CN105087555A - 一种基于目标触发的可二次扩增的探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于目标触发的可二次扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹以及第三发夹。本发明的探针，检测目标DNA时可发生两次扩增，显著的增强了信号，大大提高了检测目标DNA的灵敏度，检测限可降低至0.36pM，并具有超过5个数量级的宽动态检测范围，可满足微量DNA的检测要求，并且操作简单、成本低。

Description

一种基于目标触发的可二次扩增的探针及其应用

技术领域

本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于目标触发的可二次扩增的探针及其应用。

背景技术

在突变分析、临床诊断和基因治疗中，微量DNA的检测起着至关重要的作用。为了检测微量的DNA，则需要构建检测灵敏度高的DNA生物传感器。目前，有采用信号扩增策略来实现高灵敏度检测的传感器，这些高灵敏度的传感器主要集中于核酸研究的领域，采用的扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和滚环扩增(RCA)等。虽然采用上述方法可以实现对目标检测物的高灵敏分析，但是通常涉及多个分析步骤，并且需要加入许多外源试剂。因此，目前亟待提出一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测微量DNA的方法。

脱氧核酶(DNA酶)属于人工核酸的一种，通过体外选择被分离出来，具有对特定底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性等优点，是生物应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子--氯化血红素，形成仿过氧化物酶DNA酶，进而将H₂O₂介导的2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS^2-)催化氧化成绿色的ABTS^·-，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。但是利用上述原理进行DNA分析的比色探针较为少见，更无法达到检测微量DNA的灵敏度。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中检测微量DNA分析步骤复杂、需要加入许多外源试剂，进而提供一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测微量DNA的方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针无法达到检测微量DNA的灵敏度，进而提供一种基于目标触发的可二次扩增的、可检测微量DNA的、高灵敏度的探针。

本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹以及第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；

所述第一发夹包括：识别目标DNA的识别区以及与所述识别区部分杂交形成发夹结构的第一茎干区；

所述第二发夹包括：与所述第一发夹的识别区部分杂交的碱基互补区；

所述第三发夹包括：可与所述第一发夹的第一茎干区部分杂交的第二茎干区以及G-四链体区。

发夹结构是指，DNA单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而形成的结构。本发明中，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的环状区是指，在发夹结构中，未形成双链结构的、回折的部分。所述茎干区是指，形成双链结构的部分。所述第一茎干区、第二茎干区可以是完整的茎干区，也可以是所述茎干区的一部分。

所述G-四链体区具有如SEQIDNo.1所示的序列结构，序列SEQIDNo.1为：5’-TATGGGTTGGGCGGGATGGG-3’。

所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述环状区的碱基个数与所述茎干区的碱基个数的比值大于2。

所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述茎干区的序列长度为5-16个碱基，且在所述碱基中，胞嘧啶和鸟嘌呤的个数分别占总碱基数的60％以下。

所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的5’端的第一个碱基为胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶中的一种。

作为本发明的具体设计方式，所述第一发夹具有如SEQIDNo.2所示的结构，所述第二发夹具有如SEQIDNo.3所示的结构，所述第三发夹具有如SEQIDNo.4所示的结构。具体来说，

序列SEQIDNo.2为：5’-GTGACTAGATCTACATATTGCCATCTGTAACAATATGTAGATCTATGGGTTTTTT-3’；

序列SEQIDNo.3为：5’-TATTGTTACAGATGGCAATATGTAGATCTACCATCTGTAATTTT-3’；

序列SEQIDNo.4为：5’-TATGGGTTGGGCGGGATGGGAACCCATAGATCTACA-3’。

本发明的检测DNA分子的方法，利用上述基于目标触发的可二次扩增的探针进行检测。包括以下步骤：将所述的基于目标触发的可二次扩增的探针置于待测溶液中，并加入核酸外切酶Ⅲ，5-35℃下培育4-10h，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

进一步的，所述方法还包括在在加入所述待测溶液前，将所述探针先缓慢加热至95℃，保持5-10分钟，然后在至少2小时以上的时间内，将其缓慢冷却至室温的步骤。

进一步的，加入氯化血红素的同时还包括加入氢离子缓冲液的步骤。优选的，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。

进一步的，所述氯化血红素加入后，培育30-90min再加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢。

本发明所述的基于目标触发的可二次扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。

作为本发明的优选实现方式，所述DNA分子具有如SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11所示的结构，具体包括：

序列SEQIDNo.5为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACGCTA-3'

序列SEQIDNo.6为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACTCTG-3'

序列SEQIDNo.7为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACAATT-3'

序列SEQIDNo.8为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACATGGTTAC-3'

序列SEQIDNo.9为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACGCTAACTT-3'

序列SEQIDNo.10为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACGCTACTTCAT-3'

序列SEQIDNo.11为：5'-CAATATGTAGATCTAGTCACATCGTTTAAA-3'

本发明中，所述的核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)是一个不依赖序列的酶，不需要特定的酶切识别位点。它可以逐步催化水解移除带有3'-平末端或凹末端的双链DNA上的单核苷酸，但对于3'末端突出的双链DNA或者单链DNA表现出有限的催化水解活性。

本发明所述的基于目标触发的可二次扩增的探针检测目标DNA的原理如下：反应体系中，所述第一发夹的识别区识别目标DNA，并与之结合，使所述第一发夹打开，识别区剩余部分以及第一茎干区以单链形式被释放出来；被释放的所述识别区剩余部分以及所述第一茎干区与第二发夹杂交，形成复合物第一发夹-目标DNA-第二发夹；由于复合物第一发夹-目标DNA-第二发夹不稳定，目标DNA随即便从复合物中分离出来，留下带有3’-凸末端的第一发夹-第二发夹双链；分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹结合，从而引发目标DNA的循环扩增；留下带有3’-凸末端的第一发夹-第二发夹双链，可与所述第三发夹的第二茎干区杂交，形成复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹；形成的复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹可被核酸外切酶Ⅲ识别，进而特异性的剪切带有3’平末端或凹末端的DNA双链，即将第一发夹-第二发夹-第三发夹复合物上的第三发夹以3’-向-5’的方向从3’-平末端开始逐步水解单核苷酸，从而释放出第一发夹-第二发夹双链与G-四链体序列；被释放处的第一发夹-第二发夹则可自由地结合新的第三发夹，从而引发核酸外切酶Ⅲ的剪切反应，形成循环，并释放处更多的G-四链体序列；被释放的G-四链体可与氯化血红素相互作用，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，巧妙的设计出所述第一发夹、第二发夹、第三发夹，可在核酸外切酶Ⅲ存在的情况下，经目标DNA触发，形成两个独立的循环反应，使检测目标DNA时发生两次扩增，显著的增强了信号，大大提高了检测目标DNA的灵敏度，检测限可降低至0.36pM，并具有超过5个数量级的宽动态检测范围，可满足微量DNA的检测要求；

(2)本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，所述第一发夹包括识别区与第一茎干区，在反应体系中不存在目标DNA时，保持发夹结构，所述第二发夹、第三发夹也无法与第一发夹发生反应，在该应体系中三种发夹结构均保持稳定的状态，不产生信号；只有当目标DNA存在时，才会触发所述第一发夹打开，进而打开所述第二发夹、所述第三发夹，从而产生信号。因此，上述探针不仅具有良好的特异性，并且检测DNA分子的整个反应可以在等温、均一的溶液中进行，大大的简化了检测DNA分子、乃至微量DNA的检测操作，无需加入过多的外源试剂、无需复杂耗时的热循环反应，操作简单、方便；

与此同时，相较于现有技术中常用的生物探针需进行荧光素、淬灭剂等的化学修饰或者标记导致的生产成本较高，本发明的探针无需标记、修饰，其制备成本低，三个发夹结构的合成、制备也较为简单；

(3)本发明探针，利用核酸外切酶Ⅲ不能剪切3’-凸末端，而可以被特异性剪切3’-平末端或3’-凹末端的DNA双链的性质，将复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹中的所述第三发夹上的G-四链体序列释放出来，剩余部分继续参与反应，形成循环，实现了检测DNA分子的第二次信号扩增，显著的提高了探针的灵敏度；

(4)本发明所述的基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针检测蛋白质的方法，将所述基于G-四链体-氯血红素DNA酶的探针置于待测溶液中，5-35℃下培育4-10h后加入氯化血红素、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、过氧化氢即可。上述方法操作简单、条件易于控制且耗时较短；

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例1的目标触发的可二次扩增的探针的检测原理示意图；其中，图中附图标记表示为：Ⅰ-识别区；Ⅱ-第一茎干区；Ⅲ-碱基互补区；Ⅱ’-第二茎干区；Ⅳ-G-四链体区。

图2为实施例2中检测的吸收光谱图；

图3为实施例2中检测的418nm处吸收光谱图；其中，插图为吸收光强度与目标DNA浓度的对数图；

图4为实施例3中检测的吸收光谱图；

图5为实施例4中检测的吸收光谱图；

图6为实施例5中检测的吸收光谱图；

图7为实施例6中对不同DNA进行检测的结果示意图；

具体实施方式

实施例1：基于目标触发的可二次扩增的探针的探针设计

本实施例中，所述的基于目标触发的可二次扩增的探针包括：第一发夹H1、第二发夹H2以及第三发夹H3，各组成序列如表1所示。待检测的目标DNA具有如下序列：5’-CAATATGTAGATCTAGTCACGCTA-3’。

表1基于目标触发的可二次扩增的探针序列

所述第一发夹H1包括：识别目标DNA的识别区Ⅰ以及与所述识别区Ⅰ部分杂交形成发夹结构的第一茎干区Ⅱ；

所述第二发夹H2包括：与所述第一发夹的识别区Ⅰ部分杂交的碱基互补区Ⅲ；

所述第三发夹H3包括：可与所述第一发夹的第一茎干区Ⅱ部分杂交的第二茎干区Ⅱ’以及G-四链体区Ⅳ。

其检测原理如图1所示为：

第一循环反应：

(1)反应体系中，所述第一发夹H1的识别区Ⅰ识别目标DNA,(以下简称T)，并与之结合，使所述第一发夹H1打开，识别区Ⅰ的剩余部分以及第一茎干区Ⅱ以单链形式被释放出来；

(2)被释放的所述识别区Ⅰ的剩余部分以及所述第一茎干区Ⅱ与第二发夹H2杂交，形成复合物H1-T-H2；

(3)由于复合物H1-T-H2不稳定，目标DNA随即便从复合物中分离出来，留下带有3’-凸末端的H1-H2双链；

(4)分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹H1结合，从而引发目标DNA的循环扩增；

第二循环反应：

(5)留下带有3’-凸末端的H1-H2双链，可与所述第三发夹H3的第二茎干区Ⅱ’杂交，形成复合物H1-H2-H3；

(6)形成的复合物H1-H2-H3可被核酸外切酶Ⅲ识别，进而特异性的剪切带有3’平末端或凹末端的DNA双链，即将H1-H2-H3复合物上的第三发夹H3以3’-向-5’的方向从3’-平末端开始逐步水解单核苷酸，从而释放出H1-H2双链与G-四链体区Ⅳ；

(7)被释放处的H1-H2则可自由地结合新的第三发夹H3，从而引发核酸外切酶Ⅲ的剪切反应，形成循环，并释放处更多的G-四链体序列；

(8)被释放的G-四链体可与氯化血红素相互作用，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通过H₂O₂将ABTS^2-催化氧化成绿色的ABTS^·-。

本实施例中使用的DNA寡核苷酸购于南京金斯瑞生物科技有限公司(Genscript公司)，为PAGE纯，用20mM(M代表mol/L,下同)的Tris-HCl缓冲液(100mMNaCl,25mMKCl，2mMMgCl₂,pH＝7.4)稀释成100μM的储备液，人工合成上述第一发夹H1、第二发夹H2以及第三发夹H3。

实施例2：基于目标触发的可二次扩增的探针对不同浓度的目标DNA的检测

本实施例中使用的核酸外切酶Ⅲ、氯化血红素购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过氧化氢购买于Aladdin试剂公司(上海，中国)，上述材料的各市售型号的产品之间效果并无差异。配制溶液均使用Milli-Q纯化系统(比尔里卡，马萨诸塞州，美国)制备的重蒸水。

对实施例1中的目标DNA的检测包括以下步骤：

首先，取所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的溶液，加热至95℃，保持5min，再缓慢降至室温，备用。采用二甲亚砜(DMSO)配制1mM的氯化血红素溶液，并在-20℃下储存于暗处，备用。配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液待用，该缓冲液包括：25mM的HEPES，200mM的NaCl，20mM的KCl，1v％的DMSO，pH值为7.4。

配制Tris-HCl缓冲液待用，该缓冲液包括：20mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，25mM的KCl，2mM的MgCl₂，pH值为7.4。取目标DNA用上述Tris-HCl缓冲液稀释至目标DNA的浓度为0.5pM(即pmol/L，下同)、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM的溶液，以及未加入目标DNA的缓冲液，作为待测溶液。

分别取实施例1中的浓度为0.5μM的所述第一发夹溶液、浓度为0.5μM的所述第二发夹溶液、浓度为0.5μM的所述第三发夹溶液各20μL，以及浓度为2.5U/μL的核酸外切酶Ⅲ溶液10μL，置于体积为10μL的待测溶液中，将反应混合液在37℃下培育90min，再向其中加入10μL浓度为10μM的氯化血红素溶液、90μL的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，继续培育60min，最后加入10μL浓度为120mM的ABTS溶液以及10μL浓度为40mM的H₂O₂，使混合液中ABTS、H₂O₂的浓度分别为6Mm与2mM，培育5min，即可测定。

取上述混合液作为样品，置于SpectraMaxM5e多功能酶标仪上进行吸光度的检测，溶液的吸收光谱测定波长范围为390-490nm，步径2nm。吸收光谱的测定结果如图2、3所示。图2中，曲线a为目标DNA浓度为0的混合液、曲线b为目标DNA浓度为0.5pM的混合液、曲线c为目标DNA浓度为1pM的混合液，依次类推，10pM(曲线d)、100pM(曲线e)、1nM(曲线f)、10nM(曲线g)、100nM(曲线h)。

由上述检测结果可知，对不同浓度的目标DNA进行吸收光谱检测，418nm处的吸收强度随着目标DNA浓度的增加而相应的增加。这与实验事实相符，即通过二次扩增反应产生的G-四链体越多，得到的绿色的ABTS^·-也就越多。而通过数据处理可得到目标DNA吸收强度和浓度之间的指数曲线，如图3所示，呈现出了很好的线性相关，浓度范围跨越5个数量级，从0.5pM到100nM(图3中的插图)。线性回归方程为Y＝0.3139+0.06483log₁₀C，线性相关系数为0.9941，其中，Y和C分别代表吸收强度和目标DNA的浓度。通过对平均响应的空白加上三倍标准偏差的计算，可知本发明的方法的检测限为0.36pM。其灵敏度比只使用目标触发的发夹组装的荧光分析法(100pM)相比提高了2个数量级(Huangetal.,2012)。这些结果清楚地表明，此二次扩增方法是有效的，并能够超灵敏比色检测DNA。

因此，本发明的方法不仅操作简单，且具有优越的灵敏度。

实施例3：基于目标触发的可二次扩增的探针的信号扩增验证实验

本实施例中，按照实施例2中的方法配制以下溶液，并依次编号a、b、c、d：

样品a：所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3的浓度均为250nM的溶液；

样品b：所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3的浓度均为250nM，所述核酸外切酶Ⅲ的浓度为2U/uL的溶液；

样品c：所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3的浓度均为250nM，目标DNA的浓度为100nM的溶液；

样品d：所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3的浓度均为250nM，所述核酸外切酶Ⅲ的浓度为2U/uL，目标DNA的浓度为100nM的溶液；

将上述各溶液置于37℃下培育60min，然后分别取等量的样品溶液加入等量的氯化血红素溶液、ABTS溶液以及H₂O₂，进行反应。采用与实施例2中相同的方法对样品a、b、c、d进行吸光度的检测。

其测试结果如图4所示，在没有目标DNA存在的情况下，不管ExoⅢ存在与否，只含有H1、H2和H3的样品a以及只含有H1、H2、H3以及ExoⅢ的样品b在418nm处的吸收强度都非常低(曲线a和b)。然而在目标DNA存在的情况下，无ExoⅢ存在的样品c的吸收强度明显增加(曲线c)。这主要是由于目标DNA与第一发夹H1的杂交所致：目标DNA触发打开了第一发夹H1从而引发了第二发夹、第三发夹的组装反应，导致了一定量的G-四链体的暴露并接着形成了仿过氧化物酶DNA核酶，这些DNA核酶在H₂O₂存在下将无色的ABTS^2-氧化转变为绿色的ABTS^·-(λ_max＝418nm)，从而引起了吸收强度的增加。而有ExoⅢ存在的样品d，其吸收强度得到了进一步增强(曲线d)。这进一步验证了ExoⅢ的加入能够引起再循环和H1-H2双链的循环再利用，导致更多的G-四链体/氯化血红素DNA核酶的产生，进一步增加了吸收强度。

上述结果表明，可二次扩增可以明显增加检测的灵敏度。本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针具有优越的灵敏度。

实施例4：基于目标触发的可二次扩增的探针的ExoⅢ用量平行实验

本实施例采用与实施例2相同的方法进行目标DNA的检测，区别仅在于，包含所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3、ExoⅢ、待测溶液的混合反应液中，ExoⅢ的量分别为10U、15U、20U、25U、30U。

反应结束后，其吸光度检测结果如图5所示。由图5中可以看出吸收强度随着ExoⅢ从10U到30U的增加而增加。

实施例5：基于目标触发的可二次扩增的探针的反应时间平行实验

本实施例采用与实施例2相同的方法进行目标DNA的检测，区别仅在于，将包含所述第一发夹H1、第二发夹H2、第三发夹H3、ExoⅢ、待测溶液的混合反应液在37℃下培育的时间依次为15min、30min、45min、60min、75min、90min、105min、120min。

反应结束后，其吸光度检测结果如图6所示。由图6中可以看出各检测吸收强度在15min到90min内随着反应时间的增加迅速增加然后达到平衡，说明90min时二次扩增反应和ExoⅢ剪切过程已彻底完成。

实施例6：基于目标触发的可二次扩增的探针的特异性检测实验

本实施例中，通过暴露本发明的探针于不同的DNA序列中来验证本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针的特异性，具体如下：

取实施例1中所述的基于目标触发的可二次扩增的探针进行目标DNA的检测，简称T，作为对比的DNA分别有单个碱基不匹配的DNA，简称T1；两个碱基不匹配的DNA，简称T2；完全不互补的DNA，简称Tn。各DNA的序列如表2所示。

表2待检测DNA序列

Name	Sequences(5'-3')
		T	CAA TAT GTA GAT CTA GTC ACG CTA
T1	CAA TAT GTA GAA CTA GTC ACG CTA
		T2	CAA TAT GTA GAA CTA GAC ACG CTA
Tn	AGC GCC TGC ACG TCG ACT CAA TCC

将上述序列的DNA配制为浓度为100nM的溶液，并设置一组待测溶液中仅含有缓冲液，不含DNA的空白实验。按照与实施例2中相同的方法进行检测。

各组实验的吸收度检测结果如图7所示。由图7可以看出，单个碱基不匹配的DNA(T1)的吸收强度和两个碱基不匹配的DNA(T2)吸收强度分别只有完全互补DNA吸收强度的46.5％和39.7％。此外，完全不互补的DNA显示了与空白溶液几乎相同的响应。因此，该方法表现出了良好的区别完全互补的目标和不匹配的目标的性能，具有良好的特异性，并拥有潜力进行单核苷酸多态性(SNP)的分析。

综上所述，本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针具有超高灵敏度，可满足微量DNA的检测要求，并具有良好的特异性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCELISTING

<110>江苏省原子医学研究所

<120>一种基于目标触发的可二次扩增的探针及其应用

<130>SHA201400339

<160>15

<170>PatentInversion3.3

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<213>未知

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Claims (12)

1.一种基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述探针包括第一发夹、第二发夹以及第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链结构并回折的部分为环状区；

所述第一发夹包括：识别目标DNA的识别区(Ⅰ)以及与所述识别区(Ⅰ)部分杂交形成发夹结构的第一茎干区(Ⅱ)；

所述第二发夹包括：与所述第一发夹的识别区(Ⅰ)部分杂交的碱基互补区(Ⅲ)；

所述第三发夹包括：可与所述第一发夹的第一茎干区(Ⅱ)部分杂交的第二茎干区(Ⅱ’)以及G-四链体区(Ⅳ)。

2.根据权利要求1所述的基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述G-四链体区(Ⅳ)具有如SEQIDNo.1所示的序列结构。

3.根据权利要求1或2所述的基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述环状区的碱基个数与所述茎干区的碱基个数的比值大于2。

4.根据权利要求3所述的基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述茎干区的序列长度为5-16个碱基，且在所述碱基中，胞嘧啶和鸟嘌呤的个数分别占总碱基数的60％以下。

5.根据权利要求1-4中任一所述的基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的5’端的第一个碱基为胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶中的一种。

6.根据权利要求1-5中任一所述的基于目标触发的可二次扩增的探针，其特征在于，所述第一发夹具有如SEQIDNo.2所示的结构；所述第二发夹具有如SEQIDNo.3所示的结构；所述第三发夹具有如SEQIDNo.4所示的结构。

7.一种检测DNA分子的方法，其特征在于，利用权利要求1-6中任一所述的基于目标触发的可二次扩增的探针进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-6中任一所述的基于目标触发的可二次扩增的探针置于待测溶液中，并加入核酸外切酶Ⅲ，5-35℃下培育4-10h，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液的发光或变色情况。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括在在加入所述待测溶液前，将所述探针先缓慢加热至95℃，保持5-10分钟，然后在至少2小时以上的时间内，将其缓慢冷却至室温的步骤。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在加入氯化血红素的同时还包括加入氢离子缓冲液的步骤。

11.权利要求1-6中任一所述的基于目标触发的可二次扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述DNA分子具有如SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11所示的结构。