CN103276087A - 高灵敏度的蛋白检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高灵敏度的蛋白检测方法，任选以下一种方式：方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测。具体为：使用单克隆抗体pab240，从而建立P53蛋白（P53蛋白突变体）、cTnI蛋白的PLA检测。本发明的方法将抗体固定在PCR管上进行蛋白质PLA检测的方法，检测的过程中不再需要磁珠，摒弃了由于使用磁珠所导致的缺陷，并且对蛋白质的检测灵敏度也有了极大的提高。

Description

高灵敏度的蛋白检测方法

技术领域

本发明涉及一种高灵敏度的蛋白检测方法。

背景技术

邻位连接检测（proximity ligation assay,PLA）技术是2000年以后由Fredriksson等以后发展起来的一种蛋白质检测技术。最初，PLA技术所用的探针也可以是一种被称为核酸适配子(aptamer)的DNA单链。该核酸适配子是通过一种体外筛选方法筛选而获得的，可与靶分子高特异性、高亲和力地结合，从而起到识别目的分子的作用。核酸适配子合成简单，储存容易，目前已被广泛应用于基础研究、诊断、治疗试剂的研制及药物筛选等领域。但目前能够用于PLA技术的核酸适配子种类有限，这大大限制了核酸适配子在该技术中的应用。

目前，PLA技术已经得到了较大的发展。用PLA检测蛋白质，一般首先将不同的DNA单链分别与蛋白质识别分子相结合，形成PLA探针。PLA探针和样品温育后，2条含有不同DNA序列的PLA探针会同时结合到同1个待测蛋白质分子上。这时，2条探针的DNA尾部在空间上紧密靠近，在过量的互补连接序列和DNA连接酶的作用下，2条探针DNA尾部的游离5’端和3’端发生连接反应，形成1个环状的蛋白质-蛋白识别分子-单链DNA复合物。连接而成的单链DNA量和样品中待检测蛋白分子的量正相关。用实时荧光定量PCR对复合物中的单链DNA部分扩增，即可对连接复合物中的蛋白质进行定量检测。该技术综合了抗原抗体结合的高特异性和实时荧光定量PCR技术的高灵敏度等多方面优势, 使对蛋白质的检测转变为对DNA的检测，实现了痕量蛋白质的分析。

抗体（包括单抗、多抗、重组单链抗体）是使用最广泛的蛋白质特异性识别分子，可以用化学共价结合法和生物素法，将DNA单链与抗体结合，制备出抗体-单链DNA复合物，作为探针用于PLA反应。化学法是利用双功能交联试剂4-[p-maleimidophenyl] butyrate (SMPB)将抗体与巯基修饰的DNA单链相结合；生物素法则是利用链亲和素(streptavidin)与生物素(biotin)之间的高亲和力，先将马来酰亚胺修饰的链亲和素与巯基修饰的DNA单链结合，形成链亲和素-单链DNA复合物，经纯化除去游离的链亲和素以及游离的单链DNA后，链亲和素-单链DNA复合物可直接与生物素修饰的抗体按1：l的比例在室温下结合，无需进一步的纯化，便可形成终产物抗体。但这两种方法用于PLA探针的制备，过程都很复杂，成本高，耗时长。探针的难以制备也限制了PLA的广泛使用。

经过10多年的发展，PLA技术已经迅速应用到细胞因子、肿瘤标志物检测、蛋白质功能研究等领域。根据其检测的方式，可以分为液相PLA和固相PLA两大类。

液相PLA是指蛋白质和探针的识别、DNA的连接和定量PCR都在同一液相中，不需要洗涤的步骤。这种方法样品用量少，只需要1ul，无需洗涤，检测快速。但对于血清等复杂样品，由于其中可能含有DNA连接酶和DNA聚合酶的抑制剂，以及样品用量太少，会造成结果误差大和不稳定等情况，难以得到推广应用。

固相PLA是指将抗体固定在磁珠上，以此作为固相用于从样品中捕捉靶蛋白，并通过洗涤，将靶蛋白从样品中分离出来用于PLA的检测。固相PLA方法可以将靶蛋白从血清等复杂样品中分离出来，并起到浓缩作用。通过洗涤步骤，可以去除杂质，保持检测的灵敏度和特异性。因此，固相PLA方法的实用性更强，已用于白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、前列腺特异抗原（PSA）等细胞因子的检测，检测灵敏度一般可以达到0.1 pM以上。因此，就可操作性来说，利用磁珠的固相PLA比液相PLA方法要好。但磁珠固相PLA也存在一些问题影响它的使用。首先，由于磁珠的存在，在进行荧光定量PCR时，磁珠会造成本底升高从而影响检测的灵敏度；其次，在洗涤过程中，并不是所有的磁珠会被磁力架捕获，每次洗涤磁珠都会减少一些，影响检测的灵敏度，结果误差较大，稳定性较差；另外，磁珠的洗涤技术要求高，需要磁力架等设备，难以快速洗涤，过程缓慢，难以实现样品高通量检测。这些问题都影响了固相PLA的推广和使用。

因此，虽然PLA作为一项新的蛋白质检测技术，具有很高的灵敏度，但其也存在着很多问题影响它的使用，难以用此方法生产出产品用于疾病等领域的检测，服务社会。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的蛋白检测方法，该方法将抗体固定在PCR管上进行蛋白质PLA检测的方法，检测的过程中不再需要磁珠，摒弃了由于使用磁珠所导致的缺陷，并且对蛋白质的检测灵敏度也有了极大的提高。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高灵敏度的蛋白检测方法，任选以下一种方式：

方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：

蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；

方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：

蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测。

作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的改进：使用单克隆抗体pab240，从而建立P53蛋白（P53蛋白突变体）、cTnI蛋白的PLA检测。

作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：方式一的直接包被法为依次进行以下步骤：

1）、在每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2.5小时后，PBST缓冲液洗涤；

2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液180~220 ul（较佳为200 ul），36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去BSA溶液，23~27℃烘干（置4 ℃备用）；

3）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时；从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物；

将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，CATALOG # AF1355），从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；

探针DNA1:

5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；

探针DNA2:

5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATATGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；

4）、检测时，在步骤2）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放置20~40分钟（较佳为30分钟）后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul PLA探针，室温温浴20~40分钟（较佳为30分钟）；温浴后用PBST缓冲液洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测；

上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：

在含有浓度为50×10^-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）1000 ml中加入2.5×10^-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10^-6mol，80×10^-6 mol ATP，互补DNA0.1×10^-6 mol，dNTPs 0.2×10^-3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。

作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的另一种改进，方式二的交联剂固定法为包括以下步骤：

1）、定量PCR管中加入交联剂溶液40~60 ul （较佳为50 ul），36~38℃放置4.5~5.5小时（较佳为37 ℃放置5小时）后，用去离子水洗涤（目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；

2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2.5小时后，PBST缓冲液洗涤；

3）、在步骤2）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液180~220 ul（较佳为200 ul），36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去BSA溶液，23~27℃烘干（置4 ℃备用）；

4）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时；从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物；

将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，CATALOG # AF1355），从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；

探针DNA1:

5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；

探针DNA2:

5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATATGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；

5）、检测时，在步骤3）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放置20~40分钟（较佳为30分钟）后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul PLA探针，室温温浴20~40分钟（较佳为30分钟）；温浴后用PBST缓冲液洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测；

上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：

在含有浓度为50×10^-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）1000 ml中加入2.5×10^-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10^-6mol，80×10^-6 mol ATP，互补DNA0.1×10^-6 mol，dNTPs 0.2×10^-3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。

作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：步骤1）中的交联剂溶液为：体积浓度为0.5~5 ％的戊二醛溶液。

作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：步骤1）中的交联剂溶液为：体积浓度为1％的戊二醛溶液。

在本发明中：

DNA1是5’端生物素化，DNA2是3’端生物素化，而且5’端是磷酸化的。

本发明的发明思路和原理如下：

PCR反应过程中要经历90℃以上的高温，因此定量PCR管大多由聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯这些耐高温材料制成。发明人发现，用这些材料制备出的定量PCR管，虽然对蛋白质的吸附能力较低，但也能用此替代磁珠固定抗体，用于管壁固相PLA方法。本发明将抗体通过物理吸附，直接固定到定量PCR管壁上的方法，称为直接包被法。

A:用直接包被法进行管壁固相PLA：

Tp53基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，其产物P53蛋白通过多种途径抑制肿瘤的发生。大量的研究表明，约50％的肿瘤病人，其P53蛋白发生了突变，有些肿瘤100％的病人P53蛋白发生突变。因此，突变型P53蛋白是很好的肿瘤标志物。但是，突变型P53蛋白是由肿瘤组织产生的，前期微小的肿瘤只能分泌及其微量的突变型P53蛋白到病人血清中。目前国际上最好的商业化的突变型P53蛋白ELISA检测试剂盒的检测灵敏度约为150 pg/ml，这基本已经达到了ELISA检测方法的灵敏度极限。但如用于早期肿瘤的筛查，肿瘤复发、转移的检测，其灵敏度还是远远不够的。高灵敏度的血清突变型P53蛋白检测试剂的开发是一个世界性的难题。

P53有很多种突变体，本发明中用R175H这种突变体作为标准品，特异性识别P53蛋白突变体，但不识别野生型P53蛋白的一种单克隆抗体pab240，从而来建立P53蛋白突变体的PLA检测。因为p53蛋白突变后，就会发生构象的变化，暴露出氨基酸213-217 (RHSVV)这个抗原表位，抗体pab240就是识别这个表位。P53蛋白还有其它突变体如R248W、R273H、R282W、G245S等等，都可以被pab240识别（备注说明：P53突变体可能有几百种，目前已知大部分的突变体都能被pab240识别，pab240已经成为检测是否存在P53突变体的最常用的抗体）。当然也包括其它单抗可以识别其它类型的突变体。但是pab240是最常用的用于检测P53蛋白突变体的抗体。

结果：

证实直接将P53蛋白突变体的单克隆抗体包被在PCR管壁上，可以用PLA方法检测突变型的P53蛋白。其检测灵敏度和用磁珠的固相PLA方法相差不大，都达到1 pg/ml。但是由于检测过程中无需磁珠，洗涤过程简单快速，结果重复性好，成本也降低很多。用这种方法检测P53蛋白突变体，比用磁珠法固相PLA更具有实用性和可操作性。

B：交联剂固定法：

发明人继续研究增加抗体在PCR管壁上的包被量对PLA检测蛋白质灵敏度的影响。戊二醛是实验室常用的组织固定剂，该分子两端为化学性质活泼的羰基，易与其他分子产生共价结合。定量PCR管壁被戊二醛活化，从而戊二醛结合，而戊二醛上的另一个羰基可以和包被的抗体结合。这样，抗体就可以通过戊二醛与PCR管共价结合，不但抗体和管壁的结合更牢固，不会在洗涤过程中脱落而影响检测结果，而且同样面积的PCR管壁上结合抗体分子更多，更有利于增加检测的灵敏度。

我们用专一识别P53蛋白突变体的单克隆抗体PAB240包被在定量PCR管上，实现了用PLA方法高灵敏度检测P53蛋白突变体。

结果：PLA方法和美国Oncogene公司ELISA试剂盒（Cat# QIA03）方法检测P53蛋白突变体，PLA的最低检测限为0.01 pg /ml，ELISA的最低检测限为50 pg/ml，PLA的灵敏度比ELISA高5000倍。

在发明过程中，发明人还选用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物), SMCC【 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯】等交联剂用于将抗体固定在PCR管壁上，但优选戊二醛，因其成本低，效果好，使用方便。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的管壁固相PLA方法原理示意图；

图2为管壁固相PLA和ELISA方法检测P53蛋白突变体的比较图；

图2中，■代表PLA（本发明），▲代表ELISA；

图3为用直接包被法管壁固相PLA技术检测野生型和突变型P53蛋白的对比图；

图3中：■代表突变型P53蛋白，▲代表野生型P53蛋白。

图4 为交联剂固定法进行管壁固相PLA检测野生型和突变型P53蛋白的对比图；；

图4中：■代表突变型P53蛋白；▲代表野生型P53蛋白。

图5是EDC作为交联剂处理PCR管后对突变型P53蛋白的检测效果图；

图6是SMCC 作为交联剂处理PCR管后对突变型P53蛋白的检测效果图；

图7是交联剂固定法的管壁固相PLA法对心肌肌钙蛋白cTnI的检测效果图。

具体实施方式

实施例1、一种高灵敏度的蛋白检测方法，采用方式一的直接包被法进行管壁固相PLA，具体为依次以下步骤：

1）、在每个定量PCR管中加入0.1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul，于4℃放置12小时后，用PBST缓冲液洗涤3次（每次的用量为200 ul）；洗涤的目的是让没有结合在管壁上的抗体被洗掉。

2）、在上述包被抗体的每个定量PCR管（即步骤1）所得的每个定量PCR管）中加入浓度为10g/L的BSA溶液200 ul， 37 ℃放置2小时后弃去BSA溶液，25 ℃烘干后置4 ℃备用；在4 ℃的保质期可以达到6-12个月。

3）、浓度为100 纳摩尔/升的生物素化的两个单链DNA（探针DNA1和探针DNA2）各 100微升，分别各自进行如下内容：

以摩尔比为1：1的比例，与100微升浓度为100 纳摩尔/升的链酶亲和素溶液混匀，25℃ 1小时后，分别制备得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物。

上述探针DNA1-链霉亲和素偶联物以及探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：

分别以1：1摩尔比的比例与200微升浓度为50纳摩尔/升的生物素化的p53蛋白多克隆抗体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，CATALOG # AF1355）混合，从而分别得到PLA探针1和PLA探针2；浓度均为25纳摩尔/升。

探针DNA1:

5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；

探针DNA2:

5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATATGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；

4）、将偶联了正常P53蛋白（野生型P53蛋白）多克隆抗体（也可以结合突变型P53蛋白）的免疫磁珠加入到无突变型P53蛋白的正常人血清中，吸附过夜后取出磁珠。通过这种方法得到了不含野生型及突变型P53蛋白的阴性血清。当然，也可以直接选用不含野生型及突变型P53蛋白的阴性血清。在这种处理后的血清中，加入不同浓度的突变型P53蛋白，配制成含有0 pg/ml、0.01 pg/ml、0.1 pg/ml、1.0 pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml、1000 pg/ml、10000 pg/ml的突变型P53蛋白标准品。

检测时，步骤2）中处理好的PCR管中加入50ul的不同浓度的标准品，每个样品重复3孔。室温放置30分钟后，PBST缓冲液洗涤3次（每次的用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上抗体结合的血清内物质被洗掉），再加入50ul 浓度为1nM的 PLA探针（即，25ul 浓度为2 nM的PLA探针1和25ul 浓度为2 nM的PLA探针2），室温温浴30分钟；PBST缓冲液洗涤后（用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上的结合蛋白相结合的PLA探针被洗掉），加入含有连接酶、SYBGreen、以及互补DNA的1×定量PCR缓冲液50 ul室温20分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测。

备注说明：上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：

在含有浓度为50×10^-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）1000 ml中加入2.5×10^-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10^-6mol，80×10^-6 mol ATP，互补DNA0.1×10^-6 mol，dNTPs 0.2×10^-3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。

上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理后，得图2中“■”曲线所示的结果。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度达到1 pg/ml。

验证试验1、将实施例1中所用的待测血清按照常规的ELISA方法检测P53蛋白突变体，所得的结果如图2中的“▲”曲线所示。

所用的检测试剂是美国Oncogeng 公司的p53 蛋白突变体ELISA检测试剂盒（Cat# QIA03）。用此试剂盒按照说明书检测实施例1中所用的标准品。证实ELISA试剂盒对标准品的检测灵敏度 为50 pg/m l。直接包被的管壁固相PLA方法对P53突变体的检测灵敏度比ELISA方法高50倍左右。

验证试验2、

将偶联了正常P53蛋白（野生型P53蛋白）多克隆抗体的免疫磁珠加入到无突变型P53蛋白的正常人血清中，吸附过夜后取出磁珠。通过这种方法得到了不含野生型及突变型P53蛋白的阴性血清。在这种血清中加入不同浓度的基因重组的正常P53蛋白，配制成含有0 pg/ml、0.01pg/ml、0.1 pg/ml、1.0 pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml、1000pg/ml、10000 pg/ml的正常P53蛋白标准品。

检测时，如同实施例1，步骤2）中处理好的PCR管中加入50ul的不同浓度的标准品，每个样品重复3孔。室温放置30分钟后，PBST缓冲液洗涤3次（每次的用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上抗体结合的血清内物质被洗掉），再加入50ul 浓度为1nM的 PLA探针，室温温浴30分钟；PBST缓冲液洗涤后（用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上的结合蛋白相结合的PLA探针被洗掉），加入含有连接酶、SYBGreen、以及互补DNA的1×定量PCR缓冲液50 ul室温20分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测。

同时，如同实施例1，检测血清中的突变型P53蛋白标准品。

上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理后，对于正常P53蛋白标准品的检测得图3中“▲”曲线所示的结果。同时，如同实施例1，检测血清中的突变型P53蛋白标准品。所得的结果如图2中的“■”曲线所示。

结果表明，我们发明的直接包被法进行的管壁固相PLA方法检测突变型P53蛋白，不受正常的野生型P53蛋白的干扰，对突变型P53蛋白的检测灵敏度为1 pg/ml。

实施例2、一种高灵敏度的蛋白检测方法，采用方式二的交联剂固定法进行管壁固相PLA，具体为：

在实施例1的步骤1）之前插入以下前序步骤：

定量PCR管中加入交联剂溶液（体积浓度为1 ％的戊二醛溶液）50ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量PCR管。

然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其余同实施例1。同时，以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，如同实施例1中的验证试验2，检测正常P53蛋白标准品。

最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理后，对于突变型P53蛋白标准品的检测，得图4中“■”曲线所示的结果。对于正常P53蛋白标准品的检测，得图4中“▲”曲线所示的结果，证明此产品不会检测出正常的P53蛋白。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的对突变型P53蛋白的检测灵敏度达到0.01 pg/ml，并且线性检测范围可达到7个数量级。而且野生型的P53蛋白对本产品无干扰。

对比例2-1：

定量PCR管中加入交联剂溶液【浓度为100 ug/ml的EDC (1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物) PBS溶液】50 ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量PCR管。

然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其余同实施例1。

最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理。得图5中“◆”曲线所示的结果。以0pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值后，所对应的样品中突变型P53蛋白浓度作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度为0.1 pg/ml。其结果比实施例1中直接包被法进行管壁固相PLA的灵敏度高10倍左右, 差于实施例2中用戊二醛的交联剂固定法进行管壁固相PLA的灵敏度0.01 pg/ml。

对比例2-2：

定量PCR管中加入交联剂溶液【DMSO溶解的浓度为1 mg/ml的SMCC（4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯】50 ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量PCR管。

然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其余同实施例1。

最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理。得图6中“◆”曲线所示的结果。以0pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值后，所对应的样品中突变型P53蛋白浓度作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度为0.1 pg/ml。其结果比实施例1中直接包被法进行管壁固相PLA的灵敏度高10倍左右, 差于实施例2中用戊二醛的交联剂固定法进行管壁固相PLA的灵敏度0.01 pg/ml。

实施例3 、对心肌肌钙蛋白cTnI的检测

人血清中心肌肌钙蛋白cTnI与心肌梗死密切相关。我们用检测灵敏度较高的方式二的交联剂固定法进行管壁固相PLA检测心肌肌钙蛋白cTnI。即，按照实施例2，定量PCR管中加入交联剂溶液（体积浓度为1％的戊二醛溶液）50 ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量PCR管。然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，但是用cTnI的单克隆抗体（购自美国R&D公司，目录号：ab47003）替代P53突变体单克隆抗体包被到管壁上。cTnI的多克隆抗体（购自美国R&D公司，目录号：ab19615）用生物素修饰标记后，用此抗体替代生物素化的P53蛋白克隆制备PLA探针1和PLA探针2。在cTnI阴性的正常人血清中加入重组的cTnI蛋白，配置成不同浓度的cTnI标准品用于检测。其余等同于实施例1。

最终所得的结果为：可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计算处理结果。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值作为检测试剂的灵敏度。得图7中“◆”曲线所示的结果。证明本方法对心肌肌钙蛋白cTnI的检测灵敏度达到0.01 pg/ml，并且线性检测范围可达到7个数量级。这说明本方法可以高灵敏度检测各种不同的蛋白质。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：任选以下一种方式：

方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：

蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；

方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：

蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：

使用单克隆抗体pab240，从而建立P53蛋白（P53蛋白突变体）、cTnI蛋白的PLA检测。

3.根据权利要求1或2所述的高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：所述方式一的直接包被法为依次进行以下步骤：

1）、在每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2.5小时后，PBST缓冲液洗涤；

2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液180~220 ul，36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去BSA溶液，23~27℃烘干；

3）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时；从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物；

将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗体，从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；

 探针DNA1:

5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；

探针DNA2:

5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATATGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；

4）、检测时，在步骤2）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放置20~40分钟后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul PLA探针，室温温浴20~40分钟；温浴后用PBST缓冲液洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪检测；

上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：

在含有浓度为50×10^-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）1000 ml中加入2.5×10^-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10^-6mol，80×10^-6 mol ATP，互补DNA0.1×10^-6 mol，dNTPs 0.2×10^-3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。

4.根据权利要求1或2所述的高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是所述方式二的交联剂固定法为包括以下步骤：

1）、定量PCR管中加入交联剂溶液40~60 ul，36~38℃放置4.5~5.5小时后，用去离子水洗涤；

2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2.5小时后，PBST缓冲液洗涤；

3）、在步骤2）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液180~220 ul，36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去BSA溶液，23~27℃烘干；

4）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时；从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物；

将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗体，从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；

 探针DNA1:

5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCAAGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；

探针DNA2:

5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATATGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；

5）、检测时，在步骤3）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放置20~40分钟后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul PLA探针，室温温浴20~40分钟；温浴后用PBST缓冲液洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量PCR检测；

所述正向和反向引物、互补DNA为：

正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’

反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’

互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；

PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环，用Mx-3000 定量PCR仪检测；

上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法为：

在含有浓度为50×10^-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）1000 ml中加入2.5×10^-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10^-6mol，80×10^-6 mol ATP，互补DNA0.1×10^-6 mol，dNTPs 0.2×10^-3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶，1000×浓度的SYBGreen 1ml。

5.根据权利要求4所述的高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：所述步骤1）中的交联剂溶液为：体积浓度为0.5~5 ％的戊二醛溶液。

6.根据权利要求5所述的高灵敏度的蛋白检测方法，其特征是：所述步骤1）中的交联剂溶液为：体积浓度为1％的戊二醛溶液。

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