CN117925875A - 一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，属于生物工程技术领域。通过包括环形探针、引物、分子信标探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、硫磺素T和dNTP混合溶液等组分的试剂盒设置，能在检测生殖支原体感染的同时，明确是否存在耐药突变，这不仅能辅助临床医生及时诊断和病情监测，而且又能指导合理用药，避免抗生素的滥用，为病人的及时、有效的个体化治疗提供理论参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，尤其涉及一种基于双重荧光信号介导的均相等温扩增技术，同时实现生殖支原体感染和耐药基因位点突变检测的试剂盒，属于生物工程技术领域。
背景技术
生殖支原体（Mycoplasma genitalium，MG）是一种没有细胞壁、能自行复制的最小原核细胞微生物。作为重要的性传播病原体，生殖支原体在女性人群中除能引起输卵管炎、子宫内膜炎、宫颈炎、盆腔炎等常见妇科疾病外，还可能引发不孕、早产、自发性流产、胎膜早破、胎儿宫内发育迟缓，甚至胎死宫内等一系列不良后果。有学者指出：生殖支原体感染会对输卵管产生不可逆转的永久损害。在他们进行的一项临床研究中发现，输卵管性不孕症患者中生殖支原体的感染率达33%。生殖支原体感染在男性人群可引起非淋菌性尿道炎、附睾炎，尤其在感染生殖器官后会导致精子质量及活动能力下降，从而引起少精子症、无精子症、继发性不育等。据统计，生殖支原体在性活跃人群中的感染率最高可达50%。因此，对生殖支原体感染的早期诊断和治疗与个体生殖健康息息相关。
传统的生殖支原体检测方法主要包括：分离培养法、免疫法和分子生物学方法。分离培养法是支原体检测的金标准，但因其在培养基上生长极为缓慢（培养周期>6个月）、培养条件苛刻、培养阳性率低、难以进行药敏实验等缺点，限制了通过微生物培养的方法实现对生殖支原体的检测。此外，由于支原体种属间易出现交叉反应、干扰因素多、对抗原和抗体纯度要求高等缺点，因此基于血清学的免疫检测策略也受到限制。目前，基于分子生物学的生殖支原体检测方法主要是以病原体的特异性DNA或rRNA作为检测靶标，利用聚合酶链式反应、等温扩增技术、高分辨融解曲线等常用的扩增检测技术，来确定检测样本中是否存在生殖支原体感染，如：上海仁度公司利用实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneousamplification and testing，SAT）来实现对生殖支原体-rRNA的高灵敏检测。相较于DNA检测而言，rRNA检测具有更高灵敏度和更显著临床指导意义。这主要归因于：一、病原体的DNA遗传信息通常只有一至几拷贝，而rRNA则高达104倍，极大提高了采样效率和检测灵敏度；二、RNA检测更有利于疗效监测，其在病原体死亡后2-3天即完全降解，与临床相关性好，等同于微生物培养结果，因此，可以直接诊断活动性感染。
但无论是针对病原体本身的遗传物质DNA还是转录产物rRNA，现有的检测技术仅能明确有无生殖支原体感染，临床再进一步根据推荐的用药指南进行抗生素的经验性治疗。
在经验性治疗涉及的抗生素中，大环内酯类抗生素是支原体感染的一线治疗药物，然而，近年来随着抗生素用药场景的日益广泛和用药剂量的逐渐加大，该类抗生素的耐药问题愈加严重（耐药率常常高达47～58%），以大环内酯类抗生素作为一线治疗药物的治愈率显著下降。针对大环内酯类抗生素最常见的5种生殖支原体耐药突变类型分别是：A2058G，A2059G，A2058T，A2058C，A2059C。研究发现，大环内酯类抗生素治疗失败主要归因于MG核糖体上的23S rRNA基因突变。23S rRNA基因区域V58位的2058和2059位碱基突变可以导致核糖体结构改变，从而阻止大环内酯类抗生素与之结合。
生殖支原体高耐药率的发生表明，继续以往经验性抗生素的治疗不再是有效控制感染的明智之举，精准诊断辅以靶向基因精准用药的个体化治疗方案才是现阶段治疗感染的可靠手段。在诊断感染的同时又能明确是否存在耐药突变无疑是医生和患者最迫切希望的。但是调查和统计表明，目前，临床鲜有能同时实现生殖支原体感染及耐药基因突变的检测方法。在明确生殖支原体感染后再进行耐药突变的检测无疑会增加检测时长，从而延误病人的诊断和治疗。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提出了一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒。在本技术方案中，结合滚环扩增（Rolling circleamplification，RCA）技术的高扩增性能和染料法、分子信标法的双重荧光信号检测策略，构建了一种能在同一反应体系中、同时检测有无生殖支原体感染和是否存在耐药基因位点突变的试剂盒。其中，具体涉及的判断原理包括：
一、当生物样本中存在未发生耐药突变的生殖支原体 rRNA时，以靶标（生殖支原体-rRNA）为模板，环形探针（Circle probe，CP）在T4 DNA连接酶作用下，其5’端和3’端相互靠近，且连接成环。环形探针、引物（Primer，P）、生殖支原体-rRNA三者可通过碱基互补配对形成稳定的“三交联”结构，稳定结合的引物在phi29 DNA聚合酶作用下，以环形探针为模板聚合延伸形成富含鸟嘌呤和与分子信标探针（Molecular beacon，MB）序列互补的交叉串联重复单链DNA产物，且随着聚合反应的进行，生殖支原体-rRNA从环形探针上被替换下来，参与到后续环形探针的成环和扩增过程中，因此，可实现靶标的重复利用。而在交叉串联重复的单链DNA产物上，富含鸟嘌呤的片段能与硫磺素 T（Thioflavin T，ThT）发生结构特异性识别，形成DNA G4-硫磺素T复合物，在FAM荧光通道即可检测到荧光信号；与分子信标探针序列互补的产物片段则与分子信标探针互补杂交，使其发生构型改变，Cy5荧光通道信号得以恢复。故，此时可同时检测到DNA G4-硫磺素T复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号；
二、当生物样本无生殖支原体感染时，环形探针和引物二者不能形成稳定的杂交结构，滚环扩增反应无法进行，因此，检测不到任何信号；
三、当生物样本中存在发生了耐药突变的生殖支原体-rRNA时，虽然环形探针、引物、靶标三者可形成相对稳定的“三交联”结构，但是靶标突变位点的存在阻碍了环形探针在T4 DNA连接酶作用下的连接成环。因此，只有引物不断聚合延伸产生大量富含鸟嘌呤的重复DNA片段，并未启动完整滚环扩增的有序进行，此时，只能检测到来源于DNA G4-硫磺素T复合物的单一荧光信号。
为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
本技术方案提出：一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，包括环形探针、引物、分子信标探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、硫磺素T和dNTP混合溶液；
其中，环形探针序列包括与分子信标探针互补的区Ⅰ、与生殖支原体靶标互补的区Ⅱ、富含胞嘧啶的区Ⅲ、与引物互补的区Ⅳ、与分子信标探针互补的区Ⅴ和与生殖支原体靶标互补的区Ⅵ，区Ⅰ、区Ⅱ、与区Ⅲ、区Ⅳ、区Ⅴ和区Ⅵ在环形探针序列上以5’端到3’端依次排列；以及，环形探针序列的3’端标记有羟基基团，5’端标记有磷酸基团。此处，“富含”是指本领域常规术语中的“富含”，其无法量化，而表示泛指；
引物序列：3’端与环形探针互补杂交，5’端与靶标互补；
分子信标探针：茎环部分序列与靶标一致，两侧臂一端标记荧光基团Cy5，两臂另一端标记淬灭基团BHQ2，且分子信标探针两侧臂区域各包含6个碱基，各碱基之间相互互补配对。
所述试剂盒检测标准为：
若检测为无荧光信号，呈阴性，则样本中无生殖支原体感染；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物的单一荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体存在耐药基因的位点突变；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体不存在耐药基因的位点突变。
进一步的，所述环形探针序列如SEQ ID NO .1所示；
其中，SEQ ID NO .1：
5’-TCCGTCCCGTTGCGCCCATCTGAATCCCACCCTCCCACCCATCATCGCTTGGGTCTT-3’。
进一步的，所述引物序列如SEQ ID NO .2所示；
其中，SEQ ID NO .2：为：5’-TACACATTCGATGA-3’。
进一步的，所述分子信标探针序列如SEQ ID NO .3所示；
其中，SEQ ID NO .3：5’- CGATGCATCGCTTGGGTCTTTCCGTCGCATCG-3’。
在本技术方案中，涉及的试剂盒为定性检测试剂盒，其中，采用的仪器主要包括实时荧光PCR仪。对于本试剂盒的检测标准，涉及的荧光信号来源有两个：其一、是DNA G4-硫磺素T复合物。硫磺素 T是一种水溶性荧光染料分子，它能特异性识别富含鸟嘌呤碱基的DNA 或 RNA链，并诱导其折叠形成G-四联体-硫磺素T复合物，使原本聚集态的硫磺素T分散形成单分子状态以恢复荧光信号。因其与G-四联体结合时的高特异性和强荧光响应（>700倍）而引起越来越多的关注。硫磺素T的激发波长为440nm，发射波长490nm，呈现绿色荧光信号，通过实时荧光PCR仪的FAM通道即可采集到特异性荧光信号；其二、是分子信标-分子信标互补链复合物。标记在分子信标探针上的荧光基团Cy5，呈现红色荧光信号，因此，通过分子信标探针的构型调节、利用实时荧光PCR仪的Cy5通道，即可采集到目标信号。
采用本技术方案，带来的有益技术效果为：
一、本发明通过在检测生殖支原体感染的同时，可明确是否存在针对大环内酯类抗生素耐药的关键位点突变，这不仅能辅助临床医生及时诊断和病情监测，而且又能指导合理用药，避免抗生素的滥用，为病人及时、有效的个体化治疗提供理论参考。同时，为整合多学科、多技术发展简单实用、性能优良、普适性好的病原体核酸快速检测方法提供新思路；
二、采用本发明中的检测试剂盒，能实现在1.5小时内完成对同一份待检测样本同时进行生殖支原体感染及耐药基因位点突变的检测，可显著缩短生殖支原体感染的诊断周期，且能指导临床精准用药；
三、本发明克服了传统微生物方法难培养、耐药难诊断的实际缺陷和现有分子生物学手段对实验环境和仪器设备要求高、检测通量小等客观问题，为同时实现生殖支原体感染及耐药基因突变特异、高效分子诊断提供了有力技术支持。
附图说明
图1为本发明涉及的原理示意图（A代表样本A感染未发生耐药突变的生殖支原体所涉及的扩增原理和信号检测曲线；B代表样本B感染已发生耐药突变的生殖支原体所涉及的扩增原理和信号检测曲线；C代表样本C未感染生殖支原体，以及，无对应的检测信号）；
图2为本发明实施例3中样本A的检测结果（感染未发生耐药突变的生殖支原体）；
图3为本发明实施例3中样本B的检测结果（感染已发生耐药突变的生殖支原体）；
图4为本发明实施例3中样本C的检测结果（未感染生殖支原体）。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在如下实施例中，所采用的样本来自四川大学华西第二医院医学检验科。其中，涉及的仪器包括实时荧光PCR仪，涉及的试剂有：phi29 DNA聚合酶（10 U/μL）和T4 DNA连接酶（5 U/μL），均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
硫磺素T和dNTP混合溶液（10 mM），均购自上海生工生物技术有限公司。
实施例1
本实施例提出：一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，包括环形探针、引物、分子信标探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、硫磺素T和dNTP混合溶液；
其中，环形探针序列包括与分子信标探针互补的区Ⅰ、与生殖支原体靶标互补的区Ⅱ、富含胞嘧啶的区Ⅲ、与引物互补的区Ⅳ、与分子信标探针互补的区Ⅴ和与生殖支原体靶标互补的区Ⅵ，区Ⅰ、区Ⅱ、与区Ⅲ、区Ⅳ、区Ⅴ和区Ⅵ在环形探针序列上以5’端到3’端依次排列；以及，环形探针序列的3’端标记有羟基基团，5’端标记有磷酸基团；
引物序列：3’端与环形探针互补杂交，5’端与靶标互补；
分子信标探针：茎环部分序列与靶标一致，两侧臂一端标记有荧光基团Cy5，两臂另一端标记有淬灭基团BHQ2，且分子信标探针两侧臂区域各包含6个碱基，各碱基之间相互互补配对。
所述试剂盒检测标准为：
若检测为无荧光信号，呈阴性，则样本中无生殖支原体感染；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物的单一荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体存在耐药基因的位点突变；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体不存在耐药基因的位点突变。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提出：一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，包括环形探针、引物、分子信标探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、硫磺素T和dNTP混合溶液；
进一步的，所述环形探针序列如SEQ ID NO .1所示；其中，SEQ ID NO .1：
5’-TCCGTCCCGTTGCGCCCATCTGAATCCCACCCTCCCACCCATCATCGCTTGGGTCTT-3’。
进一步的，所述引物序列如SEQ ID NO .2所示；其中，SEQ ID NO .2：
5’-TACACATTCGATGA-3’。
进一步的，所述分子信标探针序列如SEQ ID NO .3所示；其中，SEQ ID NO .3：
5’- CGATGCATCGCTTGGGTCTTTCCGTCGCATCG-3’。
其中，涉及的靶标序列如SEQ ID NO .4所示；其中，SEQ ID NO .4：
5’-GCGCAACGGGACGGAAAGACCCTGTGTA-3’。
实施例3
在实施例1-2的基础上，本实施例取三例临床样本（均来源于两周内在四川大学华西第二医院就诊的门诊病人，且该标本已经四川大学华西第二医院医学检验科采用上海仁度生物技术有限公司的试剂验证，结果包含：2例生殖支原体阳性样本，1例生殖支原体阴性样本），然后进行生殖支原体感染及其耐药基因位点突变检测，具体过程如下：
一、样本获取
上述三例临床样本均为临床医生采集的宫颈拭子样本，采样后立即送至四川大学华西第二医院医学检验科，并于采样后30min内转移至样本保存液（上海仁度生物技术有限公司）中；然后，置于4℃下保存，并于24h内完成检测；
二、样本前处理
对上述已知结果的三例样本进行编盲，分别记为样本A、样本B和样本C；用磁珠法进行核酸提取，步骤包括样本裂解、核酸吸附、洗涤液洗涤、洗脱核酸等过程，将提取好的核酸收集于1毫升EP管中，待用，即得待测样本核酸；
其中，涉及的样本裂解、核酸吸附、洗涤液洗涤、洗脱核酸等过程均为本领域内核酸提取的常规操作；
三、分子信标探针的预制备
用TE缓冲液（包括：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，PH=8.0）溶解并稀释分子信标探针至10μM，于95℃下金属浴变性5min；然后，以1℃/2min的速度缓慢退火至室温，确保分子信标探针茎环结构的形成，置于4℃下保存，备用；
四、试剂盒检测体系配置
（1）向9 μL预反应混合溶液（包括：300nM的环形探针、300nM的引物、0.5×T4 DNA连接酶缓冲液和1.5U的T4 DNA连接酶）中加入1 μL提取好的待测核酸样本，于16 ℃下孵育25 min（为“三交联”结构的形成和环形探针成环提供条件）；反应完毕后，立即置于65 ℃金属浴孵育10 min（以灭活T4 DNA连接酶的活性）；
（2）向上述的10μL混合溶液中加入500μM的dNTP、10U的phi29 DNA聚合酶、1×phi29 DNA聚合酶缓冲液、10μM的硫磺素T溶液和500 nM的分子信标探针，配制为总体系20μL的扩增溶液；
五、检测
于实时荧光PCR仪上，设置扩增和信号采集程序为37℃、1min/cycle、40 min、FAM和Cy5双通道；将上述20μL的扩增溶液置于该实时荧光PCR仪上，并启动信号采集程序；
根据三例标本的实时PCR扩增曲线分别判读FAM和Cy5两通道的结果，初步推断可能的样本信息；
其中， 三个样本涉及的扩增原理和信号曲线，如图1所示；
并由图2可知：样本A感染的生殖支原体不存在耐药基因的位点突变；
由图3可知：样本B感染的生殖支原体存在耐药基因的位点突变；
由图4可知：样本C未感染生殖支原体。
综上，于实验结束后揭盲，判断结果的一致性。
Claims (5)
1.一种可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，包括环形探针、引物、分子信标探针、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、硫磺素T和dNTP混合溶液；
其中，环形探针序列包括与分子信标探针互补的区Ⅰ、与生殖支原体靶标互补的区Ⅱ、富含胞嘧啶的区Ⅲ、与引物互补的区Ⅳ、与分子信标探针互补的区Ⅴ和与生殖支原体靶标互补的区Ⅵ，区Ⅰ、区Ⅱ、区Ⅲ、区Ⅳ、区Ⅴ和区Ⅵ在环形探针序列上以5’端到3’端依次排列；以及，环形探针序列的3’端标记有羟基基团，5’端标记有磷酸基团；
引物序列的3’端与环形探针互补杂交，5’端与靶标互补；
分子信标探针的茎环部分序列与靶标一致，分子信标探针两侧臂一端标记有荧光基团Cy5，分子信标探针两侧臂另一端标记有淬灭基团BHQ2，且分子信标探针两侧臂区域各包含6个碱基，各碱基之间相互互补配对。
2.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，依据的检测标准为：
若检测为无荧光信号，呈阴性，则样本中无生殖支原体感染；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物的单一荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体存在耐药基因的位点突变；
若检测为有DNA G4-硫磺素T复合物和分子信标-分子信标互补链复合物的双重荧光信号，呈阳性，则样本中感染的生殖支原体不存在耐药基因的位点突变。
3.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述环形探针序列如SEQ ID NO .1所示。
4.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO .2所示。
5.根据权利要求1所述的可同时检测生殖支原体感染及其耐药基因位点突变的试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针序列如SEQ ID NO .3所示。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999055916A1 (en) * | 1998-04-29 | 1999-11-04 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences |
| US20140302496A1 (en) * | 2011-07-13 | 2014-10-09 | Primeradx, Inc. | Multimodal methods for simultaneous detection and quantification of multiple nucleic acids in a sample |
| CN106967794A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-21 | 清华大学深圳研究生院 | 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法 |
| WO2018020831A1 (ja) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | 国立大学法人群馬大学 | 遺伝子変異を有するポリヌクレオチド配列の簡便検出法 |
| KR20190121000A (ko) * | 2018-04-17 | 2019-10-25 | 건국대학교 산학협력단 | 중합효소연쇄반응과 회전환 증폭을 이용한 타겟 핵산서열 검출 |
| CN112135914A (zh) * | 2018-01-09 | 2020-12-25 | 雅培分子公司 | 用于检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫和生殖支原体的测定 |
| CN116970722A (zh) * | 2023-07-03 | 2023-10-31 | 重庆新赛亚生物科技有限公司 | 同时鉴定幽门螺杆菌感染和检测耐药基因突变位点的方法、引物探针组合物、应用和试剂盒 |
-
2024
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999055916A1 (en) * | 1998-04-29 | 1999-11-04 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences |
| US20140302496A1 (en) * | 2011-07-13 | 2014-10-09 | Primeradx, Inc. | Multimodal methods for simultaneous detection and quantification of multiple nucleic acids in a sample |
| WO2018020831A1 (ja) * | 2016-07-25 | 2018-02-01 | 国立大学法人群馬大学 | 遺伝子変異を有するポリヌクレオチド配列の簡便検出法 |
| CN106967794A (zh) * | 2017-03-14 | 2017-07-21 | 清华大学深圳研究生院 | 双向信号扩增检测miRNA的试剂盒及方法 |
| CN112135914A (zh) * | 2018-01-09 | 2020-12-25 | 雅培分子公司 | 用于检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、阴道毛滴虫和生殖支原体的测定 |
| KR20190121000A (ko) * | 2018-04-17 | 2019-10-25 | 건국대학교 산학협력단 | 중합효소연쇄반응과 회전환 증폭을 이용한 타겟 핵산서열 검출 |
| CN116970722A (zh) * | 2023-07-03 | 2023-10-31 | 重庆新赛亚生物科技有限公司 | 同时鉴定幽门螺杆菌感染和检测耐药基因突变位点的方法、引物探针组合物、应用和试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JINGBO JIAO: "A fluorescence quenching-recovery sensor based on RCA for the specific analysis of Fusobacterium nucleatum. Nucleatum", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 604, 3 July 2020 (2020-07-03), pages 1 - 8, XP086232790, DOI: 10.1016/j.ab.2020.113808 * |
| WEI YUAN: "A Synergistic Dual-Channel Sensor for Ultrasensitive Detection of Pseudomonas aeruginosa by DNA Nanostructure and G-Quadruplex", BIOSENSORS, vol. 13, no. 24, 26 December 2022 (2022-12-26), pages 1 - 13 * |
| 刘健慧: "基于G-四链体的PCR-RCA双重扩增技术检测沙门氏菌", 食品科学, vol. 43, no. 12, 30 June 2022 (2022-06-30), pages 325 - 333 * |
| 刘巨: "滚环扩增介导的核酸信号放大策略在生物传感器中的应用研究进展", 分析测试学报, vol. 39, no. 12, 31 December 2020 (2020-12-31), pages 1556 - 1560 * |
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