CN107966438A - 一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用 - Google Patents

一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了金属检测技术领域的一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用。该耐高盐传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶，锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括显色剂。本发明传感器基于锌离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术构建，可用于环境中锌离子的现场检测，简便快捷、成本低廉、耐高盐、灵敏度高、选择性好，特别是能够实现可视化检测。

Description

一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用
技术领域
本发明属于离子检测技术领域，具体涉及一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用。
背景技术
重金属锌(Zinc，Zn)是自然界中分布较广的金属元素，主要以硫化锌、氧化锌状态存在，也可与很多元素如铅、铜、锌的矿物共生。锌污染是指锌及化合物所引起的环境污染。主要污染源有锌矿开采、冶炼加工、机械制造以及镀锌、仪器仪表、有机会合成和造纸等工业的排放。汽车轮胎磨损以及煤燃烧产生的粉尘、烟尘中均含有锌及化合物，工业废水中锌常以锌的羟基络合物存在。
锌是人体含量最多的微量元素，其含量高达3g之多，主要以锌离子的形式参与体内的代谢，参与人体内200多种酶的合成与活化，是机体新陈代谢中必不可少的物质。人体缺锌时会引起一系列的生理现象紊乱，包括组织器官的生理功能异常。如生长发育不良、食欲不振和智力发育差等，同时味觉和视觉也会受影响。但人体摄入锌的量过多时，会造成人体锌中毒，出现呕吐、腹泻，损害肝、肾、血管和心脏功能，甚至造成死亡。相关研究证实机体对锌的摄入量应该适当，机体内的锌在一定浓度时会强化免疫系统，但是当超过一定浓度时则会对机体淋巴细胞有损伤，对机体胸腺、脾脏等免疫器官代谢产生抑制。当锌铜比值过大时易发生高血压、冠心病。锌钼比值过大则预示着癌症晚期。
传统的锌检测方法一般可分为冷原子吸收光谱法、石墨碳原子吸收光谱法和火焰原子吸收光谱法等，但是普遍存在灵敏度低、选择性差、易受干扰、价格昂贵的特征。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足锌检测的需要，以保障食品的安全。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于锌的功能核酸的功能传感器及其应用。具体技术方案如下：
一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶；所述锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和锌离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
本发明还提供一种检测锌离子的方法，包括如下步骤：
制备锌离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程检测待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算锌离子的浓度；
其中，锌离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)在锌离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度锌离子溶液，制备锌离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶，聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入TMB显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，酶标仪测定OD450。
步骤(1)的操作为：将脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测锌离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到切割产物。
步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
本发明还提供一种检测锌离子的试剂盒，包括锌离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述锌离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、锌离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显色体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC。
所述缓冲液为终浓度25mM HEPES buffer，pH 7.6；所述终止液为50mM HEPES-NaCl pH 7.0；所述酶活缓冲液为100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
利用所述的试剂盒检测锌离子的方法，包括如下步骤：
(1)制备锌离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线
将锌离子脱氧核酶的4μL底物链和4μL酶链用缓冲液稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，加入5μL不同浓度锌离子溶液，25℃孵育6min，加入5μL终止液，制备锌离子脱氧核酶切割产物；
将6μL 1μM的扩增模板，3μL 2.5mM的dNTPs，6μL 1μM的锌离子脱氧核酶切割产物和9.2μL的超纯水混合均匀，制备A体系；将0.1μL 8U/μL的Bst DNA聚合酶，3μL 10×的聚合酶反应缓冲溶液，1.2μL 10U/μL的Nt.BstNBI切刻内切酶和1.5μL 10×的Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应，得到扩增产物；
将10μL扩增产物，80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，并于37℃反应30min，形成G-四链体结构；
所述氯高铁血红素稀释溶液按照2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合得到；
加入50μL TMB显色液，混匀并于37℃反应10min，反应结束后加入50μL2MH2SO4，酶标仪测定OD450，得到OD450值随锌离子浓度变化的标准曲线；
(2)按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，通过上述标准曲线计算锌离子的浓度。
本发明同时提供一种锌离子脱氧核酶，所述锌离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT。
本发明的有益效果为：
1、本发明基于锌离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量锌离子能够特异性识别锌离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链，产生切割产物；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应(EXPAR)，产生信号的一级放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化信号，可进行定性的判断。
2、经过两次信号的放大与转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行锌离子的检测与定量，并可用于环境中锌离子的现场检测，具备简便快捷、成本低廉、灵敏度高、选择性好。
3、本发明的传感器能够抵抗高盐的干扰，可实现高盐环境中锌离子的检测，并保持较高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为锌离子脱氧核酶的制备及切割产物的验证，其中Lane1-Marker；Lane2-阴性对照：脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链，无锌离子；Lane 3,4,5-阳性样品：在脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链的体系中分别添加15nM、20nM、25nM的氯化锌。，
图2为等温指数扩大反应中扩增产物的变化图，其中，Lane1-Marker；Lane2-扩增模板；Lane 3-阳性样品；Lane4-阳性对照：扩增产物。
图3为OD450值随锌离子浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。本发明实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得。
本发明基于锌离子脱氧核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感技术，构建一种耐高盐传感器。锌离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量锌离子能够特异性识别锌离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶、切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发EXPAR放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构，发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。为现场检测环境中的锌离子提供了快速、超灵敏的检测工具。
实施例1：基于锌的功能核酸的耐高盐传感器的构建
1、实验材料
氯化钾，氯化钠，氯化镁，磷酸氢钾，乙二胺四乙酸二钠，硫酸，四甲基联苯胺，氯高铁血红素，氯化锌，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氢氧化钠，磷酸氢二钠。
2、序列设计
设计并合成脱氧核酶底物链、脱氧核酶酶链和扩增模板。扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；锌离子切割位点在脱氧核酶底物链的rA之后。
3、构建方法
基于锌的功能核酸的耐高盐传感器的构建方法，包括如下步骤：
(1)将4μL脱氧核酶底物链(10μM母液)与4μL脱氧核酶酶链(10μM母液)用缓冲液(终浓度为50mM HEPES-NaCl pH 7.0)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃，大约耗时45min。加入5μL氯化锌溶液(1μM母液)，形成40μL体系，25℃孵育6min，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris)，混匀后4℃保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图1，证明锌离子脱氧核酶的制备与切割成功。
锌离子脱氧核酶切割产物的序列(5’-3’)为：GGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG
(2)配制扩增反应体系
反应体系为30μL，由A部分和B部分组成。
A体系组成(24.2μL)
B体系组成(5.8μL)
本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
(3)A体系在55℃孵育5min后，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增产物，结果如图2。
扩增产物的序列(5’-3’)为：GGGTAGGGCGGGTTGGGGGGTAGGGCGGG
(4)将10μL扩增产物、80μL酶活缓冲液和10μL氯高铁血红素稀释溶液混匀，37℃反应30min，使扩增产物结合氯高铁血红素形成G-四链体结构；
酶活缓冲液：100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
氯高铁血红素稀释溶液：2μL氯高铁血红素原液与1mL酶活缓冲液混合。
(5)向步骤(4)混合液中加入50μL TMB显色液，混匀，37℃反应10min，加入50μL 2MH2SO4，混匀，酶标仪测定OD450。
实施例2：锌离子的检测
待测锌离子溶液为氯化锌溶液(NaCl为溶解环境)，具体步骤如下：
(1)制备OD450随锌离子浓度变化的标准曲线
采用实施例1中3的构建方法，待测锌离子溶液为不同浓度氯化锌溶液(1M NaCl为溶解环境)，锌离子浓度取0nM、30nM、60nM、90nM、120nM和150nM，制备OD450随锌离子浓度变化的标准曲线(图3)，标准曲线为y＝0.0091x+0.1274，R2＝0.9917。
(2)采用实施例1中3的构建方法，酶标仪测定待测锌离子溶液的OD450，代入标准曲线y＝0.0091x+0.1274，得到锌离子浓度。结果如表1
表1
实施例3：一种检测锌离子的试剂盒
一种检测锌离子的试剂盒，包括锌离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
锌离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、锌离子标准溶液和终止液；
等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
显色体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4。
脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC。
缓冲液为终浓度50mM HEPES-NaCl pH 7.0；
终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；
酶活缓冲液为100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。

Claims (10)

1.一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括锌离子脱氧核酶；所述锌离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系和氯高铁血红素，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC；
所述信号转换元件包括显色剂。
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs和锌离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
4.一种检测锌离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备锌离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程测定待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算锌离子的浓度；
其中，锌离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)在锌离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度锌离子溶液，制备锌离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶，聚合酶反应缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶的反应缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)向步骤(4)混合液中加入TMB显色液，混匀并反应，反应结束后加入H2SO4，酶标仪测定OD450。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的操作为：将脱氧核酶底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测锌离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到切割产物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的操作为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为37℃，反应时间为30min；步骤(5)中反应温度为37℃，反应时间为10min。
8.一种检测锌离子的试剂盒，其特征在于，包括锌离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述锌离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、锌离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显色体系包括：氯高铁血红素、酶活缓冲液、TMB显色剂和2MH2SO4；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：CCCGCCCTACCCCCCAACCCGCCCTACCCAACTGACTCCCACCACCGCCTCGTAACTCAACTTCC。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为终浓度50mM HEPES-NaClpH 7.0；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述酶活缓冲液为100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4。
10.一种锌离子脱氧核酶，其特征在于，所述锌离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：CCACCACAATGTTATACAGGTACTATrAGGAAGTTGAGTTACGAGGCGGTGGTGG；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：CTCAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACCT。
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