CN107966437A - 一种银的耐高盐核酸传感器及其应用 - Google Patents

一种银的耐高盐核酸传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银的耐高盐核酸传感器及其应用。所述传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括银离子脱氧核酶；所述银离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括显色剂和氯高铁血红素。本发明的传感器，特异性识别银离子，通过等温指数放大反应进行信号一级的扩大和转化；在氯高铁血红素诱导下形成具有活性的G‑四链体结构，催化显色剂显色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行定性和定量的检测。

Description

一种银的耐高盐核酸传感器及其应用
技术领域
本发明属于重金属检测技术领域，具体涉及一种银的耐高盐核酸传感器及其应用。
背景技术
银广泛存在于自然界中。它可作为金属催化剂、抗菌剂、感光剂等，银有着特殊的杀菌、催化和光学特性，在临床医学上被广泛用作消炎抗菌剂，如烧伤敷料等。其应用形式包括银盐(AgNO3)，化合物银如(SD-Ag)和纳米银，在电子、电镀、感光等行业有着广泛的应用。
同时，这些涉及银的行业的生产和应用中会产生含银的工业废水，这种含银废水对环境的污染非常严重，相比其他形式的银，离子形式的银是毒性最大的，银离子在水中易被生物富集，进而抑制蛋白的活性，间接地影响生物的繁衍。体内研究显示机体可通过吸入、皮肤接触、摄食等多种途径接触到纳米银，进而通过循环系统遍布全身，在包括皮肤、肝脏、肺、心血管系统和生殖系统在内的众多组织产生毒副反应，通过氧化应激和凋亡，对人体产生极大的危害。
随着纳米技术的发展，纳米银颗粒也随之被发现在催化剂、等离子共振材料、纳米电化学、生物传感器等领域有着巨大的应用前景。溶液中银离子浓度是影响纳米银生成的一个重要因素，对痕迹量银离子浓度的准确控制是开展这些科学研究工作的前提。所以针对于对银离子浓度变化的在线监测，需要一种有效科学的银检测方法，为相关领域的机理研究提供有力依据。
目前，银离子的检测方法很多，如电热原子吸收法(ETAAS)、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、催化动力学分光光度法、催化动力学-氯离子选择性电极法等。这些方法前处理方法繁杂，均需要取样后分析，不适用于银离子浓度的快速原位检测，尽管这些方法灵敏度较高，但是都需要昂贵的仪器，成本较高，因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属银检测的需要。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供一种能够实现可视化检测、简便快速、高灵敏度和高特异性、耐高盐的银离子检测的功能核酸显色传感器。
本发明基于的基本原理为：银离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构；痕量银离子能够特异性识别银离子脱氧核酶、结合核酶的酶链，并激活核酶、切割核酶的底物链，产生切割产物。在切割产物存在的时候，促发EXPAR发生、放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构、发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色。可以通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供的一种银的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括银离子脱氧核酶；所述银离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
上述传感器中，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液为20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶缓冲溶液为100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
上述传感器中，所述信号转化元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸(优选的，2mol/L)；所述显色剂为TMB显色剂。
本发明同时提供了上述传感器在检测银离子中的应用。
本发明还提供了一种检测银离子的方法，包括步骤如下：
制备银离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度(OD值)关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算银离子的浓度；
其中银离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)制备银离子脱氧核酶切割产物：将银离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到银离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的银离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的银离子脱氧核酶切割产物溶液；
(2)目标产物的等温扩增：
等温扩增体系由A体系、B体系组成；
所述A体系包括扩增模板、dNTPs、银离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述拖延核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
将所述不同浓度的银离子脱氧核酶切割产物溶液与其他A体系的组成物质混合，制备不同的银离子浓度的A体系，然后分别与B体系混合，进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；
(2)G-四链体结构显色物制备
将氯高铁血红素与上述一系列扩增产物分别进行反应，然后加入显色剂后进行OD值检测，得到OD值随银离子浓度变化的标准曲线。
上述方法中，所述银离子脱氧核酶的制备方法包括：将银离子脱氧核酶底物链与银离子脱氧核酶酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降温至25℃。
上述方法中，所述等温扩增反应的步骤为：加入银离子溶液的A体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A体系和B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。
上述方法中，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入TMB显色剂，混匀，37℃反应10min，H2SO4终止反应。
本发明同时也提供了一种检测银离子的试剂盒，包括：银离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述银离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链和银离子标准溶液；
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，所述A体系包括扩增模板、dNTPs；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述拖延核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
所述显色体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为TMB显色剂。
上述试剂盒中，优选的，
所述A体系组成：
1μM扩增模板母液：6μL，终浓度0.2μM；
2.5mM dNTPs母液:3μL；
所述B体系组成：5.8μL
8U/μL Bst DNA聚合酶母液：0.1μL，终浓度0.02U/μL；
10x(10倍量)聚合酶反应缓冲溶液母液：3μL，终浓度1x；
10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶母液：1.2μL，终浓度0.37U/μL；
10x Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液母液：1.5μL，终浓度0.5x。
本发明还提供了一种银离子脱氧核酶，所述银离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链、酶链序列如下表：
本发明的“倍量”或“x”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
本发明的有益效果
(1)本发明提供了一种银的功能性核酸传感器和检测方法，其基于银离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构，痕量的银离子就能够特异性识别银离子脱氧核酶、结合核酶的酶链，并激活核酶、切割核酶的底物链，产生切割产物。在切割产物存在的时候，促发等温指数放大反应(EXPAR)发生、产生信号的一级放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，在氯高铁血红素诱导下形成具有活性的G-四链体结构，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。
(2)本发明的传感器经过两次信号的转化，通过手持式光谱检测仪进行就可以进行定量检测通过两次的信号扩大和转化，具有很高的特异性和灵敏度，并且等温指数放大反应迅速，可以快速检测现场环境中的银离子。
(3)本发明的传感器能够抵抗高盐浓度的干扰，在高盐环境中实现银离子的检测，可以满足对高盐环境中的银离子实现定性与定量分析，还能保持较高的特异性和灵敏度，能够检测痕量的银离子。
附图说明
图1为制备的银离子脱氧核酶的切割产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
其中数字表示的列为：1-Marker；2-阴性对照：脱氧核酶底物链；3-阴性对照ⅱ：脱氧核酶底物链与酶链，无银离子；4,5,-阳性样品：在脱氧核酶底物链与酶链的体系中均添加10nM的硝酸银。
图2为银离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应扩增的结果；
其中数字表示的列为：1-Marker；2-扩增模板；3-阳性样品：银离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应的产物；4-阳性对照：扩增目标产物。
图3为OD450值随银离子浓度变化的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1银离子脱氧核酶的制备以及切割产物的生产
针对银离子设计的脱氧核酶的底物链、酶链以及脱氧核酶切割的产物如下所示：
注：扩增模板D中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；核酶切割目标产物C和扩增目标产物F都与扩增模板D完全互补；核酶底物链A末端GGAGGCGGA序列是为了增加与模版结合Tm值而增加的；钠离子切割位点在核酶底物链A的rA之后。
银离子脱氧核酶的制备方法：
将4μL的10μM脱氧核酶底物链母液与4μL的10μM脱氧核酶酶链母液用缓冲液(终浓度为50mM HEPES，50mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.26)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢将至25℃，得到银离子脱氧核酶溶液。
在上述银离子脱氧核酶溶液中加入5μL硝酸银溶液(1μM母液，溶解液为1MNaNO3)，形成40μL体系，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2MEDTA)，混匀后4摄氏度保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到银离子核酶切割后的小片段，即切割产物，证明银离子核酶的制备与切割成功，如图1所示。
实施例2银离子脱氧核酶切割产物的扩增
用于等温扩增反应的体系由两部分(A体系和B体系)组成。扩增反应体系组成：30μL体系。
A部分体系组成:24.2μL体系
扩增模板(1μM母液)：6μL(终浓度0.2μM)
dNTPs(2.5mM母液):3μL
银离子脱氧核酶的切割产物(1μM)：6μL，终浓度0.2μM
超纯水：9.2μL
B部分体系组成：5.8μL
Bst DNA聚合酶(8U/μL母液)：0.1μL(终浓度0.02U/μL)
聚合酶反应缓冲溶液(10x母液):3μL(终浓度1x)
Nt.BstNBI切刻内切酶(10U/μL母液)：1.2μL(终浓度0.37U/μL)
Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液(10x母液):1.5μL(终浓度0.5x)。
所述聚合酶反应缓冲溶液为20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液为100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
A部分体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A部分体系和B部分体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。然后放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证银离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应扩增的结果，如图2所示，有扩增产物出现。
实施例3G-四链体功能核酸显色传感器的制备
将80μL酶活缓冲液(100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4)，10μL氯高铁血红素稀释溶液(2μL氯高铁血红素原液(10μM)与1mL酶活缓冲液混合)与10μL待显色物质(即扩增产物)混合，混匀后37℃反应30min，使扩增产物结合氯高铁血红素形成G-四链体结构，加入50μL TMB显色液，混匀，37℃反应10min，加入50μL 2M H2SO4，混匀，得到显色的产物，得到G-四链体功能核酸显色传感器。
然后进行酶标仪测定OD450。
实施例4银离子检测试剂盒的制备
检测银离子的试剂盒，包括：银离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述银离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链和银离子标准溶液；
具体包括：
4μL的10μM脱氧核酶底物链母液；
4μL的10μM脱氧核酶酶链母液；
缓冲液(终浓度为50mM HEPES，50mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.26)；
1μM硝酸银母液(溶解液为1M NaNO3溶液)：使用时配制成不同浓度的硝酸银溶液5μL。
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，
所述A体系组成：
1μM扩增模板母液：6μL，终浓度0.2μM；
2.5mM dNTPs母液:3μL；
所述B体系组成：5.8μL
8U/μL Bst DNA聚合酶母液：0.1μL，终浓度0.02U/μL；
10x(10倍量)聚合酶反应缓冲溶液母液：3μL，终浓度1x；
10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶母液：1.2μL，终浓度0.37U/μL；10x Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液母液：1.5μL，终浓度0.5x。
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如实施例1中所示。
所述显色体系包括：10μM氯高铁血红素和TMB显色剂。
实施例5银离子的检测
1、OD450值随银离子浓度变化的标准曲线的制备
在根据实施1中的方法制备的银离子脱氧核酶体系中，加入不同体积银离子的硝酸银母液(溶解液为1M NaNO3溶液)和水，形成40μL体系，其中银离子的终浓度分别为0nM、10nM、25nM、50nM、100nM、150nM，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA)，混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2中银离子脱氧核酶切割产物的扩增方法与实施例3中的G-四链体功能核酸显色传感器的制备方法，得到不同银离子浓度对应的OD450，制备OD450随银离子浓度变化的标准曲线。结果如图3所示，得到的标准曲线为：y＝0.016x+0.6226，R2＝0.9981。
2、待测样品的检测
根据实施例1中的方法制备银离子脱氧核酶体系，加入待测样品，形成40μL体系，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA)，混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2中银离子脱氧核酶切割产物的扩增方法与实施例3中的G-四链体功能核酸显色传感器的制备方法，利用酶标仪测定其OD450。测定OD450值为2.1432，带入标准曲线y＝0.016x+0.6226，得到银离子浓度为X＝95.0375nM。

Claims (10)

1.一种银的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括银离子脱氧核酶；所述银离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转化元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
4.权利要求1-3任一项所述传感器在检测银离子中的应用。
5.一种检测银离子的方法，其特征在于，包括步骤如下：
制备银离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算银离子的浓度；
其中银离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)制备银离子脱氧核酶切割产物：将银离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到银离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的银离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的银离子脱氧核酶切割产物溶液；
(2)目标产物的等温扩增：
等温扩增体系由A体系、B体系组成；
所述A体系包括扩增模板、dNTPs、银离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
将所述不同浓度的银离子脱氧核酶切割产物溶液与其他A体系的组成物质混合，制备不同的银离子浓度的A体系，然后分别与B体系混合，进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；
(2)G-四链体结构显色物制备
将氯高铁血红素与上述一系列扩增产物分别进行反应，然后加入显色剂后进行OD值检测，得到OD值随银离子浓度变化的标准曲线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述银离子脱氧核酶的制备方法包括：将银离子脱氧核酶底物链与银离子脱氧核酶酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降温至25℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应的步骤为：加入银离子溶液的A体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A体系和B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入TMB显色剂，混匀，37℃反应10min，H2SO4终止反应。
9.一种检测银离子的试剂盒，其特征在于，包括：银离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述银离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、银离子标准溶液；
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，所述A体系包括扩增模板和dNTPs；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
所述显色体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为TMB显色剂。
10.一种银离子脱氧核酶，其特征在于，所述银离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链、酶链序列如下表：
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