (—SH) ), A functional group containing a nitrogen atom, oxygen atom, sulfur atom, etc., such as a sulfonic acid group (—SO 3 H), an ether group (—O—), an imino group (— NH—), thioether group (—S—), carbonyl group (—C ( ⁇ O) —), amide group (—C ( ⁇ O) —NH—), ester group (—C ( ⁇ O) —O—) ), Nitrogen atoms such as thioester groups (—C ( ⁇ O)
  • R 2 , R 3 and R 4 each independently represents an (aliphatic) hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, more preferably a hydrocarbon group having 1 to 3 carbon atoms, and a methyl group is particularly preferred.
  • the hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms may be linear or branched, and may be saturated or unsaturated.
  • n represents an integer of 0 to 5, more preferably an integer of 0 to 3, and particularly preferably 1.
  • X represents O, S or NH, and more preferably O.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is brought into contact with a sample containing the RCA product, and the compound bound to the guanine quadruplex structure is detected based on the fluorescence emitted by the compound.
  • the guanine quadruplex structure in the test DNA can be detected.
  • the detection operation itself is the same as the known method except that the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof is used.
  • a solution in which the compound is dissolved in a buffer solution is used as a sample containing the test DNA. It can be carried out by contacting, washing after incubation, and detecting the fluorescence of the fluorescent dye bound to the test DNA after washing.
  • DNA primer (2) is a sequence in which G (7G) at the 7th base of DNA primer (1) is changed to T DNA primer (3) is a sequence in which G (8G) at the 8th base of DNA primer (1) is changed to T DNA primer (4) is a sequence in which C (9C) at the 9th base of DNA primer (1) is changed to A DNA primer (5) is a sequence in which C (10C) at the 10th base of DNA primer (1) is changed to A DNA primer (6) is a sequence in which A (11A) at the 11th base of DNA primer (1) is changed to T DNA templates (1) to (9) are circularized.
  • Target RNA (2) is the target DNA (2), the sequence of the target RNA (1) is changed from U (30U) at the 30th base to A.
  • Target DNA (2) is the T (30T) at the 30th base of the target DNA (1).
  • Array changed to Complementary DNA is a sequence complementary to the target DNA (1)
  • c1 to c7 100 nM DNA template (1) 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template (2) 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM DNA primer (1) to (6) (see Table 2) 2 ⁇ L (Final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer (7) 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (Final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM no target RNA 2 ⁇ L (final concentration 1 nM), and water 2 ⁇ L were mixed (total 20 ⁇ L).
  • Target DNA / RNA difference and single base mismatch Preparation of a1 to a6 (Table 3) 100 nM DNA template (1) 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template (2) 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM DNA primer (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer (7) 2 ⁇ L (Final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM RNA 2 ⁇ L (see Table 3) and 2 ⁇ L of water were mixed (total 20 ⁇ L).
  • c1 to c5 100 nM DNA template (1), any of (3), (4) or (5) (see Table 5) 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template (2) 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM DNA primer (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer (7) 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1U / ⁇ L), 10nM double-stranded DNA (target DNA (1) and complementary DNA) 2 ⁇ L (final concentration 1nM), water 2 ⁇ L were mixed (total 20 ⁇ L)
  • Preparation of d1 to d5 100 nM DNA template (1), any of (3), (4) or (5) (see Table 5) 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template (2) 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM DNA primer (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer (7) 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U 2 ⁇ L of / hiL Phi29 Polymerase (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM Complementary DNA (final concentration 1 nM), and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Example 1 One-base mismatch of primer In each reaction composition shown in Table 2, the position where DNA primer (1) and target RNA (1) hybridize is mismatched by one base (Fig. 3). The change in reaction progress was verified. As a result, as shown in FIG. 4, it was found that the progress of the reaction was remarkably prevented as the base of the ternary complex of the DNA primer (1), the target RNA (1) and the template DNA (1) was approached.
  • Example 2 Differences in target DNA / RNA and 1-base mismatch
  • the target RNA (1) is mutated to a mismatch (30U ⁇ A) at the root of the tripartite complex.
  • the progress of the reaction was verified using the target (Fig. 5).
  • the progress of the reaction was remarkably inhibited when there was a mismatch in the target RNA (FIG. 6 a4).
  • FIG. 6 a4 Even when the target was DNA, it was found that detection was possible by looking at b3 in FIG.
  • the target DNA it was found that the target DNA having a single base mismatch (FIG.
  • FIG. 12 shows a reaction scheme. PCR amplification of a 1 kbp sequence (500 bp before and after the mutation site) containing a site containing SNP at position 636 or SNP at position 681 of the CYP2C19 gene encoding cytochrome P450 as a target sequence containing SNP from a human cultured cell (HepG2) genomic sample What was done was used. The following reagents were prepared, and in FIGS.
  • Figure 13 (A) Preparation of a1 to a5 100 nM DNA template T2 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P2 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (A) Preparation of b1 to b5 100 nM DNA template T2 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P3 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Fig. 13 (B) Preparation of a1 to a5 100 nM DNA template T3 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P4 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (B) Preparation of b1 to b5 100 nM DNA template T3 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P5 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (C) Preparation of a1 to a5 100 nM DNA template T2 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P2 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (amplified from 40mer or HepG2 gene 2 The final-strand DNA was annealed in advance (final concentration 1 nM) and 2 ⁇ L of water was mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (C) Preparation of b1 to b5 100 nM DNA template T2 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P3 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (amplified from 40mer or HepG2 gene 2 The final-strand DNA was annealed in advance (final concentration 1 nM) and 2 ⁇ L of water was mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (D) Preparation of a1 to a5 100 nM DNA template T3 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P4 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (amplified from 40mer or HepG2 gene 2 The final-strand DNA was annealed in advance (final concentration 1 nM) and 2 ⁇ L of water was mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 13 (D) Preparation of b1 to b5 100 nM DNA template T3 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer P5 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (amplified from 40mer or HepG2 gene 2 The final-strand DNA was annealed in advance (final concentration 1 nM) and 2 ⁇ L of water was mixed (20 ⁇ L in total).
  • wild type (FIG. 13 (C) a4) was confirmed in G636, and wild type (FIG. 13 (D) a4) was also confirmed in G681. From this, even when the target is a long double-stranded DNA of 1 kbp, mutation can be confirmed.
  • FIG. 16 shows a reaction scheme.
  • 2 bases of CA are added to the 3 ′ end of miR-21.
  • the following reagents were prepared and incubated at 37 ° C. for 2 hours to perform an extension reaction.
  • 2 ⁇ L of 5 ⁇ PBS153NM buffer 50 mM HPO 4 2 ⁇ , 730 mM Cl ⁇ , 765 mM Na + , 13.5 mM K + , 12.5 mM Mg 2+ pH 7.4 was added to 8 ⁇ L of each reaction solution.
  • Figure 17 Preparation of a1 to a2 100 nM DNA template T4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), and water 4 ⁇ L (total 20 ⁇ L) .
  • Figure 17 Preparation of b1-b2 100 nM DNA template T4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-21 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 17 Preparation of c1-c2 100 nM DNA template T4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-21CA 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 17 Preparation of d1 to d2 100 nM DNA template T4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (1) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-221 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • FIG. 18 shows a reaction scheme.
  • MiR-13a and miR-13b in Table 9 have a single base substitution of c / u with each other.
  • the following reagents were prepared and incubated at 37 ° C. for 2 hours to perform an extension reaction. 2 ⁇ L of 5 ⁇ PBS153NM buffer (50 mM HPO 4 2 ⁇ , 730 mM Cl ⁇ , 765 mM Na + , 13.5 mM K + , 12.5 mM Mg 2+ pH 7.4) was added to 8 ⁇ L of each reaction solution.
  • Figure 19 Preparation of a1-a2 100 nM DNA template T5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (2) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), and water 4 ⁇ L (total 20 ⁇ L) .
  • Figure 19 Preparation of b1-b2 100 nM DNA template T5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (2) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-13a 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 19 Preparation of c1-c2 100 nM DNA template T5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (2) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-13b 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Figure 19 Preparation of d1-d2 100 nM DNA template T5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template T1 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), water or 120 nM Capture Probe (2) 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer P6 2 ⁇ L (final concentration 48 nM) ), 10 ⁇ attached buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ attached BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), 10 nM miR-221 2 ⁇ L (final concentration) 1 nM) and 2 ⁇ L of water were mixed (20 ⁇ L in total).
  • Example 8 Detection of single nucleotide polymorphism in long-chain DNA
  • the reaction shown in Fig. 20 was performed, and polymorphisms G636 and G681 contained in the long-chain DNA were detected. Detection was performed.
  • Figure 21 (A) Preparation of a1 to a9 100 nM DNA template t4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template t2 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer p2 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer p1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 21 (A) Preparation of b1 to b9 100 nM DNA template t4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template t2 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer p3 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer p1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 21 (B) Preparation of a1 to a9 100 nM DNA template t5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template t2 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer p4 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer p1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 21 Preparation of b1 to b9 100 nM DNA template t5 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template t2 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer p5 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer p1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • Figure 22 (A) Preparation of b1 to b3 100 nM DNA template p4 2 ⁇ L (final concentration 10 nM), 400 nM DNA template t2 2 ⁇ L (final concentration 40 nM), 120 nM Primer p3 2 ⁇ L (final concentration 12 nM), 480 nM DNA primer p1 2 ⁇ L (final concentration 48 nM), 10 ⁇ attached Buffer 2 ⁇ L, 10 ⁇ BSA solution 2 ⁇ L, 10 mM dNTPs 2 ⁇ L (final concentration 1 mM), 1 U / ⁇ L Phi29 Polymerase 2 ⁇ L (final concentration 0.1 U / ⁇ L), water or 10 nM target DNA 2 ⁇ L (40mer, double-stranded DNA The final concentration (1 nM) after annealing was mixed with 2 ⁇ L of water (20 ⁇ L in total).
  • the double-stranded DNA used was an annealed complementary strand.
  • 1kbp long-chain DNA containing G636 and G681 was obtained by PCR amplification of human oral mucosa gene
  • ThT Thioflavin T
  • This method is a method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genome.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • FIG. 21 (A) a mutation of 636 bases (G681, Genotype # 3) of the CYP2C19 gene encoding cytochrome P450 (G is mutated to A) is detected, and in FIG. 21 (B), 681 bases of the CYP2C19 gene (G636 , Genotype # 2) mutation (G is mutated to A). Primer is used for each wild type and mutant type.
  • Figure 20 As the human oral mucosal cell genome sample, 1 kbp (500 bp before and after the mutation site) amplified by PCR was used. There are 6 subjects. As a result, G636 confirmed heterogeneity in E (mixed wild type and mutant), and G681 confirmed heterogeneity in F. From this, even when the target is a long double-stranded DNA of 1 kbp, mutation can be confirmed.
  • SYMBOLS 10 Single-stranded circular DNA, 11 ... Target polynucleotide, 12 ... Oligonucleotide primer, 13 ... Amplification product (extension product), 101 ... Sequence complementary to 1st area
  • 40 single-stranded circular DNA, 41 ... capture polynucleotide, 42 ... miRNA, 43 ... first amplification product (extension product), 44 ... second single-stranded circular DNA 45 ... second oligonucleotide primer, 46 ... second amplification product (extension product), 47 ... guanine quadruplex detection reagent, 401 ... complementary to the second region of miRNA 402 ... second region of single-stranded circular DNA, 403 ... second single-stranded circular DNA binding sequence complementary sequence, 404 ... region adjacent to 5 'side of 403, 411 ... Sequence complementary to the second region of single-stranded circular DNA, 412 ...

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Abstract

遺伝子変異の検出方法であって、 第１の領域と、第１の領域の３'側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および 増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、 を含み、 前記一本鎖環状DNAは、 前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、 該配列の５'側に隣接した、プライマー結合配列と、 好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、 を含み、 前記オリゴヌクレオチドプライマーは、 前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、該配列の３'側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、 を含む方法。

Description

遺伝子変異を有するポリヌクレオチド配列の簡便検出法
本発明は、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism: SNP）や塩基挿入、塩基欠失などの遺伝子変異を含むポリヌクレオチドを簡便に効率よく検出するための方法に関する。
近年、疾患に関連するSNPなどの遺伝子変異が数多く見出されており、遺伝子変異を解析して疾患のかかりやすさを予測する遺伝子検査や、治療方法を遺伝子変異の種類によって変えたりするオーダーメイド医療が注目を集めている。例えば、SNPの解析方法としては、SNP特異的プライマーやSNP特異的プローブを使用し、増幅やハイブリダイゼーションの有無によってSNPのタイプを調べる方法や、制限酵素による切断の有無によってSNPのタイプを調べる方法や、配列を直接シークエンシングする方法などが知られている。しかしながら、これらの方法はクリニックでの簡易検査やセルフメディケーションに用いるには装置の価格や使用コストが高く、操作も煩雑である。
特許文献１ではローリングサークル増幅法によってRNAを検出する方法が開示されているが、アナライトのRNAをプライマーに使用しているため、検出対象にできる配列が３'末端に制約される。また、増幅効率や検出効率の面でも十分ではない。
特開2012-080871号公報
Anal. Chem., 2016, 88 (14), pp 7137-7144
本発明は、標的ポリヌクレオチド上の特定の位置に存在するSNPなどの遺伝子変異や塩基挿入、塩基欠失を簡便な手法で効率よく検出するための方法を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、PCT/JP2016/059262（WO 2016/152936）で既に出願済の一本鎖環状DNA、プライマーおよびグアニン四重鎖結合試薬を用いたポリヌクレオチドの検出方法（非特許文献１）において、SNPなどの遺伝子変異を含む標的ポリヌクレオチドを用い、該遺伝子多型を含む領域にプライマーを設計することにより、増幅の有無によって遺伝子変異のタイプや有無を効率的に判別できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明によれば、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含む遺伝子変異の検出方法であって、
前記一本鎖環状DNAは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法が提供される。
前記キャプチャーポリヌクレオチドの位置に、変異を含む標的ポリヌクレオチドを配置する方法である、本発明の第一の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
（ii）前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含む
方法、が提供される。
前記キャプチャーポリヌクレオチドの位置に、変異を含む標的ポリヌクレオチドを配置する方法である、本発明の第二の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状DNAおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（ii）前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法
が提供される。
なお、前記オリゴヌクレオチドプライマー（第二の態様においては第１のオリゴヌクレオチドプライマー）は、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域の最も3’側の位置に有することが好ましい。
前記オリゴヌクレオチドの位置に、変異を含む標的miRNA（マイクロRNA）を配置する方法である、本発明の第三の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとmiRNAと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸、好ましくは検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む、方法が提供される。
前記オリゴヌクレオチドの位置に、変異を含む標的miRNA（マイクロRNA）を配置する方法である、本発明の第四の態様によれば、
遺伝子変異の検出方法であって、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってmiRNAとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含み、
前記第１の一本鎖環状DNAは、
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
miRNAの第１の領域に相補的な配列を含み
前記第２の一本鎖環状DNAは、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法
が提供される。
また、前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬であることが好ましく、グアニン四重鎖結合試薬は後述のThT誘導体であることが好ましい。
本発明の一態様によれば、標的ポリヌクレオチド配列が存在すると、一本鎖環状DNAとプライマーがハイブリダイズして、そこから、幾つものグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列が直列に繋がったDNA鎖が生成し、これをThT（誘導体）などの検出試薬で染色することにより、標的ポリヌクレオチド配列を特異的に検出できる。昇温・降温などの温度サイクルを必要するPCR法ではなく、一定温度で反応が進行するRCA法を用いるため、簡易検出法への応用が可能である。そして、標的ポリヌクレオチド配列における変異塩基とプライマーの塩基が一致しない場合は増幅がほとんど起こらないので、変異のタイプや有無の判別が可能であり、遺伝子診断等の用途に有用である。
本発明の第一の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。 本発明の第二の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。 実施例１（サンプルｂ２～ｂ７）の標的ポリヌクレオチド、第１の一本鎖環状DNA、および各種第１のプライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。 実施例１における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例２（サンプルａ２、ａ４、ｂ２、ｂ４、ｂ５、ｂ６）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。 実施例２における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例２における二重鎖DNAと一本鎖DNAをターゲットにした場合の蛍光スペクトルの違いを示す図。 実施例３（サンプルｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。 実施例３における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例４（サンプルｂ１、ｂ２、ｂ３、ｂ４、ｂ５）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体の構造を示す図。 実施例４における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例５（左はG636のSNPでプライマーP2、右はG681のSNPでプライマーP4）の標的ポリヌクレオチド、一本鎖環状DNA、および各種プライマーの複合体形成と、その伸長産物と第２の一本鎖環状DNA、および第２のプライマーの複合体形成を示す図。 実施例５における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 本発明の第三の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。 本発明の第四の態様にかかるポリヌクレオチド増幅方法の模式図。星印はSNP部位を示す。 実施例６（miR-21-CA）の標的ポリヌクレオチド（miRNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。 実施例６における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例７（miR-13（u））の標的ポリヌクレオチド（miRNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。 実施例７における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例８の標的ポリヌクレオチド（長鎖DNA）、一本鎖環状DNA、キャプチャーポリヌクレオチドおよびプライマーの複合体の構造を示す図。 実施例８(PCR増幅産物を用いた時)における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。 実施例８(抽出物を用いた時)における標的ポリヌクレオチド検出結果を示す図（写真）。
本発明によれば、
第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅された核酸、好ましくは増幅された核酸中に含まれる検出試薬結合配列を検出試薬によって検出する工程、
を含む遺伝子変異の検出方法であって、
前記一本鎖環状DNAは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
好ましくは検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含み、
前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法が提供される。
ここで、遺伝子変異としては、一塩基多型（SNP）、塩基欠失、塩基挿入などが挙げられる。
＜キャプチャーポリヌクレオチドを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合～第一の態様＞
本発明の第一の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドを用い、
（i）標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、
検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNAと、
（ii）標的ポリヌクレオチドの、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）検出試薬と、
を用いる。
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドは、SNPなどの遺伝子変異を含む配列であれば特に限定されず、DNAでもRNAでもよい。DNAは一本鎖DNAでもよいし、センス鎖とアンチセンス鎖（相補鎖）からなる二本鎖DNAでもよい。
標的ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムDNAやRNAにおいて、標的の遺伝子変異を含む領域を第２の領域と設定し、その５’側に隣接する領域を第１の領域と設定し、これらを含む配列を標的ポリヌクレオチドとして設定できる。そして、第１の領域と第２の領域の配列に基づいて、下記の一本鎖環状DNAとプライマーを設計することができる。
標的ポリヌクレオチドは生物種由来の試料から調製または単離されたものでもよい。そのような標的ポリヌクレオチドを含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物の個体そのもの、あるいはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調製したポリヌクレオチド含有調製物であってもよい。また、前記試料をさらに分画して、その一部を取り出したものから調製したRNA含有調製物であってもよい。試料は、標的となるポリヌクレオチドを含有していれば、ポリヌクレオチドが精製されていても、精製されていなくても用いることができる。
標的ポリヌクレオチドは一本鎖環状DNAおよびプライマーがハイブリダイズできるものであれば、長さも特に限定されない。ステムループ構造のループ部分に一本鎖環状DNAがハイブリダイズしやすいので、ステムループ構造を取るポリヌクレオチドが好ましい。
＜一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、好ましくは７～８塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む。
なお、標的ポリヌクレオチドが二本鎖DNAの場合、図８のｃ２、ｃ３、ｃ５に示すように、一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列の３’側に隣接して、該配列の３’末端側と相補的な配列をさらに含むことが好ましい。これにより、二本鎖DNAの相補鎖がハイブリダイズでき、より複合体が安定化される。
図１を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA１０は標的ポリヌクレオチド１１の第1の領域１１１に相補的な配列１０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列１０２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列１０３を含む。配列１０１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列１０２の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。
グアニン四重鎖形成配列としては、Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr; 10(4): 261-275.に記載されたような配列が挙げられ、Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3で表されるが、具体的には、配列番号２７～３２に記載の配列などが例示される。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列としては、Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3が例示される。すなわち、連続する３つのＣが、１～１０個（好ましくは１～５個）の任意の塩基（Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）からなる配列をスペーサーとして、４回繰り返される配列である。
22mer DNA（２２ＡＧ：5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' （配列番号２７）および
　　　　　 ２２Ｋｉｔ：5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（配列番号２８））、
26mer DNA（２６Ｔｅｌ：5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'（配列番号２９））、
27mer DNA（２７Ｍｙｃ：5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'（配列番号３０））、
20mer DNA（２０Ｓｒｃ：5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'（配列番号３１））、
18mer RNA（１８Ｒａｓ：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'（配列番号３２））。
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列はその前後、すなわち、プライマー結合配列１０２との間および標的ポリヌクレオチドの第1の領域に相補的な配列１０１との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA１０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。
なお、図１では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、例えば、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である。また、検出試薬結合配列にハイブリダイズする標識プローブを用いて検出することも可能である。
また、本発明の第一の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
一本鎖環状DNA１０は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。
＜オリゴヌクレオチドプライマー＞
プライマー１２は、標的ポリヌクレオチド１１の、第１の領域１１１の３’側に隣接したSNPなどの遺伝子変異（図１の星印）を含む第２の領域１１２に相補的な８～１５塩基の標的ポリヌクレオチド結合配列１２１と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNA１０のプライマー結合領域１０２に相補的な好ましくは７～８塩基の環状DNA結合配列１２２と、を含む。なお、プライマーは担体に固定化するなどして固相化されてもよい。これにより固相での検出も可能となる。固相化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固相化する方法などが挙げられる。
オリゴヌクレオチドプライマーにおいては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列１２１の最も３’側の位置に有することが好ましい。
例えば、標的ポリヌクレオチドの多型がA/Gの一塩基多型で、Aを検出しようとするときは、Aに対応するTが標的ポリヌクレオチド結合配列の３’末端の位置になるように、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが特に好ましい。
＜増幅方法＞
標的ポリヌクレオチド１１に一本鎖環状DNA１０およびプライマー１２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNAと標的ポリヌクレオチドとプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
RCA法はLizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998);米国特許第５，８５４，０３３号及び同第６，１４３，４９５号；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３などに記載されている。RCA法は、例えば、phi29 polymerase、Klenow DNA Polymerase (5'-3', 3'-5' exo minus) 、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社)、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることで行うことができる。
RCAによるＤＮＡの伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃～６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃～４２℃、より好ましくは約３０～３７℃で反応する。RCAによって、標的ポリヌクレオチド１１依存的に、プライマー１２から一本鎖環状DNA１０に沿ってグアニン四重鎖形成配列（配列１０３に対応）を含む核酸（増幅産物１３）が増幅される。増幅産物１３はグアニン四重鎖を含む配列１０４を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬１０５によって検出される。
標的ポリヌクレオチドにおけるSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するとき、すなわち、標的ポリヌクレオチドの変異塩基がプライマーに含まれる変異部位の塩基の相補塩基に該当するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプや遺伝子変異の有無が同定できる。
なお、上記第一及び第二の態様においては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に変異が含まれるように設計し、変異に対応する塩基を有するプライマーとのハイブリダイゼーションに基づく複合体の安定性に基づいてプライマーからの伸長反応を解析するが、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に変異が含まれるように設計し、変異に対応する塩基を有する一本鎖環状DNAとのハイブリダイゼーションに基づく複合体の安定性に基づいてプライマーからの伸長反応を解析する態様も本発明の方法に含まれる。
＜キャプチャーポリヌクレオチドを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合～第二の態様＞
本発明の第二の態様にかかる遺伝子変異検出方法は、
第１の領域と、その３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドを用い、
（i）標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第１のプライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む第１の一本鎖環状DNAと、
（ii）標的ポリヌクレオチドの、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAの第１のプライマー結合領域に相補的な配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２の一本鎖環状DNAと、
（iv））第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（v）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、とを用いる。
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドについては、第一の態様で説明したとおりである。
＜第１の一本鎖環状DNA＞
第１の一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、好ましくは７～８塩基のプライマー結合配列と、
第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
を含む。
なお、標的ポリヌクレオチドが二本鎖DNAの場合、図８のｃ２、ｃ３、ｃ５に示すように、第１の一本鎖環状DNAは、標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な１０～３０塩基の配列の３’側に隣接して、該配列の３’末端側と相補的な配列をさらに含むことが好ましい。これにより、二本鎖DNAの相補鎖がハイブリダイズでき、より複合体が安定化される。
図２を参照して説明する。
第１の一本鎖環状DNA２０は標的ポリヌクレオチド２１の第1の領域２１１に相補的な配列２０１と、
その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１の一本鎖環状DNA２０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA２０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
＜第１のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第１のオリゴヌクレオチドプライマー２２は、標的ポリヌクレオチド２１の、第１の領域２１１の３’側に隣接した遺伝子変異を含む第２の領域２１２に相補的な８～１５塩基の配列２２１と、その３’側に連結された、第１の一本鎖環状DNA２０のプライマー結合領域２０２に相補的な好ましくは７～８塩基の配列２２２と、を含む。
なお、第１のオリゴヌクレオチドプライマーにおいては、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列２２１の最も３’側の位置に有することが好ましい。
例えば、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異がA/Gの一塩基多型で、Aを検出しようとするときは、Aに対応するTが標的ポリヌクレオチド結合配列２２１の最も３’側の位置になるように、第１オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが好ましい。
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列２４２と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３と、
を含む。
配列２４１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA２４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
なお、図２では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。
また、本発明の第二の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、第2の一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、を含む。
＜増幅方法＞
図２に示されるように、まず、標的ポリヌクレオチド２１に第１の一本鎖環状DNA２０およびプライマー２２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的ポリヌクレオチド２１依存的に、プライマー２２から第１の一本鎖環状DNA２０に沿って第１増幅産物２３が増幅される。
増幅産物２３は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３に相補的な配列２３１を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２の一本鎖環状DNA２４は、第１の増幅産物２３の配列２３１に、配列２４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１の一本鎖環状DNA２０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列２０３の５’側に隣接した領域２０４と同一の配列２５１を有するので、第１の増幅産物２３の、第１の一本鎖環状DNA２０の領域２０４に相補的な領域２３２に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA２４の第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
この第１の増幅産物２３と、第２の一本鎖環状DNA２４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー２５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物２６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物２６はグアニン四重鎖を含む配列２６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬２６２によって検出される。第二の態様では、第１の増幅産物２３に含まれる領域２３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA２４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
そして、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプまたは遺伝子変異の有無が同定できる。
＜オリゴヌクレオチドプライマーを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合～第三の態様＞
本発明の第三の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAを標的ポリヌクレオチドとして用い、
（i）miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域とグアニン四重鎖などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む一本鎖環状DNAと、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と
miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含むキャプチャーポリヌクレオチドと、
（iii）検出試薬と、
を用いて反応を行う。
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドは、SNPなどの遺伝子変異を含むmiRNAである。miRNAは３’側に変異を有するもの、すなわち、第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むものを使用する。変異はmiRNAの３’末端または３’末端から１～３塩基以内の位置に存在することが好ましい。miRNAの長さは好ましくは１５～３０塩基であり、より好ましくは１５～２５塩基であり、さらに好ましくは１５～２３塩基である。
＜一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域とグアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列を含む。
図１４を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA３０は標的miRNA３２の第２の領域３２２に相補的な配列（miRNA結合領域）３０１と、その３’側に連結した第２の領域３０２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列３０３を含む。
配列３０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第２の領域３０２の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。
一本鎖環状DNA３０の、miRNA３２の第２の領域３２２に相補的なmiRNA結合領域３０１は、miRNAの変異（検出対象変異：図１４の星印）と相補的な塩基を含んでおり、miRNAの変異が検出対象と異なる場合はハイブリダイズしない。したがって、ハイブリダイズの有無により目的変異の有無の検出が可能である。
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列３０３はその前後、すなわち、第２の領域３０２との間およびmiRNA結合領域３０１との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA３０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。なお、グアニン四重鎖形成配列は他の検出試薬結合配列に置換され得る。また、本発明の第三の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
＜キャプチャーポリヌクレオチド＞
キャプチャーポリヌクレオチドは、一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列とmiRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む。
図１４において、キャプチャーポリヌクレオチド３１は、一本鎖環状DNA３０の第２の領域３０２に相補的な配列３１１と、miRNA３２の第１の領域３２１に相補的なmiRNA結合配列３１２を含み、配列３１１の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％であり、配列３１２の長さは通常、８～１５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。なお、非特異的増幅を起こさないために、キャプチャーポリヌクレオチドの３’末端はリン酸機などで修飾されていることが好ましい。
＜増幅方法＞
標的ポリヌクレオチド（miRNA）３２に一本鎖環状DNA３０およびキャプチャーポリヌクレオチド３１をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNAと標的ポリヌクレオチドとプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
RCAによって、標的ポリヌクレオチド（miRNA）３２から一本鎖環状DNA３０に沿って増幅産物３３が増幅される。増幅産物３３はグアニン四重鎖を含む配列３３１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬３４によって検出される。
標的ポリヌクレオチドにおけるmiRNAの変異のタイプが一本鎖環状DNAのmiRNA結合領域に設定した塩基のタイプと一致するとき、すなわち、標的ポリヌクレオチドの変異塩基が一本鎖環状DNAに含まれる変異部位の塩基の相補塩基に該当するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの変異のタイプが一本鎖環状DNAに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプや遺伝子変異の有無が同定できる。
＜オリゴヌクレオチドプライマーを変異を含む標的ポリヌクレオチドとする場合～第四の態様＞
本発明の第四の態様にかかる遺伝子変異の検出方法は、
第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAを標的ポリヌクレオチドとして用い、
（i）miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、を含む第１の一本鎖環状DNA、
（ii）一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な鋳型結合配列と、miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含むキャプチャーポリヌクレオチド、
（iii）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む第２の一本鎖環状DNA、
（iv）第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、とを用いる。
＜標的ポリヌクレオチド＞
標的ポリヌクレオチドとキャプチャーポリヌクレオチドについては、第三の態様で説明したとおりである。
＜第１の一本鎖環状DNA＞
一本鎖環状DNAは、miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列を含む。
miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域はmiRNAの変異部分に相補的な配列を含んでおり、ハイブリダイズの有無により変異の有無の検出が可能である。
図１５を参照し、例を挙げて説明する。なお、一本鎖環状DNAでは、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA４０は標的miRNA４２の第２の領域４２２に相補的な配列（miRNA結合領域）４０１と、その３’側に連結した第２の領域４０２と、第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３を含む。
配列４０１の長さは、好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列４０２の長さは通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。第１の一本鎖環状DNA４０全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第１の一本鎖環状DNA４０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
＜第２の一本鎖環状DNA＞
第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３と同一の配列４４１と、該配列の５’側に隣接した、第２のプライマー結合配列４４２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３と、を含む。
配列４４１の長さは、通常、１０～３０塩基であり、好ましくは１５～２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０～７０％である。配列４４２の長さは好ましくは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０～７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列４４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA４４全体の長さは、好ましくは３５～１００塩基である。第２の一本鎖環状DNA４４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
なお、図１５では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。また、上述したとおり、本発明の第四の態様においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いて増幅された核酸を検出することも可能であるため、第2の一本鎖環状DNAにおける検出試薬結合配列に相補的な配列の存在は必須ではない。
＜第２のオリゴヌクレオチドプライマー＞
第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１（好ましくは８～１５塩基の配列）と、該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２（好ましくは７～８塩基の配列）と、を含む。
＜増幅方法＞
図１５に示されるように、まず、標的ポリヌクレオチド（miRNA）４２に、キャプチャーオリゴヌクレオチド４１および第１の一本鎖環状DNA４０をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的ポリヌクレオチドに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的ポリヌクレオチド（miRNA）４２依存的に、第１の一本鎖環状DNA４０に沿って第１増幅産物４３が増幅される。
増幅産物４３は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３に相補的な配列４３１を含むため、この配列４０３と同一の配列４４１を含む第２の一本鎖環状DNA４４は、第１の増幅産物４３の配列４３１に、配列４４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNAの複合体に、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
すなわち、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、第１の一本鎖環状DNA４０の第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列４０３の５’側に隣接した領域４０４と同一の配列４５１を有するので、第１の増幅産物４３の、第１の一本鎖環状DNA４０の領域４０４に相補的な領域４３２に、配列４５１を介してハイブリダイズする。
また、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５は、配列４５１の３’側に、第２の一本鎖環状DNA４４の第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列４５２を有するので、第２の一本鎖環状DNA４４にも配列４５２を介してハイブリダイズする。
この第１の増幅産物４３と、第２の一本鎖環状DNA４４と、第２のオリゴヌクレオチドプライマー４５との三者複合体から、RCAにより、第２の増幅産物４６（伸長鎖）が増幅される。第２の増幅産物４６はグアニン四重鎖を含む配列４６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬４６２によって検出される。第四の態様では、第１の増幅産物４３に含まれる領域４３１のそれぞれに第２の一本鎖環状DNA４４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい向上が達せられる。
そして、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと一致するときは、増幅反応が起こり、検出試薬で検出されるが、標的ポリヌクレオチドの遺伝子変異のタイプがプライマーに設定した塩基のタイプと異なるときは増幅反応がほとんど起こらず、検出試薬で検出されない。
したがって、本発明の検出方法により、標的ポリヌクレオチドのSNPなどの遺伝子変異のタイプまたは遺伝子変異の有無が同定できる。
＜検出試薬＞
本発明の方法においては、配列非特異的にDNAに結合して蛍光を発するCyber Gold（商品名）などの核酸染色試薬を検出試薬として用いることもできるが、特異的かつ好感度に検出するためには、特定の核酸配列（検出試薬結合配列）に結合して発光又は発色する分子が好ましい。
上記の通り、検出試薬結合配列と検出試薬の組み合わせは任意に決定でき、アプタマー配列とアプタマー結合性発色分子の組み合わせ、分子ビーコン結合配列と分子ビーコンの組み合わせ、特異的配列とそれにハイブリダイズする標識プローブの組み合わせなどを用いてることもできるが、好ましくはグアニン四重鎖とグアニン四重鎖結合試薬の組み合わせである。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
［１］チオフラビンT（ThT）またはその誘導体
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［２］H-aggregate 『 Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［３］TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［４］ PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
［５］BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan,D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
［６］APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［７］チアゾールオレンジ（TO）
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V　.T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
好ましくは、以下の一般式（I）で示されるＴｈＴ誘導体が使用できる（Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084）。特開2016-079132。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
ここで、Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭素数１～１０（好ましくは１～５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（－ＮＲ2）（Ｒは独立して水素または炭素数１～５のアルキル基）、ニトロ基（－ＮＯ2）、シアノ基（－ＣＮ）、イソシアネート基（－ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（－ＯＨ）、アルデヒド基（－ＣＨＯ）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、メルカプト基（－ＳＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（－Ｏ－）、イミノ基（－ＮＨ－）、チオエーテル基（－Ｓ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、チオエステル基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｓ－）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１～５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１～３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１～５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。
ｎは０～５の整数を示し、より好ましくは０～３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。
具体的には以下のような化合物が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
検出は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、RCA産物を含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
DNAプライマー(2)は、DNAプライマー(1)の7塩基目のG(7G)をTに変えた配列
DNAプライマー(3)は、DNAプライマー(1)の8塩基目のG(8G)をTに変えた配列
DNAプライマー(4)は、DNAプライマー(1)の9塩基目のC(9C)をAに変えた配列
DNAプライマー(5)は、DNAプライマー(1)の10塩基目のC(10C)をAに変えた配列
DNAプライマー(6)は、DNAプライマー(1)の11塩基目のA(11A)をTに変えた配列
DNAテンプレート(1)～(9)は、環状化してある。
ターゲットRNA(2)は、ターゲットRNA(1)の30塩基目のU(30U)をAに変えた配列
ターゲットDNA(2)は、ターゲットDNA(1)の30塩基目のT(30T)をAに変えた配列
Complementary DNAは、ターゲットDNA(1)と相補的な配列
[1] DNAテンプレートの環化
(1) 5μMの1本鎖DNA(Cid Pre T：67mer, Cid Mai T：62mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Beatine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigase　(Epicentre Technologies, WI, USA)を10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で24時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。
[2] 反応溶液の調製
[実施例1]プライマーの1塩基ミスマッチ
a1～a7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)～(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase（New England Biolabs） 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
b1～b7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)～(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲットRNA(1) 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
c1～c7の調製（表２）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのDNAプライマー(1)～(6)のいずれか(表２参照) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM noターゲットRNA 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
[実施例2]ターゲットのDNA/RNAの違いと1塩基ミスマッチ
a1～a6の調製（表３）
100nMのDNAテンプレート(1) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7)2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水または10nMのRNA 2μL (表３参照)、水2μLを混合した(計20μL)。
b1～b6およびa2, b1, b2, b4-b6の調製（表３、４）
100nMのDNAテンプレート(1) 10μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 10μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 10μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 10μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー 10μL、10×添付BSA溶液 10μL、10mMのdNTPs 10μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 10μL(最終濃度0.1U/μL)、水または10nMのDNA 10μL (表３、４参照)、水10μLを混合した(計100μL)。
なお、b5とb6の二重鎖DNAは事前にDenatureとAnnealingを行って二重鎖を形成した物を使用している。
[実施例3]ターゲットが二重鎖DNAにおける環状テンプレートの最適化
a1～a5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
b1～b5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMターゲットDNA(1)(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)
c1～c5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM二重鎖DNA(ターゲットDNA(1)とComplementary DNA) 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)
d1～d5の調製（表５）
100nMのDNAテンプレート(1)、(3)、(4)または(5)のいずれか(表５参照) 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート(2) 2μL(最終濃度40nM)、120nMのDNAプライマー(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー(7) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nM Complementary DNA (最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
[実施例4]3者複合体のプライマーの最適化
a1～a5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)～(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)～(11)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。
b1～b5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)～(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)～(10)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、800nMターゲットRNA(1) 2μL(最終濃度80nM)、水6μLを混合した(計20μL)。
c1～c5の調製（表７）
400nMのDNAテンプレート(6)～(9)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度40nM)、480nMのDNAプライマー(1)、(8)～(10)のいずれか(表７参照) 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、800nM no target RNA 2μL(最終濃度80nM)、水6μLを混合した(計20μL)。
[3] 反応
上記で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。
[4]　検出
視覚的検出
各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。
・混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE　特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
蛍光分光光度計による測定
・4.の反応液50μLに5×PBS153NMバッファーを20μL、水30μLを加えた。
・混合溶液100μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を20μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・蛍光分光光度計で励起波長412nm, 測定波長430nm-650nmの条件で溶液の蛍光強度を測定した。
結果
[実施例1]プライマーの1塩基ミスマッチ
表２の各反応組成にて、DNAプライマー(1)とターゲットRNA(1)がハイブリダイゼーションする箇所を1塩基ずつミスマッチとなるように（図３）して、反応進行の変化を検証した。
結果は、図４に示すように、DNAプライマー(1)、ターゲットRNA(1)、テンプレートDNA(1)の三者複合体の根元に近づくにつれ顕著に反応の進行が妨げられることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
[実施例2]ターゲットのDNA/RNAの違いと1塩基ミスマッチ
表３の各反応組成にて、ターゲットRNA(1)に三者複合体の根元部分の箇所にミスマッチ(30U→A)に変異させたターゲットを用いて反応の進行を検証した（図５）。また、ターゲットがDNAの場合でも本法で検出できるか検証した。
結果は、ターゲットRNAにミスマッチがある場合(図６ a4)、顕著に反応の進行が阻害されていることが分かった。
また、ターゲットがDNAになった場合でも図６のb3を見ると検出可能であることが分かった。ターゲットRNAで行ったように1塩基ミスマッチがあるターゲットDNA(図６ b4)では、RNA同様に顕著に反応の進行が阻害されることが分かった。一般に体内でDNAは2重鎖で存在することが多い。そのため、ターゲットDNAと相補的な配列を持つComplementary DNAとの二重鎖をターゲットとした場合でも検出可能か検証した(図６ b5)。結果は、1本鎖のDNAと比べて蛍光強度は弱いが、ターゲットではないDNA(図６ b3)または、ターゲットDNA(2)の1塩基ミスマッチ(図６ b4)に比べて明らかに発光しており、十分検出可能な範囲であることが示唆される。一方で、ターゲットDNA(2)の1塩基ミスマッチとComplementary DNAとの二重鎖をターゲットとした場合(図６ b6)では、反応の進行が阻害されていることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
表４の各反応組成にて、二重鎖DNAを標的にした際の蛍光と1本鎖DNAを標的とした場合と比較し、同じ性質のものであるか蛍光分光光度計を用いて検討した(図７)。
結果は、蛍光スペクトルのピークトップはほぼ同じ波長であり、また、反応が進行することで蛍光強度が増大されているので、同様の性質を持つことが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
[実施例3]ターゲットが二重鎖DNAにおける環状テンプレートの最適化
二重鎖DNAをターゲットとする場合二重鎖を解離して三者複合体を形成する必要がある。ターゲットDNAとDNAテンプレートの結合を促進するためにDNAテンプレートにターゲットDNAと相補的な配列(表5：Complementary DNA)とハイブリダイゼーションする配列をDNAテンプレート(1)に3塩基ずつ増やしていった(図８)。
これを用いて表５の各反応組成にて反応を行ったところ、図９に示すように、ssDNA(ターゲットDNA(1))では、挿入数が多くなるにつれて反応の進行が妨げられていることが分かった。これは、Complementary DNAが存在しない場合、DNAテンプレート内でステムを組みやすくなりテンプレートとターゲットの結合が阻害されるためと考えられる。
一方で、dsDNAにおいては、挿入数が多くなるごとに反応の進行が促進されていることが分かった。このことから、ターゲットがdsDNAにおいてテンプレート内にComplementary DNAと相補的な配列を適切な数を入れることで反応が促進される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
[実施例4]三者複合体のプライマーの最適化
これまでに、DNAプライマーが17mer(DNAプライマー(8))のときは、反応が進行しないことが分かっていた。二重鎖DNAの安定はDNAの長さとその配列に依存する。そこで反応が進行するDNAプライマー(1)(18mer)と反応が進行しないDNAプライマー(8)の中間の安定さを配列を変化させることでDNAプライマーの最適化を行った。
今回は、DNAプライマー(1)をベースに3′末端2残基を変化させた。二重鎖の安定性は、Nearestneighbor thermodynamicsによるとDNAプライマー(1)>(11)>(10)>(9)>(8)の順に安定である(表6)。
表７の各反応組成にて反応を行ったところ（図１０）、結果は図１１に示すように、DNAプライマー(9)では、反応が進行しなかったが(10),(11)では反応が進行した。反応が進行するか否かの境界はDNAプライマー(9)と(10)の間であることが分かった。よって、プライマーとテンプレート二重鎖のΔG0 37は-3.8未満が好ましいと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
[実施例5] 長鎖DNAの1塩基多型検出
　長鎖DNA中の1塩基多型(SNPs)を検出するために以下の実験を行った。図１２に反応スキームを示す。SNPを含む標的配列として、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636位のSNPまたは681位のSNPを含む部位を含む1kbp(変異箇所前後500bp)の配列をヒト培養細胞(HepG2)ゲノムサンプルからPCR増幅したものを用いた。
　以下の試薬を調製し、図13 (A)及び(C)では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G636)の変異(GがAに変異)を、図13(B)及び(D)では、CYP2C19遺伝子の681塩基(G681)の変異(GがAに変異)を検出するために、上記の標的配列を加えて37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE　特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
図13 (A) a1～a5の調製
100nMのDNAテンプレート T2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (A) b1～b5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (B) a1～a5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (B) b1～b5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (C) a1～a5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (C) b1～b5の調製
100nMのDNAテンプレートT2 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (D) a1～a5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図13 (D) b1～b5の調製
100nMのDNAテンプレートT3 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer P5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40merまたはHepG2遺伝子から増幅した2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
[3]長鎖DNAの1塩基多型検出
　最適化条件の検討では、40merの1本鎖及び2本鎖のDNAをターゲットした。CYP2C19遺伝子の636塩基の1本鎖及び2本鎖の野生型(図13 (A) a2, a3)及び変異(図13 (A) b4, b5)を見分けることができた。また、CYP2C19遺伝子の681塩基の野生型(図13 (B) a2, a3)及び変異(図13 (B) b4, b5)を見分けることができた。
　ヒト培養細胞(HepG2)ゲノムサンプルは、1kbp(変異箇所前後500bp)をPCRで増幅したものを用いた。結果は、G636では野生型(図13(C) a4)、G681でも野生型(図13(D) a4)を確認した。このことから、ターゲットが、1kbpの長鎖2重鎖DNAであった場合でも変異を確認することができる。
[実施例６] 異なる鎖長の変異miRNAの検出
　miRNAの３’末端への2塩基の付加を検出するために以下の実験を行った。図１６に反応スキームを示す。表９のmiR-21CAはmiR-21の３’末端にCAの2塩基が付加されている。
　この変異を検出するために、以下の試薬を調製し、37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE　特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
図17 a1～a2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
図17 b1～b2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-21 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図17 c1～c2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe (1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-21CA 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図17 d1～d2の調製
100nMのDNAテンプレートT4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(1) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-221 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
[実施例７] 一塩基置換変異miRNAの検出
　miRNAの一塩基置換を検出するために以下の実験を行った。図１８に反応スキームを示す。表９のmiR-13aとmiR-13bは互いにc/uの一塩基置換を有する。
　この変異を検出するために、以下の試薬を調製し、37℃で2時間インキュベートさせて伸長反応を行った。各反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファー（50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4）を2μL加えた。混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体（THT-HE　特開2016-079132）溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
図19 a1～a2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計20μL)。
図19 b1～b2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-13a 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図19 c1～c2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-13b 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図19 d1～d2の調製
100nMのDNAテンプレートT5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレートT1 2μL(最終濃度40nM)、水または120nMのCapture Probe(2) 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマーP6 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、10nMのmiR-221 2μL(最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
＜結果＞
[1]異なる鎖長の変異miRNAの検出（実施例６）
本方法はmiRNAの鎖長の異なる変異を検出法である。テンプレートの設計では、ターゲットRNAとテンプレートのハイブリダイズ部分の熱力学を考慮して作製する。これまでの研究でハイブリダイズ部分の-ΔG°が4.2kcal/molを超過した場合、反応が進行することが分かっている。これを考慮し、変異体であるmiR-21CAの場合は-ΔG°が5.7kcal/molで変異がないmiR-21では-ΔG°が2.7kcal/molと設計した(図16)。
実際の実験結果は、ターゲットがmiR-21CAだった場合、反応は進行してし(図17 c2)、miR-21では、反応の進行は見られなかった(図17 b2)。
また、capture probeなしの場合(図17 a1, b1, c1, d1)や違うターゲットの場合(図17 d2)でも反応の進行は確認できなかった。
[2]1塩基変異miRNAの検出（実施例７）
　本方法は、miRNAの1塩基違いを検出する方法である。テンプレートの設計では、テンプレートとターゲットであるmiR-13bが相補的になるようにして、また、熱力学安定性を考慮して設計した(図18)。
　実験結果は、miR-13aの場合は(図19 b2)、テンプレートとミスマッチとなり反応は進行しなかった。一方で、miR-13bでは(図19 c2)、完全に相補的になるため反応が進行した。
　また、capture probeなしの場合(図19 a1, b1, c1, d1)や違うターゲットの場合(図19 d2)でも反応の進行は確認できなかった。
[実施例８] 長鎖DNAの1塩基多型検出
長鎖DNA中の1塩基多型検出のために、図２０に示すような反応を行い、長鎖DNAに含まれる多型Ｇ６３６とＧ６８１の検出を行った。
1．溶液の調製
 [1]長鎖DNAの1塩基多型検出 (PCR増幅サンプルを用いた時)
図21 (A) a1～a9の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図21 (A) b1～b9の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図21 (B) a1～a9の調製
100nMのDNAテンプレート t5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p4 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図21 (B) b1～b9の調製
100nMのDNAテンプレート t5 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p5 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
 [2] 長鎖DNAの1塩基多型検出(抽出物を用いた時)
 (1)細胞抽出液(全DNA)の作製
口腔粘膜を綿棒でこすり取り、ISOHAIR EASY(ニッポンジーン製)150μLに懸濁させた。添付書のプロトコルに従い処理した。その後、スピンカラム(遠心式限外ろ過フィルターユニット)を用いて20mM Tris-HCl pH7.4に置換した。
 (2) 検出サンプルの調製
図22 (A) a1～a3の調製
100nMのDNAテンプレート t4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p2 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
図22 (A) b1～b3の調製
100nMのDNAテンプレート p4 2μL(最終濃度10nM)、400nMのDNAテンプレート t2 2μL(最終濃度40nM)、120nMのPrimer p3 2μL(最終濃度12nM)、480nMのDNAプライマー p1 2μL(最終濃度48nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水又は10nM targetDNA 2μL (40mer、2本鎖DNAはあらかじめアニーリングをおこなった 最終濃度1nM)、水2μLを混合した(計20μL)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
2本鎖DNAはそれぞれ相補鎖をアニーリングした物を使用した
G636及びG681を含んだ1kbp長鎖DNAはヒト口腔粘膜の遺伝子をPCRにより増幅したサンプルを使用した
用いた試薬
ThT(チオフラビンT)誘導体 
5×PBS153NM
50 mM HPO4 2-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO4 2-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4
ISOHAIR EASY (ニッポンジーン製)
2．ポリメラーゼ反応
・1．で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。
3．視覚的検出
・2.の反応溶液 8μLに5×PBS153NMバッファーを2μL加えた。
・混合溶液10μLと蛍光色素(1×PBS153NMバッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度(5μM))を2μL混合させて25℃で30分インキュベートさせた。
・調製した溶液に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。
結果
[1]長鎖DNAの1塩基多型検出(PCR増幅サンプルを用いた時)
　本方法は、ゲノム中の1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図21 (A)では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G681, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出し、図21(B)ではCYP2C19遺伝子の681塩基(G636, Genotype#2)の変異(GがAに変異)を検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
　ヒト口腔粘膜細胞ゲノムサンプルは、1kbp(変異箇所前後500bp)をPCRで増幅したものを用いた。対象者は6名である。結果は、G636ではEにヘテロ(野生型と変異型の混合)を確認し、G681ではFにヘテロを確認した。
このことから、ターゲットが、1kbpの長鎖2重鎖DNAであった場合でも変異を確認することができる。
 [2] 長鎖DNAの1塩基多型検出(抽出物を用いた時)
　本方法は、細胞抽出液(全ゲノム中)から1塩基多型(SNPs)を検出する方法である。図22では、シトクロムP450をコードするCYP2C19遺伝子の636塩基(G681, Genotype#3)の変異(GがAに変異)を検出する。Primerはそれぞれの野生型、変異型に対応したものを使用している。(図20)
　結果は、全ゲノムを用いた場合でも1塩基を見分けることができた(図22)。
１０・・・一本鎖環状DNA、１１・・・標的ポリヌクレオチド、１２・・・オリゴヌクレオチドプライマー、１３・・・増幅産物（伸長産物）、１０１・・・第１の領域に相補的な配列、１０２・・・プライマー結合配列、１０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、１０４・・・グアニン四重鎖を含む配列、１０５・・・グアニン四重鎖検出試薬、１１１・・・第１の領域、１１２・・・第２の領域、１２１・・・第２の領域に相補的な配列、１２２・・・プライマー結合領域に相補的な配列
２０・・・一本鎖環状DNA、２１・・・標的ポリヌクレオチド、２２・・・第１のオリゴヌクレオチドプライマー、２３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、２４・・・第２の一本鎖環状DNA、２５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、２０１・・・第１の領域に相補的な配列、２０２・・・第１のプライマー結合配列、２０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した領域、２１１・・・第１の領域、２１２・・・第２の領域、２２１・・・第２の領域に相補的な配列、２２２・・・第１のプライマー結合領域に相補的な配列、２３１・・・２０３の相補領域、２３２・・・領域２０４に相補的な領域、２４１・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列２０３と同一の配列、２４２・・・第２のプライマー結合配列、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２５１・・・領域２０４と同一の配列、２５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列２４２に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬
３０・・・一本鎖環状DNA、３１・・・キャプチャーポリヌクレオチド、３２・・・miRNA、３３・・・増幅産物（伸長産物）、３４・・・グアニン四重鎖検出試薬、３０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、３０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、３０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、３１１・・・一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列、３１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、３２１・・・miRNAの第１の領域、３２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、３３１・・・グアニン四重鎖形成配列
４０・・・一本鎖環状DNA、４１・・・キャプチャーポリヌクレオチド、４２・・・miRNA、４３・・・第１の増幅産物（伸長産物）、４４・・・第２の一本鎖環状DNA、４５・・・第２のオリゴヌクレオチドプライマー、４６・・・第２の増幅産物（伸長産物）、４７・・・グアニン四重鎖検出試薬、４０１・・・miRNAの第２の領域に相補的な配列、４０２・・・一本鎖環状DNAの第２の領域、４０３・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列、４０４・・・４０３の５’側に隣接した領域、４１１・・・一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列、４１２・・・miRNAの第１の領域に相補的な配列、４２１・・・miRNAの第１の領域、４２２・・・miRNAの変異を含む第２の領域、４３１・・・４０３の相補領域、４３２・・・領域４０４に相補的な領域、４３３・・・配列４０３に相補的な配列、４４１・・・第２の一本鎖環状DNA結合配列相補配列４０３と同一の配列、４４２・・・第２のプライマー結合配列、４４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、４５１・・・領域４０４と同一の配列、４５２・・・第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列４４２に相補的な配列、４６１・・・グアニン四重鎖形成配列

Claims (15)

  1. 第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した第２の領域を含むキャプチャーポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
    増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
    を含む遺伝子変異の検出方法であって、
    前記一本鎖環状DNAは、
    前記キャプチャーポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
    該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、を含み、
    前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
    前記キャプチャーポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、
    該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、を含み、
    前記キャプチャーポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマーは変異を含み、変異特異的にキャプチャーポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAとがハイブリダイズし、三者複合体を形成したときに核酸増幅反応が起こり、検出試薬によって検出される、方法。
  2. 遺伝子変異の検出方法であって、
    第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、一本鎖環状DNAおよびプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドとプライマーと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および
    増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
    を含み、
    前記一本鎖環状DNAは、
    前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
    該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、を含み、
    前記オリゴヌクレオチドプライマーは、
    前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な配列を有する領域と、該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
    を含む方法。
  3. 前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１または２に記載の遺伝子変異の検出方法。
  4. 遺伝子変異の検出方法であって、
    第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含む標的ポリヌクレオチドに、第１の一本鎖環状DNAおよび第１のプライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的ポリヌクレオチドと第１のプライマーと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
    増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
    を含み、
    前記第１の一本鎖環状DNAは、
    前記標的ポリヌクレオチドの第１の領域に相補的な配列と、
    該配列の５’側に隣接した、プライマー結合配列と、第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と、
    を含み、
    前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、
    前記標的ポリヌクレオチド第２の領域に相補的な配列を有する領域と、
    該配列の３’側に隣接した、第１の一本鎖環状DNAのプライマー結合配列に相補的な配列を有する領域と、
    を含み
    前記第２の一本鎖環状DNAは、
    第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列に相補的な配列と同一の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、を含み、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
    第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法。
  5. 前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項４に記載の遺伝子変異の検出方法。
  6. 前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、請求項２に記載の遺伝子変異の検出方法。
  7. 前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの第２の領域に存在する変異塩基とハイブリダイズする塩基を、前記標的ポリヌクレオチドの第２の領域に相補的な８～１５塩基の配列を有する領域の最も３’側の位置に有する、請求項４に記載の遺伝子変異の検出方法。
  8. 遺伝子変異の検出方法であって、
    第１の領域と、その３’側の変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってキャプチャーポリヌクレオチドとmiRNAと一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、を含み、前記一本鎖環状DNAは、
    miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
    を含み、
    前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
    一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
    miRNAの第１の領域に相補的なmiRNA結合配列を含む、方法。
  9. 前記一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項８に記載の遺伝子変異の検出方法。
  10. 遺伝子変異の検出方法であって、
    第１の領域と、第１の領域の３’側に隣接した変異を含む第２の領域を含むmiRNAに、第１の一本鎖環状DNAおよびキャプチャーポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によってmiRNAとキャプチャーポリヌクレオチドと第１の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程、当該核酸増幅反応によって生じた伸長鎖に第２の一本鎖環状DNAと第２のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせて当該伸長鎖と第２のプライマーと第２の一本鎖環状DNAの複合体形成に基づく核酸増幅反応を行う工程および
    増幅された核酸を検出試薬によって検出する工程、
    を含み、
    前記第１の一本鎖環状DNAは、
    miRNAの第２の領域に相補的なmiRNA結合領域とその３’側の第２の領域と、
    第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と、
    を含み、
    前記キャプチャーポリヌクレオチドは、
    一本鎖環状DNAの第２の領域に相補的な配列と
    miRNAの第１の領域に相補的な配列を含み
    前記第２の一本鎖環状DNAは、
    第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列と同一の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第２のプライマー結合配列と、を含み、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、
    第１の一本鎖環状DNAの第２の一本鎖環状DNA結合配列の相補配列の５’側に隣接した領域と同一の配列と、
    該配列の３’側に隣接した、第２の一本鎖環状DNAの第２のプライマー結合配列に相補的な配列とを含む、方法。
  11. 前記第２の一本鎖環状DNAはさらに検出試薬結合配列に相補的な配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子変異の検出方法。
  12. 前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項３，５，９または１１に記載の遺伝子変異の検出方法。
  13. グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子変異の検出方法。
  14. グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項１２または１３に記載の遺伝子変異の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
    Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１～５の炭化水素基を示し、
    nは０～５の整数を示し、
    ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
  15. 遺伝子変異が一塩基多型である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の遺伝子変異の検出方法。
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