CN109609607B - 一种用于锌离子定量检测的方法 - Google Patents
一种用于锌离子定量检测的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109609607B CN109609607B CN201811594801.XA CN201811594801A CN109609607B CN 109609607 B CN109609607 B CN 109609607B CN 201811594801 A CN201811594801 A CN 201811594801A CN 109609607 B CN109609607 B CN 109609607B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chain
- cleavage
- substrate
- amplification
- cutting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims 1
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 abstract 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021627 Tin(IV) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001479 atomic absorption spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002089 ferrous chloride Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J tin(iv) chloride Chemical compound Cl[Sn](Cl)(Cl)Cl HPGGPRDJHPYFRM-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- -1 HEPES concentration Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004993 emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 238000009616 inductively coupled plasma Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940091251 zinc supplement Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Abstract
本发明提供一种用于锌离子定量检测的方法,本发明检测主要包含两个反应步骤:依赖性切割反应和RT‑qPCR,在第一步中,将5μL Zn2+浓度的溶液、10μL Zn2+依赖性切割核酶溶液(17ES)和85μL切割缓冲液(300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5)混合;在37℃下反应60min,之后,精准快速稀释105倍后进行RT‑qPCR实验,被切割的底物链无法作为模板进行扩增反应,而未被切割的底物链则可以通过扩增反应实现信号放大,最终结果以切割前后的Cq值变化(ΔCq)来表示切割效果,实现Zn2+的定量检测。本发明采用的Zn2+依赖性切割脱氧核酶17E是已知Zn2+依赖性切割脱氧核酶中切割速率最快的核酶。该酶能够催化切割底物链,并且对Zn2+具有高度亲和力和特异性。
Description
技术领域
本发明主要涉及锌离子检测技术领域,特别涉及一种用于锌离子定量检测的方法。
技术背景
锌是人体必需的微量元素,参与人体的代谢过程。人主要通过从食物和水中摄取锌。如果食物或水受到污染,锌的含量超过限定标准,则可能对人体健康造成危害。有研究者表明人体内锌含量过高可能导致细胞活性增加。因此,准确检测Zn2+浓度水平对维持人体健康至关重要。同时,锌元素的缺乏也是人们面临的共同问题。市场上充斥着大量的锌补充剂,但难以辨别产品的真假。因此,有必要开发一种精确的快速检测技术定量检测锌补充剂中Zn2+的浓度。
目前,Zn2+的传统检测方法包括电感耦合等离子体发射光谱法 (ICP-AES),电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)以及原子吸收光谱法(AAS)等。虽然这些方法提高了灵敏度和特异性,但它们高度依赖于精密仪器,并且样品检测的预处理和测定过程繁琐。此外,仪器和设备的安装环境和维护所需要求高,需要经过专业培训的操作人员来完成。以上方法均不适合快速检测。为了克服大规模仪器检测方法的局限,具有高灵敏度,简单和实时监测优势的基于有机分子(如酰腙,喹啉,蒽和罗丹明等)的Zn2+荧光化学传感器被开发出来。然而,大多数的这些化学传感器不可避免地涉及有机溶剂的发射,并受到荧光猝灭和水介质中选择性差的限制。
近年来,随着分子生物学技术的快速发展,具有特定生物学功能的核酸分子如切割DNA酶(cDNAzymes)和金属离子适配体 (Aptamers)等逐渐显现出来。已经报道的DNA酶包括Zn2+、Cu2+、 Pb2+和Hg2+等依赖性DNA酶。大多数DNA酶催化需要金属辅因子的协助,其中一些具有高选择性和高效性。其中Zn2+依赖性切割脱氧核酶17E,在Zn2+的存在下能够催化底物链切割,对Zn2+具有高度亲和力和特异性,是已知Zn2+依赖性切割脱氧核酶中切割速率最快的核酶。
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是一种简单且发展良好的技术,其在分子生物学中的应用极为普遍。RT-qPCR已被研究人员广泛用于基因检测,病原微生物检测,病毒检测,寄生虫检测和转基因食品检测等方面。与常规定性PCR相比,RT-qPCR实现了定性到定量的转变。使其不仅具有传统PCR技术的简单、快速特点,还具有指数扩增靶物质的能力,促进靶物质的检测。并且实现了更高的特异性和自动化程度。
发明内容
基于此,本将Zn2+依赖性切割脱氧核酶17E与RT-qPCR技术相结合建立了Zn2+的定量检测技术,实现了Zn2+的精确定量测定。具有简单、快速、高灵敏度、高特异性等特点,为痕量锌离子的精准检测提供了技术支持。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为:一种用于锌离子定量检测的方法,其特征在于,具体的检测步骤如下:
(1)准备实验材料:实验材料主要包括有级别为分析纯的氯化钠、氯化锌、氯化镁、氯化钙、氯化铜、氯化锡、氯化亚铁、色谱纯的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和定量PCR扩增试剂 TransStartGreenqPCRSuperMix(2×);
(2)引物设计:根据17E核酸的原始序列,在不破坏酶的催化序列和切割位点的情况下在核酶底物链的两侧加入了引物结合序列。根据引物结合序列设计RT-qPCR的正向和反向引物;通过序列进行反应
表1实验所用锌离子依赖性切割核酶和引物序列:
(3)切割反应缓冲液配制:称取1.7532g NaCl(300mM)和 0.9532g HEPES(40mM)溶于100mL的超纯水中,并调pH至7.5,配制成切割缓冲液(300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5),4℃保存备用;
(4)17E和底物链溶解与杂交:将装有合成序列粉末的试管放入高速离心机中,4℃、13400×g离心10min后取出加入超纯水溶解序列至10μM,4℃保存备用。分别取100μL的底物链(10μM),100 μL的催化酶链(10μM)加入800μL切割缓冲液中,60℃加热5min,然后缓慢降至室温,配制成1μM的锌离子依赖性切割核酶溶液 (17ES),4℃保存备用;
(5)Zn2+依赖性切割反应:
表2切割反应体系表:
将该反应体系在37℃下反应60min;
(6)RT-qPCR反应:样品经Zn2+切割完成后,精准快速稀释105倍后进行RT-qPCR实验;
(7)Zn2+的检测:将5μL Zn2+浓度的溶液、10μL Zn2+依赖性切割核酶溶液(17ES)和85μL切割缓冲液(300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5)混合;在37℃下反应60min。之后,精准快速稀释 105倍后进行RT-qPCR实验,被切割的底物链无法作为模板进行扩增反应,而未被切割的底物链则可以通过扩增反应实现信号放大。最终结果以切割前后的Cq值变化(ΔCq)来表示切割效果,实现Zn2+的定量检测。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明采用的Zn2+依赖性切割脱氧核酶17E是已知Zn2+依赖性切割脱氧核酶中切割速率最快的核酶。该酶能够催化切割底物链,并且对Zn2+具有高度亲和力和特异性。
(2)本发明中Zn2+依赖性切割反应可在恒定温度下完成,在恒温下即可完成信号放大,将Zn2+转化为核酸信号。
(3)本发明在不破坏酶17E的催化序列和切割位点的情况下在其底物链的两侧加入了引物结合序列。在切割缓冲液中加入Zn2+催化 17E切割底物链后,被切割的底物链无法作为模板进行RT-qPCR扩增反应,而未被切割的底物链则可以通过扩增反应实现信号放大。
(4)本发明的快速检测方法不需要大型的仪器设备和专业的操作人员,检测灵敏度高、特异性强,检测限可低至58.61pM。
附图说明
图1为可行性分析荧光光谱结果图,其中,曲线E-S1为切割体系中含有酶链和底物链,曲线E-S2为切割体系中含有酶链、底物链和Zn2+,曲线ES51为切割体系中含有ES5,曲线ES52为切割体系中含有ES5和Zn2+。
图2为生物传感器锌离子切割反应体系优化实验结果图,图A 为pH值对ΔCq值的影响,图B为HEPES浓度对ΔCq值的影响,图C为NaCl浓度对ΔCq值的影响,图D为切割反应时间对ΔCq值的影响。
图3为锌离子浓度的线性范围为80pM至1280pM时的标准曲线结果图。
具体实施案例
下面,举实施例说明本发明,但是,本发明并不限于下述的实施例。
本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的,但不限制本发明的实施,其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一:
本发明采用的用于锌离子定量检测的方法具体的步骤如下:
(1)准备实验材料:实验材料主要包括有级别为分析纯的氯化钠、氯化锌、氯化镁、氯化钙、氯化铜、氯化锡、氯化亚铁、色谱纯的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和定量PCR扩增试剂 TransStartGreenqPCRSuperMix(2×);
(2)引物设计:根据17E核酸的原始序列,在不破坏酶的催化序列和切割位点的情况下在核酶底物链的两侧加入了引物结合序列。根据引物结合序列设计RT-qPCR的正向和反向引物;
表1实验所用锌离子依赖性切割核酶和引物序列:
(3)切割反应缓冲液配制:称取1.7532g NaCl(300mM)和 0.9532g HEPES(40mM)溶于100mL的超纯水中,并调pH至7.5,配制成切割缓冲液(300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5),4℃保存备用;
(4)17E和底物链溶解与杂交:将装有合成序列粉末的试管放入高速离心机中,4℃、13400×g离心10min后取出加入超纯水溶解序列至10μM,4℃保存备用。分别取100μL的底物链(10μM),100 μL的催化酶链(10μM)加入800μL切割缓冲液中,60℃加热5min,然后缓慢降至室温,配制成1μM的锌离子依赖性切割核酶溶液 (17ES),4℃保存备用;
(5)Zn2+依赖性切割反应:
表2切割反应体系表:
将该反应体系在37℃下反应60min;
(6)RT-qPCR反应:样品经Zn2+切割完成后,精准快速稀释105倍后进行RT-qPCR实验;
(7)Zn2+的检测:将5μL Zn2+浓度的溶液、10μL Zn2+依赖性切割核酶溶液(17ES)和85μL切割缓冲液(300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5)混合;在37℃下反应60min。之后,精准快速稀释 105倍后进行RT-qPCR实验,被切割的底物链无法作为模板进行扩增反应,而未被切割的底物链则可以通过扩增反应实现信号放大。最终结果以切割前后的Cq值变化(ΔCq)来表示切割效果,实现Zn2+的定量检测。
实施例二:本发明将Zn2+依赖性切割核酶17E的酶链(Enzyme) 和底物链(Substrate)通过5个A碱基串联成一条链ES5(如说明书附图一),以1mM Zn2+和100nM ES5进行切割实验,经37℃,60min 切割后,稀释105倍,进行RT-qPCR验证,并与原来的酶链和底物链 (如说明书附图一)组成的切割酶(E-S)的催化活性进行对比。得到E-S的ΔCq值比ES5的ΔCq值更大,具有较高催化切割效率。
实施例三:Zn2+切割体系反应条件的优化:以1mM Zn2+为切割浓度,经过37℃,60min的切割反应后,均稀释105倍,进行RT-qPCR 验证。为了提高该荧光定量生物传感器的灵敏度,通过比较切割缓冲液的pH值、HEPES浓度、NaCl浓度、切割反应时间来系统地分析。结果证明切割缓冲液pH为7.5时传感器性能更好(说明书附图二A), HEPES浓度为40mM时ΔCq值最大(说明书附图二B),NaCl浓度为300mM时Zn2+依赖性切割脱氧核酶17E的催化活性最高(说明书附图二C)。此外,60min为最佳切割时间(说明书附图二D);其中,(说明书附图二A)pH值对ΔCq值的影响;(说明书附图二B) HEPES浓度对ΔCq值的影响;(说明书附图二C)NaCl浓度对ΔCq 值的影响;(说明书附图二D)切割反应时间对ΔCq值的影响。
实施例四:
荧光定量生物传感器灵敏度验证:为了评定该荧光定量生物传感器的灵敏度,在最佳实验条件下测量含有不同浓度的Zn2+标准溶液 (0~1280pM)的ΔCq值,每个浓度三个平行。在定量PCR体系中, Zn2+浓度为80pM至1280pM时,参照说明书附图三所作图为线性的,并且相关方程为:ΔCq=4.3449lg[C(Zn2+)]–7.7719,相关系数R2为 0.9953,适合定量检测;其中说明书附图三为锌离子浓度的线性范围为80pM至1280pM时的标准曲线。
以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求。
Claims (5)
1.一种用于非疾病诊断的锌离子定量检测的方法,其特征在于,1)结合了Zn2+依赖性切割核酶17E和定量PCR技术;2)底物链Substrate两侧加入引物结合位点;3)Zn2+存在可发生切割反应,切割的底物链无法扩增,未切割的底物链进行扩增实现信号放大;4)以Zn2+切割前后定量PCR Cq值的变化作为信号判别进行检测;5)比较单独的催化酶链Enzyme和底物链与催化酶链和底物链连成一条链ES5的切割扩增效率,两条链比一条链效果更佳;
所述催化酶链Enzyme序列如下:
5’-CTTAAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACATG-3’
所述底物链Substrate序列如下:
5’-GATAGACTTGTGCAGCATGTACTATrAGGAAGTTTAAGTAGGGAGAGAATTGG-3’
所述ES5序列如下:
5’-GATAGACTTGTGCAGCTTAAACTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTACATGAAAAACATGTACTATrAGGAAGTTTAAGTAGGGAGAGAATTGG-3’
所述引物序列如下:
正向引物Forwardpr:5’-GATAGACTTGTGCAGCATGTACT-3’;反向引物Reversepr:5’-CCAATTCTCTCCCTACTTAAACTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,检测过程如下:将5μL Zn2+浓度的溶液、10μL Zn2+依赖性切割核酶溶液(17ES)和85μL 300mM NaCl,40mM HEPES,pH 7.5的切割缓冲液混合;在37℃下反应60min;之后,精准快速稀释105倍后进行RT-qPCR实验,被切割的底物链无法作为模板进行扩增反应,而未被切割的底物链则可以通过扩增反应实现信号放大;最终结果以切割前后的Cq值变化(ΔCq)来表示切割效果,实现Zn2+的定量检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述17ES通过所述催化酶链与底物链在所述切割缓冲液中高温变性缓慢降至室温后形成酶-底物杂交链(E-S)制备得到。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,所述切割扩增效率比较过程如下:将所述催化酶链和底物链通过5个A碱基串联成一条链ES5,以1mM Zn2+和100nM ES5进行切割实验,经37℃,60min切割后,稀释105倍,进行RT-qPCR验证,获得ΔCq;并与17ES获得的ΔCq进行比较,选择扩增效率最高的切割核酶用于Zn2+定量测定。
5.权利要求1-4任一项所述检测方法在非疾病诊断中的锌离子检测方面的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811594801.XA CN109609607B (zh) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | 一种用于锌离子定量检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811594801.XA CN109609607B (zh) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | 一种用于锌离子定量检测的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109609607A CN109609607A (zh) | 2019-04-12 |
CN109609607B true CN109609607B (zh) | 2022-03-01 |
Family
ID=66012419
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811594801.XA Active CN109609607B (zh) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | 一种用于锌离子定量检测的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109609607B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107966423A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-27 | 中国农业大学 | 一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用 |
CN107966438A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-27 | 中国农业大学 | 一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用 |
CN108841937A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-11-20 | 中国农业大学 | 通用隔断超快扩增镁、锌切割型功能核酸可视化检测方法 |
CN108949931A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-07 | 中国农业大学 | 一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器 |
-
2018
- 2018-12-25 CN CN201811594801.XA patent/CN109609607B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107966423A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-27 | 中国农业大学 | 一种基于锌的功能核酸的耐高盐比色传感器及其应用 |
CN107966438A (zh) * | 2017-10-27 | 2018-04-27 | 中国农业大学 | 一种基于锌的功能核酸的耐高盐传感器及其应用 |
CN108841937A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-11-20 | 中国农业大学 | 通用隔断超快扩增镁、锌切割型功能核酸可视化检测方法 |
CN108949931A (zh) * | 2018-06-20 | 2018-12-07 | 中国农业大学 | 一种锌离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
A label-free DNAzyme sensor for lead(II) detection by quantitative polymerase chain reaction;Fenglin Wang等;《Analytical Biochemistry》;20100617;第168-173页 * |
Engineering a DNA-cleaving DNAzyme and PCR into a simple sensor for zinc ion detection;Jiacui Xu等;《Anal Bioanal Chem》;20141231;第3025–3029页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109609607A (zh) | 2019-04-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108676844B (zh) | 一种双酶放大汞离子生物传感器的构建 | |
CN105132524A (zh) | ExoIII辅助的循环和DNAzyme循环的双重放大反应用于Hg2+检测 | |
WO2019136034A8 (en) | Loop-mediated isothermal amplification (lamp) based assay for detecting microbes | |
CN116590387B (zh) | 一种基于CRISPR系统的ssDNA检测方法及应用 | |
CN111808931A (zh) | 一种一步式rpa-crispr核酸检测方法、试剂盒及应用 | |
CN107976436B (zh) | 一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用 | |
CN113640268B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法 | |
CN108318479B (zh) | 一种高灵敏度的铅离子检测方法 | |
Xu et al. | A loop-mediated isothermal amplification integrated G-quadruplex molecular beacon (LAMP-GMB) method for the detection of Staphylococcus aureus in food | |
Zhu et al. | Ultrasensitive detection of lead ions based on a DNA-labelled DNAzyme sensor | |
CN106841130A (zh) | 一种无标记荧光检测水样中铀酰离子含量的方法 | |
CN112011597B (zh) | 一种诱导型变构探针结合滚环扩增的镉离子传感方法 | |
Li et al. | A “turn-off” ultra-sensitive fluorescent quantitative biosensor driven by zinc ion DNAzyme | |
CN109609607B (zh) | 一种用于锌离子定量检测的方法 | |
EP3676394A1 (en) | Nicking and extension amplification reaction (near) of respiratory syncytial virus species | |
CN105543345A (zh) | 玉米赤霉烯酮的检测方法及检测试剂盒 | |
CN108949917B (zh) | 一种汞离子错配型通用隔断超快扩增比色传感器 | |
Peng et al. | Engineering of an adaptive tandem CRISPR/Cas12a molecular amplifier permits robust analysis of Vibrio parahaemolyticus | |
US11072822B2 (en) | RNA amplification method, RNA detection method and assay kit | |
CN105713966B (zh) | 一种快速检测玉米赤霉烯酮的方法 | |
Yong-Xi et al. | Amplified fluorescence detection of Pb2+ using Pb2+-dependent DNAzyme combined with nicking enzyme-mediated enzymatic recycling amplification | |
CN105675569B (zh) | 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素a的方法及检测试剂盒 | |
CN104087655A (zh) | 基于滚环扩增的限制性核酸内切酶单链切割的分析方法 | |
CN107966437B (zh) | 一种银的耐高盐核酸传感器及其应用 | |
CN110954518B (zh) | 一种哑铃型dna/铜纳米粒子荧光生物传感器的制备方法及其在定量检测atp中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231225 Address after: 072250 Nanyuan, Economic Development Zone, Shunping County, Baoding City, Hebei Province Patentee after: Baoding Nongbobo Agricultural and Sideline Products Co.,Ltd. Address before: China Agricultural University (East District), 17 Qinghua East Road, Haidian District, Beijing 100083 Patentee before: CHINA AGRICULTURAL University |
|
TR01 | Transfer of patent right |