CN102695803A - 与催化活性的产生相关的邻位连接测试 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种均相测定的组成步骤：1)至少与2个分子接触，每个分子都由一个识别组件和一个样本的部分信息组成，其中的识别组件和样本的接触会使得这个部分信息形成一个连续的信息；2)将连续消息放大形成一个直接或间接地产生催化活性的催化实体；3)提供一个允许在至少两个分子和样本之间，通过催化活性检测识别事件的基质。

Description

与催化活性的产生相关的邻位连接测试
技术领域
本发明是关于一种通过催化活性的产生来探查一种已知事件的测定。
背景技术
分析测定，例如，免疫测定作为探查和测定生物学及其他样本浓度的方法，在本专业领域众所周知。免疫测定方法利用抗体或其他识别分子与其抗原的特异性结合来探测一种分析物，其中分析物可以包括或抗体或抗原或两者都包括。然后可以通过对抗原或抗体中一种或两者的存在进行测定来量化确定分析物的浓度。通过这种方式使探查测定浓度极低的分析物成为可能。
免疫测定可以采用不同的方式和形式来进行。在应用免疫测定的所有不同形式之中，最广泛使用的可能是使用固定的抗体和/或抗原、应用固相分离的那些免疫测定。在专业领域中这种技术被称为一种异相免疫测定。只有在确认检测材料中含有兴趣分析物时，才需要分离固定的抗体和/或抗原，来有效地测量，其中固定相作为一个物理耦合位点允许通过洗涤步骤来去除非靶材料。这种洗涤过程将组成这种样本的混合物中的分析物从其它成分中分离出来。
为了在免疫测定中探查和测定分析物的浓度，需要一个检测系统。例如，可以使用一种酶学分析，其中通过酶学作用将不可探测的绑定分析物变成一种可探测的量化检测信号。探测抗体和/或抗原的其它方法可以通过使用可检测的标签标记抗体或/或抗原而实现，这样的标签包括胶体金标记、放射性同位素标记、磁标记和荧光标记。
异相免疫测定已经是，并将继续是，探查和测定分析物的极其重要的方法。这种测定每年完成的相当数量反映了这一点。但是，虽然作为一种常规的检测方法，这种方法是已经得到了确认并且确实可靠，它们也有缺陷。例如，使用固相分离技术需要多个步骤和物理操作。许多这种过程的复杂性可以通过应用计算机驱动的仪器来降低，但某些问题仍然存在。随着操作过程复杂性的增加，可靠性等问题也将成为一种挑战。具体地说，不精确的水平对于高灵敏度检测将变得十分显著，其中现有流程的多级属性使精密性受损，包括液体的补充和去除以及多重洗涤步骤。在这些多阶段过程中的错误积累导致了这种不精确性。更进一步来说，这些过程的这种复杂性和劣势的后果是增加了需要完成该测试的仪器和软件的复杂性，导致了成本的增加、可靠性的下降，并增加了在这样一个系统中试图添加新检测的开发时间和困难度。
用于克服一些这样与异相免疫检测有关的问题的一种替代方法，是所谓的均相免疫测定。这种均相免疫测定可以在水溶液中使用一种或多种添加试剂却不需要分离和洗涤步骤来完成。这些均质免疫测定已经被认为得益于较高的测定精度和灵敏度，并在分析物检测领域做出极其宝贵的贡献。
然而，为了检测兴趣分析物，均质免疫检测需要抗体与其特定抗原结合事件的自我汇报，称为生物分子识别事件。这种自我汇报或结合事情的转导可以通过不同的方法来实现，例如，酶倍增免疫技术工艺(EMIT)依赖于分析物介导的溶液酶活性的抑制，而克隆酶供体免疫测定(CEDIA)通过从非活性组件中重建一个工作酶而形成酶活性来实现混合物样本中分析物的检测。在这方面有用的其它更近期的技术包括福斯特共振能转移(FRET)和其它的荧光扩增技术，如时间分辨荧光免疫测定。此外，还有使用具非常灵敏潜力的化学或生物发光报告的成功方法。
另一项在均相免疫测定中用于生物识别事件自我汇报的技术是邻位连接技术(PLA)系统。在这个系统中，对同一样品的不同表位具有亲和力的至少两个抗体被单链DNA的特定序列所标记。在与兴趣分析物结合后，两个抗体被聚集互相靠近。所吸附DNA序列的近端属性允许互补的一个或多个重叠的单链DNA探针结合。在添加的特定酶的帮助下，这种探针的末端可以接合或捆扎形成一个连续的环形DNA单链。通过对该序列的仔细设计，并添加聚合酶试剂，可以按照等温滚环扩增的过程出现DNA序列的扩增。这一操作的结果是在每个组合的分析物-抗体复合物表面发出一个不断增长的重复序列DNA链。将荧光标记加入不断增长的DNA聚合链可以对被结合引物总量进行定量测定，也因此测定了样本中分析物的含量。
均相免疫测定可能有潜力用于临床免疫分析。均相免疫测定相对于异相免疫测定有其优势，但也有局限性。
均相免疫测定的一个局限是得到首次结果的需要时间。对于一个可靠的测试来说，通常需要显著的分析时间来产生足够的可探测分析物，然而为达到在现代临床实验室的最佳应用，理想的检测时间需要在可行的范围内尽可能地短。
这种方法的更进一步，并且可能是更重要的局限性与临床实验室常用的仪器不能够轻易地测量荧光信号有关。在诊断的应用中得到了验证的现有临床实验仪器，往往要么可用于异质免疫测定，要么以临床化学分析仪的形式可用于光度法检测。这些分析仪的吸收光谱测量能力极为有限，并通常不适用于当前均相免疫测定所需要的汇报系统。
因此需要提供一个检测分析物的方法，它具有均相免疫测定技术的优点和光度法检测的方便及简易性，并允许一个适当短暂的操作时间。
发明内容
本发明提供了一种均相免疫测定方法，包括：
a)至少与2个分子接触，每个分子都由一个识别组件和一个样本的部分信息组成，其中的识别组件和样本接触会使得这个部分信息形成一个连续的信息；
b)将连续消息放大形成一个催化实体，再直接或间接地产生催化活性；
c)提供一个允许在至少两个分子和样本之间，通过催化活性检测识别事件的基质。
在催化实体/催化活性与识别事件之间存在的相关性形成了一个精确而灵敏的检测分析。
本发明也使依赖于核酸序列的转录并随之通过体外蛋白质的合成而翻译成工作酶的系统的有关缺点得到解决。在那个系统中试剂的数量、时间安排和潜在试剂的不兼容性方面的可能复杂性将是不切合实际应用的。此外，该测定可以产生一种能被现在的诊所里随手可得的化学分析仪器测定的彩色产物。
该测定的均质属性为其提供了较快速的分析过程，因为它不需要去除或分离任何的基质。进一步地，与依赖核苷酸扩增和荧光探针来生成信号(这可能需要长达2分钟的20-40个周期，比如在实时的聚合酶链式反应(PLA)中，为达到一个预定的背景信号。)的PLA和其他的方法不同，这种分析有一个额外的酶学步骤，由此认为可以使灵敏性增加若干倍，并因此需要更少的扩增周期就可以达到背景信号。
该测定最好只包括2个分子，每个都包括一个识别组件和一个部分信息。这样进行检测，所需要的材料可以降至最低。很明显这种分子的适当数量可能将依赖于被检测样本的属性和被检测的对象。
最好的识别组件选自蛋白质、抗体、抗体片段、分子印迹聚合物、互补性决定区、寡肽、低聚核苷酸、小分子有机化学物质、氨基酸肽、多肽、多核苷酸或适体。
将很明显的是，在每个分子上的识别组件可以相同也可以不同。例如，它们可以是针对同一种蛋白质的相同抗体，比如多聚体复合物或分子表面组成的一部分；或者，如果识别组件不相同，它们可以是比如兴趣靶抗体的一个抗原，和针对兴趣靶抗体的抗体。
由部分信息通过链接或某种方式的结合而产生连续的信息是可以理解的。部分信息的结合/链接可以直接或者也可能需要其他步骤来干预一个或多个信息分子也将是可以领会的。通过这种方式，由包含识别组件的分子的部分信息所促成的连续信息可以包括一个或多个链接的部分信息。因此，凭借增加一个或多个链接的部分信息可以选择性地形成连续信息。
通过核酸(例如DNA或RNA)可以方便地组成或形成部分信息，它们可以是相同或者不同的。
部分信息可以很方便地由单链DNA形成，但也可以一种类似物如PNA(肽核酸)所组成。
在这方面，由多核苷酸(特别是单链DNA)形成的部分信息，在适当的条件下可以被诱导相互退火或杂交使之形成一条连续的信息。
更适宜的连续信息是由等温扩增形成的。由于避免了热循环，这种形式的扩增，减少了需要由检测操作者完成的步骤，同时意味着不需要昂贵的专用设备就很容易地进行检测。
等温扩增是方便的滚环扩增方法。滚环扩增可以比其他形式的扩增更加灵敏、快速。此外，它不需要热循环，而热循环对于当前大多数的临床化学分析仪来说都是不可能的。
检测还可以有选择性地包括在连续信息扩增之前的接合步骤。采用这种方法，一个包括一种扩增的缺口序列的信息可能更容易在检测中使用。例如，如果连续的信息是由非环状的信息组件组成的单链DNA，那么可以采用标准的DNA连接反应来环化相关组件。作为另一个更进一步的例子，在其实施方案中部分信息的连接被添加而形成连续的信息并通过滚环扩增来放大，需要接合步骤来环化连续的信息并确保扩增的进行。对于熟悉接合实施方法的技术领域的技术人员来说这是很明显的。
催化实体对基质的直接或间接地适宜影响产生可见的检测产物。然后这种可见的检测产物可以由检测的操作者或者不借助仪器地进行观察，或者通过合适的仪器(如分光光度计或比色分析仪)进来分析。另外，依照所用仪器的具体性能，也可以包括通过使用合适的基质催化形成荧光或化学发光产物。
检测产物可选择性地或者通过荧光、磷光或者通过化学光而发光。
检测产物是方便可见的彩色。已经被发现用于生成有色产物的酶包括β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶，将合适的显色底物加入其中可以显示催化活性的程度，而其将与溶液中分析物的含量相关联。
适宜的催化实体包括DNA(单链DNA或者双链DNA)、核糖核酸或多肽。
适宜的催化实体可以是DNA(单链DNA或双链DNA)，核糖核酸或多肽。如果催化实体是一个多肽，而且连续信息是DNA或者核糖核酸，那么将需要对连续信息进行翻译。
在同一种或另一种实施方案中该测定还包括不位于作用范围内的两个互补催化活性亚基。因为它们在空间上被一个适宜的间距组件(比如：多肽或多核苷酸)分隔或者因为它们需要一个合适的连接组件或它们彼此之间的自然亲和力有限，所以这些亚基可以处于非作用范围。
至少两个互补的催化活性亚基被催化实体带进作用范围内。如果亚基是被一个适当的空间组件分隔，催化实质就充当一个纽带将亚基连在一起；如果亚基需要一个合适的连接组件，催化活性就充当一个连接组件。
举例子说明，催化活性的产生可以通过非活性亚基被一定长度的互补单链DNA标记，以至于所需的亚基固定于催化实体而出现。这样，每个催化实质通过发生一个邻位结合(见图4说明)都将可能触发一个新的酶单位。
催化剂的每个互补催化活性亚基的内部相互亲和力都很低，这样最好，使得新产生的催化活性在一定限度内完全由分析物的存在而驱动，而不是取决于默认背景个体催化亚基的重组。
相应地，这种实施方案使得不完全催化亚基的被引导组合，从而重新产生催化活性。
至少的两个互补催化活性亚基最好是一种脱辅基酶和辅助因子。
在一种实施方案中催化实质是一种脱氧核酶。脱氧核酶不需要翻译或转录来产生催化实质，因此减少了分析所需要的基质和首次结果的消费时间。
脱氧核酶最好包括一个G-四链体或者是以G-四链体为基础。相应地，连续的信息最好包括一个G-四链体DNA的反义信息。
脱氧核酶最好是G-四链体。虽然可以使用不同的脱氧核酶，但构成G-四链体单位的序列尤其适合于那些低分子量的情况，并因而可以轻易地容纳在环形RCA(滚环扩增)的DNA模板有限范围内。所述序列的重复形成会导致G-四链体单位的重复自我组装、与连接部分交织在一起。最近有人发现，G-四链体单位积极地结合额外的氯高铁血红素分子，而产生一种具高效过氧化物酶活性的产物。
这种由一个或多个结合了氯高铁血红素、并具有过氧化物酶活性的G-四链体组成的脱氧核酶可能被认为是一种细胞凋亡-脱氧核酶，因而血红素因此可能被认为是一种辅助因子。
催化活性最好是过氧化物酶活性。
方便测定，可以引入氯高铁血红素。氯高铁血红素和基质溶液可以很方便地暴露于G-四链体。在氯高铁血红素存在时，G-四链体具有一种过氧化物酶活性，将会使基质，例如ABTS(2，2联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])或TMB(四甲基联苯胺)，产生一种可以被探查的可见颜色。检测到的颜色最好与识别事件之间存在线性相关关系。
基质最好由ABTS和/或TMB组成。
部分信息可以方便地由任意一个或多个序列号1、2和3的核苷酸序列或者是一个同系物或者是其功能片段组成。
选择性地可以一个部分信息包括序列号1的核苷酸序列；而另一个部分信息包括序列号3或2和3的核苷酸序列，或者包括一个同系物或其功能片段。
选择性地可以一个部分信息由序列号1的核苷酸序列构成；而另一个部分信息由序列号3或2和3的核苷酸序列，或者由一个同系物或者是其功能片段构成。
通过滚环扩增和编码G-四链体单位的信息序列的一个特定结合，就有可能由每个生物识别事件产生倍增的过氧化物酶活性。而随后过氧化物酶的活性可以通过使用任何一定数量的显色过氧化物酶基质(例如，ABTS，TMB，但不局限于这两种)，以及其他的新型基质来检测。随后由此产生的有色产物可以利用光学方法来测定，而分析物的最终浓度可以通过参照一个适合校准曲线来计算。
通过直接加入一个酶学步骤来放大被检测组件的这种方法，使得本发明的分析系统更加灵敏，并与现行的实验室操作指南相比缩短了检测处理时间，比如与邻位连接技术相比，例如其中在测量荧光团的加入时不需要额外的酶扩增步骤，但后者需要。
本发明的另一个方面，是提供了一种检测样品中分析物的方法，该方法由一个所描述的测定组成，其中至少有两个分子与分析物之间直接或间接地发生所识别的事件。
分析物可以是一种蛋白质、肽、多肽、抗原抗体、抗体片段或兴趣代谢物。
专业技术领域内的专业人员会理解这里所描述的测定和方法可以通过不同的方式、依照不同的原则来完成。
附图说明
本发明现在将参考下面的例子来说明，这些例子和所附图纸都无意于限定本发明的应用范围。其中：
图1描述了一个目标(分析物)/识别分子/连续信息结构的例子。在图1列举的这个例子里样本中被检测的靶(分析物)分子由链亲和素代表，(至少的)2个分子的识别组件均由生物素代表，一个部分信息由锚和模板复合物代表(或者可以被认为是模板或模板的相关部分)而另一个部分信息由引物代表(或者可以被认为是引物的相关部分)。在图la中，由模板代表的部分信息(组件)不是环形的(有一个缺口)。图lb描绘了一个稍微不同的情况，其中模板没有缺口而是连在一起的(环形)。
图2和3显示了运用本发明检测样本中存在的链亲和素的典型测定结果。图中显示了不同浓度的氯高铁血红素(在此例中图2是IμM，图3是47μM)可以产生不同的检测灵敏度。图2和图3的X轴显示所研究的相关链亲和素浓度(用pmol表示)，而Y轴显示吸光度的百分比变化。图2和3显示了与不含有链亲和素的对照组所获得的平均吸光度相比，整个相关样品的吸光度相对于平均相对变化的变化。
图4描述了对非活性亚基的指导装配来重新产生酶活性。
具体实施方式
例1：均相测定形式的示范
材料：
生物素结合引物：
生物素/三甘醇5’GT GGA GGG TC 3’
(引物序列，SEQ 1：TGT GGA GGG TC)
生物素结合的锚DNA：
5’CTG ACA GGG ACG GGA AGA AAA GG3’C6/生物素
(锚的序列，SEQ 2：CTG ACA GGG ACG GGA AGA AAA GG)
模板DNA：
5’CCA CAT TTT AAG GAT TTT CCT TTT CTT CCC GTC CCT GTC AGC TGA ATT CGT
GTG AGAC CCT3’磷酸
(模板序列，SEQ 3：CCA CAT TTT AAG GAT TTT CCT TTT CTT CCC GTC CCT GTC AGC
TGA ATT CGT GTG AGAC CCT)
引物和锚的DNA与生物素的结合是为这个范例而设计的，并可以通过如IDT等公司的商业来源而获得。
模板DNA是为本范例而设计/选择的。模板序列包括一个G-四链体DNA的互补信息。
本范例中的模板DNA含有3’磷酸来减少自发的链接。专业领域内的技术人员将认识到这个磷酸化并不总是必要的，而且，如下面将要进一步讨论到的，得到一个环形的模板可能是理想的。
具有与上述结合生物素的引物和结合生物素分子的锚相类似结构的产品，它们自己可能每一个都代表一个由识别组件(例如生物素)和部分信息(例如：锚/引物)组成的分子。或者，由识别组件和部分信息组成的任一个分子都可能是广泛存在的(像这里所描述的关于生物素结合的锚/复合模板)，其中的部分信息可以被认为是由一个以上的组件组成，例如锚和模板。此外，在这个实例中很明显地也可以将模板自身认为是一个部分信息。
相应地，举例说明形成一个由识别组件和部分信息组成的主体分子，用水将模板DNA稀释到2pmol/l后与等量的生物素结合锚混合，并在70℃孵育1分钟(也可以使用另一个温度，该温度适合降低潜在二次结构的形成，却不造成识别元素变性)。然后冷却该混合物以促进模板和生物素结合锚的结合/杂交。从而导致一个稳定的生物素锚-模板DNA复合物的形成。
方法：
在样本存在时，一个连续信息的形成。
链亲和素，代表一个待测样品内的靶目标，被稀释成0到50pmol之间的各种浓度。
将10μI等份的链亲和素添加到反应管中。在这些反应管中也添加20μl的生物素-锚/模板DNA复合物。然后将反应混合物在室温下孵育5分钟使生物素-锚/模板DNA复合物与链亲和素结合。
10μI的生物素标记的引物被添加到每个试管中，并在充分混合后在室温下孵育5分钟，利于生物素与链亲和素的结合，并由此形成一个连续的信息复合物，如图la/b中所示。
正如上面所讨论的，虽然为了本范例，连续信息的形成程序按描述的方式完成。但对于专业人员来说，很显然同样可以利用一系列的替代方法。例如，将信息直接结合到两个生物素识别组件(比如，象图la和b中所显示的锚和引物所代表的那样)上可以直接互动，或者可以采用更广泛地/删除部分信息，包括，例如象图la和b所描述的那样的模板。
因此，通过这个例子中我们可以理解当DNA链被两个生物素分子与链生物素的结合而带得很近时，作为一个部分信息的一部分的一段重叠DNA(模板)可以结合到另一个部分信息上而形成一个连续信息。在这个例子中，代表一个部分信息的引物与模板(代表(或部分的)另一个部分信息)相结合而形成一个连续的消息。
该模板DNA可以通过它的3’和5’端的结合而环化，也可以不环化(如图la/b所示)。在这方面，专业技术人员将会理解依照所选部分信息的属性，在连续信息的扩增之前一个结合步骤(如下文所描述的)可能是适当的。对于一个环状模板来说，例如图lb和其他相关信息所显示的那样，可以避免结合步骤将是很好理解的。然而在本例中使用了结合步骤。
结合反应
将10OμI的连接酶混合物(5μl的连接酶缓冲液+0.5μl(1000单位)的T4DNA连接酶(例如New England Biolabs的M0202试剂)+4.5μl的水)加入到每个反应试管中，反应混合物在室温下孵育2到10分钟以便使相关的多核苷酸(在本例中是模板)两端之间的缺口关闭。
很显然，链亲和素/生物素相结合的伙伴关系是做为一个例子来说明将链亲和素作为一个目标分析物来探查的当前范例，但是专业人士将明白待检测的识别事件同样可以在任何其他的结合伙伴关系之间发生，例如抗体(或抗体的片段等等)和蛋白质/肽等，使兴趣目标分析物得以被检测。此外，测定相关的识别组件可以不尽相同，使得可以发生不同的结合相互作用。
扩增连续消息从而形成一个催化实体。
将10μI的聚合酶混合大师(提示：热灭活的聚合酶被用作对照液)添加到每个反应管中。然后将反应混合物在30℃孵育30到270分钟，使信息得以扩增。聚合酶混合大师包括
Figure BDA0000153983200000101
(10单位)的phi29DNA聚合酶(例如，由New EnglandBiolabs公司所提供的M0269试剂)，
Figure BDA0000153983200000102
的聚合酶缓冲液，5μl的dNTPs和3μl的水。
在这个例子中，模板DNA序列包括一段G-四链体DNA的反义信息。因此，如图la/b所显示的一个复合物形式的连续信息，通过滚环扩增放大后产生一个自发形成的串联G四链体结构的连续DNA多核苷酸。添加的氯高铁血红素与G-四链体结合产生了一个具有过氧化物酶活性的结构。
很显然，专业领域的专业人员可以使用在本例中所提到的不同序列的部分信息。例如，可以改变模板信息组件来产生不同的G-四链体DNA。
检测识别事件
在DMSO中稀释氯高铁血红素原液至0.5mM。进一步将氯高铁血红素溶液(使用0.1M的Tris-HCl缓冲液，20mM的MgCl2，0.05％的曲通X-100)的浓度稀释至330μM待用。然后将适量的330μM氯高铁血红素加入反应管中来达到所需的最终浓度(在本例中为IμM或47μM)。使用不同浓度的氯高铁血红素完成实验来改变检测范围。然后将反应混合物在室温下孵育达2小时，再转移到一个96井微量板上并加入100μI的TMB基质溶液。添加100μI的0.25M硫酸使反应停止之前，在室温下孵育5至45分钟允许反应的发展。然后在450nm处读取吸光度。
从显示的数据可以看出，在反应混合物中氯高铁血红素的最终浓度的变化可以提高分析的灵敏度(见图2和3，在图2的测定中使用IμM的氯高铁血红素，而图3则使用47μM的氯高铁血红素)。
图2和图3显示了上述实验的典型结果。给出的吸光度数据代表了与由不含链亲和素的对照组所获得的平均吸光度相比，整个相关样本的平均相对变化。
因此可以理解，这个例子中的测试原理是，当一个由G-四链体的反义序列组成的连续信息形成时所启动的由扩增而形成的G-四链体复合物，在有氯高铁血红素存在时，产生了可以分解TMB而产生一种可以通过检测吸光度而测定的彩色产物的过氧化物酶活性。
虽然为了本例的说明，测定方法采用一种分期的方式展开，然而对于专业人士来说很明显，各个步骤可以被同时执行来降低首次结果所需的时间。此外，该法可以在用于检测识别事件的同一个容器中完成。
例2：由标记的单链DNA绑定组件的免疫复合物的形成。
已知对自身抗体具有免疫反应的一种环肽(属于下列的结构1)在这项检测中用做两个结合组件之一，它的存在对早期类风湿关节炎有诊断意义，在其N-端存在一个经修饰的单链DNA序列。将22pM的这一肽溶液加入到从已知阳性的样品中取得的含有抗体的血清样本，并孵育10到12分钟后使之与样本的抗体产生可被免疫测定方法测定的结合。
进一步结合定组件，这次将含有大量过剩摩尔的针对Fc区域(Serotec公司提供)的经修饰的抗人IgG抗体溶液加入到混合物中，并在室温下孵育15到20分钟。这种抗体通过在其Fc部分共价链接一条单链DNA链进行修饰。
三元络合物的检验通过使用绑定于磁珠表面的抗鼠IgG特异抗体的免疫测定来获得，将三元络合物从混合物中被分离出来并允许与共价关联了和环肽上单链DNA链互补的单链DNA链的碱性磷酸酶发生反应。以1.5mM的磷酸对硝基苯酯洗涤后，随后暴露于100mM的二乙醇胺缓冲液中，产生着色的产物并在450nm处读取信号，与不含阳性血清的实验对照相比来证实阳性的结合结果。
结构1
Figure BDA0000153983200000121
X＝NH2，CH3，HCH3或N(CH3)2；
Y＝O，NH，NHCH3或N(CH3)2；
Z＝O，NH或CH2，和
N＝2，3或4，
当X＝NH2时，Z＝NH，Y不是NH，和修饰的精氨酸残基残留。对于瓜氨酸，X＝NH2，Y＝O，Z＝NH和N＝3。
结构1：顶部结构是一个代表性的氨基酸序列中出现的修饰精氨酸(X)侧链。
例3：显示单链DNA序列的近端构型和连接。
通过连接酶产生的单链DNA序列来检测三元免疫复合物。
为在三元络合物中确定可连接序列的存在，将连接混合剂添加到含复合物的混合液中，再通过免疫测定法验证复合物。
连接混合剂含有连接酶、一种连接模板、和三磷酸腺苷。(连接混合剂：体积5L，含50mM的KC1，10mM的Tris-HCl缓冲液(pH值为8，3)，3mM的MgCl2，0.8mM的三磷酸腺苷，20nM的连接模板，3Weiss单位的T4DNA连接酶)。将其加入免疫复合物混合液中并等待5分钟以利反应进行，然后在85℃下热处理10分钟使之灭活。
为了说明本示例，连接序列的检测采用聚合酶链式反应方法(PCR混合剂(TaqMan PCR)：体积30L，含50mM的KC1，10mM的Tris-HCl缓冲液pH值为8.3，0.4mM的MgCl2，0.33mM的dNTPs，lx缓冲液A，1μM的前引物，1μM的反向引物，83nM的TaqMan探针，1.56单位的扩增低拷贝DNA金牌聚合酶(Perkin-Elmer)。扩增/检测混合剂含有PCR引物，TaqMan探针，dNTPs和DNA聚合酶。
扩增探测混合剂探针Ale：(SEQ4：)
TACTCAGGGCACTGCAAGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTATGTGGTCTATGTCGT
CGTTCGCTAGTAGTTCCTGGGCTGCAC
探针A2c(SEQ 5)
TCGAGGCGTAGAATTCCCCCGATGCGCGCTGTTCTTACTCAGGGCACTGCAAGCAATTG
TGGTCCCAATGGGCTGAGTAT
用于连接的夹板模型(6+20)：(SEQ 6)
GGGGGAATTCTACGCCTCGAGTGCAG
前引物(SEQ 7，序列标识号：4的核苷酸44-65序列)：ATGTGGTCTATGTCGTCGTTCG反向引物(SEQ 8；SEQ 5的核苷酸22-41反向互补序列)：
TGAGTAAGAACAGCGCGCAT
Taq Man探针Al+2c(SEQ 9；SEQ 6的反向互补序列)：氟-CTGCACTCGAGGCGTAGAATTCCCC-四甲基罗丹明
 PCR程式如下：保持95度10分钟，95度(15秒)至60度(1分钟)循环45次，组合使用连接混合剂和Per Mix以达到更高的灵敏度。
例4：只有一个结合位点的被分析物的竞争性邻位探测
为了广泛的应用，需要给只有一个结合部分的分析物提供一个解决方法。这可以通过使用一种竞争性测定的方法来实现。其中，一定量纯化的分析物自身共轭于一种核酸，而已经存在的结合部分共轭于另一种反应性核酸。当允许这两种共轭形式在一种含有未知含量分析物的样本混合物中反应时，样本中未知含量的未共轭分析物将竞争结合邻位探针的结合部分因而降低共轭核酸反应的概率。在本范例中，反应信号与分析物含量成反比。
例5：可供选择的试验材料制备和操作方法。
环形DNA模板的制备：采用下列方法制备DNA模板：首先，使用溶于快速连接试验盒缓冲液中的
Figure BDA0000153983200000141
的T4多核苷酸激酶，3.6x 10″5M的连接模板(5’-TTAGGATCGTGTGGTT-3’(SEQ 11))，在37℃下孵育30分钟磷酸化6x10″6M的线型DNA(5’-GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACAC-3’(SEQ 10))。使用生产商提供的试验方案，采用快速连接试验盒完成合成过程。在90℃下加热10分钟变性各种酶类。然后使用一种Centricon滤过仪(10，000转切断，Millipore Inc.)，用8M的尿素将连接的环形DNA从连接模板中分离、提纯。
RCA分析：使用固定浓度的4，2x 10″7M的发卡型和2，2x 10″8M的环形结构的DNA。包括0.4单位
Figure BDA0000153983200000142
的Klenow结构外聚合酶和0.2mM的dNTPs。RCA过程在由50mM、pH值为7.5的Tris-HCl液，10mM的MgCl2，1mM的DTT和50g/ml的BSA组成的缓冲液中进行。
可供选择的吸收试验研究的条件如下：试验在一种由下列试剂组成的溶液中完成；氯高铁血红素，4x 10″7M；H202，4.4x 10″5M；ABTS2-，1.82x 10″4M溶于一种由25mM的HEPES，20mM的KC1和200mM的NaCl组成的pH值为7.4的缓冲液中，试验温度为25℃。再通过分析415nm处吸光度的变化来监测ABTS2-的氧化速率。

Claims (19)

1.一种均相测定，包括：
a)至少与2个分子接触，每个分子由一个识别组件和一个样子的部分信息组成，其中识别组件和样本接触会使得这个部分信息形成一个连续的信息；
b)将连续消息扩增形成一个直接或间接地产生催化活性的催化实体；
c)提供一种允许在至少两个分子和样本之间，通过催化活性检测识别事件的基质。
2.根据权利要求1的测定，其中，每个识别组件由任何一个抗体、抗体片段、蛋白质、分子印迹聚合物、互补决定区、寡肽、寡核苷酸、小分子有机化学物、肽、多肽、多核苷酸或适体组成。
3.一种根据权利要求1或2的测定，其中，连续信息的形成是依靠添加一种或多种连接的部分信息。
4.一种依照之前所有权利要求的测定，其中，部分信息由单链DNA或一个其类似物组成或构成。
5.一种依照之前所有权利要求的测定，其中，连续信息通过等温扩增方式扩增。
6.一种根据权利要求5的测定，其中，等温扩增采用滚环扩增方法。
7.一种依照之前所有权利要求，在连续信息的扩增之前还包括一个连接步骤的测定。
8.一种依照之前所有权利要求的测定，其中催化实体对基质的直接或间接作用产生了一种可见的检测产物。
9.一种根据权利要求8的测定，其中，可见的检测产物是彩色的。
10.一种根据权利要求1至7的任何权利要求的测定，其中，催化实体对基质的直接或间接作用产生一种通过荧光、磷光或任何化学光而发光的产物。
11.一个依照之前所有权利要求的测定，其中催化实体包括(或选取)DNA、RNA或一条多肽。
12.一个依照之前所有权利要求的测定，其中，催化实体是一种脱氧核酶。
13.一种根据权利要求12的测定，其中，脱氧核酶包括一个G-四链体或是以G-四链体为基础。
14.一种根据权利要求4至12的任何权利要求的测定，其中，部分信息包括任何一个或多个序列号1、2和3的核苷酸序列或者是一个同系物或其功能片段。
15.依照权利要求13或14所述的测定，进一步包括氯高铁血红素引入的测定。
16.依照权利要求1至11所述的测定，进一步由至少两个位于非作用范围内的互补催化活性亚基组成的测定。
17.一种根据权利要求16的测定，其中，至少两个互补催化活性亚基是由催化实体带进作用范围内。
18.一种根据权利要求16或17的测定，其中至少两个互补的催化活性亚基是脱辅基酶和辅酶。
19.一种在样本中探查一种分析物的方法，该方法由一种依照直接或间接地发生在至少两个分子和分析物之间的已知事件的任何前述权利要求的测定方法组成。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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