CN114088676A - 一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法 - Google Patents

一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，属于纳米材料传感领域。包括以下步骤：(1)将氧化型谷胱甘肽和氯金酸的混合溶液微波循环断续加热，待溶液冷却到室温后离心，将沉淀用去离子水洗涤三次后烘干，得金纳米簇；(2)以2‑吗啉乙磺酸和高锰酸钾为原料合成二氧化锰纳米片；(3)将金纳米簇、二氧化锰纳米片和样品溶液混合于磷酸盐缓冲溶液，在10℃恒温至2、5、30min时，用荧光光谱法分别测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。本发明提供的方法选择性好、灵敏度高，可对复杂样品中半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的实现同时灵敏检测。

Description

一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法
技术领域
本发明属于纳米材料制备及化学分析检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米簇同时测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光光谱分析方法。
背景技术
半胱氨酸(Cys)，高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)等是生物系统中许多蛋白质和分子的组成成分。这三种生物硫醇的化学结构存在高度相关性，半胱氨酸和高半胱氨酸在化学结构上相差一个亚甲基；谷胱甘肽结构中含有一个半胱氨酸残基。这三种物质在细胞抗氧化剂防御系统中起着至关重要的作用，比如GSH可调节细胞生长和蛋白质功能，并能够促进免疫；Cys不足时，容易引起头发脱色、生长减慢以及肝损伤等，当血液中Cys过高时通常预示某些疾病，如l-半胱氨酸尿症、神经毒性、艾滋病和癌症等；体内Hcy浓度过大时，会存在一系列疾病发生的可能性，比如精神分裂症等。
由于生物硫醇具有如此重要的生理功能，发展高灵敏度和高选择性的检测方法引起科技工作者的广泛关注。目前用于检测生物硫醇的方法主要有荧光光谱法(NewJ.Chem.2017,41,4416-4423)、液相色谱法(Journal of Chromatography A 2013,1274,145-150)、毛细管电泳法(Journal of Separation Science 2012,35,280-285)等。荧光光谱法灵敏度高、操作简便，而且还可进行细胞内检测。但是，该方法的最大局限性是难以对多组分进行同时检测，限制了其在生物硫醇检测中的应用。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种荧光测量方法，实现半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽三种生物硫醇的同时检测。具体技术方案如下：
一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，特征在于，包括以下步骤：
(1)将含10mM氧化型谷胱甘肽和2mM氯金酸的混合溶液微波循环断续加热60min后离心，将沉淀用去离子水洗涤三次后烘干，得金纳米簇；
所述循环断续加热的参数为微波加热每开启20s，停10s；
所述烘干通过120℃真空干燥8小时实现；
(2)以2-吗啉乙磺酸和高锰酸钾为原料合成二氧化锰纳米片；
(3)将金纳米簇和二氧化锰纳米片分别溶解于磷酸盐缓冲溶液中，将上述溶液和样品溶液放入恒温箱中，恒温至10℃；
(4)将步骤(3)中的金纳米簇溶液、二氧化锰纳米片溶液混合，制得探针溶液，将探针溶液与样品溶液以9:1混合，摇匀，制得测量溶液，将其置于10℃恒温箱中恒温并计时，2min时荧光法测量半胱氨酸的含量，5min时测量高半胱氨酸的含量，30min时测量谷胱甘肽的含量；
所述荧光法测量是指用波长为300nm的光激发，并根据615nm处发射光的强度进行定量分析。
所述步骤(1)中混合溶液的体积为50～100mL，微波加热功率为200～350W；离心机转速为4000～8000转/分钟，离心时间为10～20min。
所述步骤(3)中磷酸盐缓冲溶液的浓度为2～10mM，pH值为8.5～9.0。
所述步骤(4)探针溶液中金纳米簇的浓度，以金元素计，为0.05～0.15mM；二氧化锰纳米片的浓度，以锰元素计，为0.05～0.15mM。
本申请提供的测量方法，不仅灵敏度优于现有的荧光分析方法，而且可以实现对单个样品中半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽三种生物硫醇的同时检测，提高了检测效率，拓宽了荧光光谱法的应用范围。
附图说明
图1金纳米簇TEM图。
图2二氧化锰纳米片TEM图。
图3金纳米簇的激发(左)和发射光谱(右)。
图4测量溶液pH对于待测物响应程度的影响。
图5反应温度对于各个待测物响应程度的影响。
图6测量时间的影响。
图7其他氨基酸干扰性测试。条件：Cys、Hcy、GSH浓度为40μM，其他氨基酸浓度为200μM。
图8Cys的荧光发射光谱图。
图9Cys的线性关系曲线。
图10Hcy的荧光光谱及线性关系图。
图11GSH的荧光发射光谱及线性拟合曲线。
具体实施方式
发明人在研究中意外发现，将氧化型谷胱甘肽(GSSG)与氯金酸的混合溶液在微波加热下反应，在容器底部生成大量的沉淀状氧化型谷胱甘肽保护的金纳米簇(GSSG-AuNCs)。该纳米簇一个显著的特征是对半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽具有动力学上的选择性响应；在检测系统中加入二氧化锰纳米片可以敏化荧光响应信号。基于此，本发明提供了一种同时测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：
(1)将50～100mL含10mM氧化型谷胱甘肽和2mM氯金酸的混合溶液微波循环断续加热，微波加热功率为200～350W，60min后停止加热，待溶液冷却到室温后以4000～8000转/分钟的速度离心10～20min，将沉淀用去离子水洗涤三次后烘干，得金纳米簇；
所述循环断续加热的参数为微波加热每开启20s，停10s；
所述烘干通过120℃真空干燥8小时实现；
(2)以2-吗啉乙磺酸和高锰酸钾为原料合成二氧化锰纳米片；
(3)将金纳米簇和二氧化锰纳米片分别溶解于浓度为2～10mM、pH值为8.5～9.0磷酸盐缓冲溶液中，将上述溶液和样品溶液放入恒温箱中，恒温至10℃；
(4)将步骤(3)中的金纳米簇溶液、二氧化锰纳米片溶液混合，制得探针溶液，使其中的金纳米簇的浓度以金元素计为0.05～0.15mM，二氧化锰纳米片的浓度以锰元素计为0.05～0.15mM，将探针溶液与样品溶液以9:1混合，摇匀，制得测量溶液，将其置于10℃恒温箱中恒温并计时，2min时荧光法测量半胱氨酸的含量，5min时测量高半胱氨酸的含量，30min时测量谷胱甘肽的含量；荧光法测量时用波长为300nm的光激发，并根据615nm处发射光的强度进行定量分析。
为进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的测量方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径购得。
实施例1
1.1金纳米簇(GSSG-AuNCs)的合成
将100mL含10mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM氯金酸(HAuCl4)的混合溶液倒入圆底烧瓶中，装好冷凝回流装置，微波反应器功率设置为350W，加热模式控制为每开启20s停10s，加热时间为60min。
待反应液冷却到常温之后，将其置于离心管中，4000rpm离心20min，倒掉上层溶液后，加入等量的去离子水，混匀，4000rpm离心20min，去离子水重复洗涤3次后，将金纳米簇倒入瓷坩埚中，置于真空干燥箱，抽真空后，设定干燥箱温度为120℃，干燥8h。
1.2金纳米簇中金元素含量测定
准确称取0.01g金纳米簇，加到清洗干净的30mL聚四氟乙烯消解罐中(西安仪表，中国陕西省)，然后向消解罐中加入2mL硝酸和2mL过氧化氢，将容器放入预热至180℃的烘箱中消解3小时。消解结束后，用去离子水稀释至50mL。
采用原子发射光谱法测量金元素的含量。具体操作参数为：电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)：SPECTRO ARCOS EOP(SPECTRO Analytical Instruments GmbH)，功率为1.28kW，冷却剂流量、辅助流量和雾化器流量分别设置为13、0.8和0.8L/min，对样品做三次平行实验。
测得氧化型谷胱甘肽保护的金纳米簇(GSSG-AuNCs)中金元素的含量为1.52±0.01mmole/g。
1.3 GSSG-AuNCs的TEM表征
将1.1中制备的GSSG-AuNCs用TEM(Talos F200S,Hillsboro,OR,USA)表征，加速电压为200kV。TEM图像(图1)显示，所制备的GSSG-AuNCs为球形，平均直径为1.972±0.246nm，可以很好地分辨出晶格条纹，说明金纳米簇制备成功。
1.4金纳米簇的荧光表征
采用FLS980荧光光谱仪(英国爱丁堡仪器有限公司)扫描0.05mM GSSG-AuNCs(以金元素计)溶液的荧光光谱。如图3所示，合成的金纳米簇最佳激发波长为300nm，最佳发射波长为615nm。
实施例2
本实施例合成二氧化锰纳米片(MnO2-NSs)，并对其进行成分和形貌表征。
2.1 MnO2-NSs合成
将1.0mL浓度为10mM的KMnO4溶液添加到2.0mL浓度为50mM MES(2-吗啉乙磺酸)溶液中，并用去离子水稀释至10mL。将混合物超声处理30分钟，直到混合物变成棕色胶体。随后，通过以8000rpm离心15分钟获得MnO2纳米片。然后，将产物用去离子水洗涤五次。将MnO2-NSs倒入瓷坩埚中，置于真空干燥箱，抽真空后，设定干燥箱温度为120℃，干燥8h。
2.2 MnO2-NSs中锰元素含量的测定
准确称取0.01g MnO2-NSs，加入清洗干净的30mL聚四氟乙烯消解罐中(西安仪表，中国陕西省)，然后向消解罐中加入2mL盐酸和2mL过氧化氢，将容器放入预热至180℃的烘箱中进行消解3小时。消解结束后，用去离子水稀释至50mL。
采用原子发射光谱法测量金元素的含量。具体操作参数为：电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)：SPECTRO ARCOS EOP(SPECTRO Analytical Instruments GmbH)，功率为
1.28 kW，冷却剂流量、辅助流量和雾化器流量分别设置为13、0.8和0.8L/min，对样品做三次平行实验。
测得MnO2-NSs中锰元素的含量为12.16±0.01mmole/g。
2.3 MnO2-NSs的TEM表征
图2显示，合成的二氧化锰纳米片尺寸大致为130nm，并具有明显的层状结构。
实施例3
本实施例对测量溶液的pH值进行优化。
3.1 GSSG-AuNCs的合成
将50mL含10mM氧化型谷胱甘肽和2mM氯金酸的混合溶液倒入圆底烧瓶中，装好冷凝回流装置，微波反应器功率设置为200W，加热模式控制为每开启20s停10s，加热时间为60min。
待反应液冷却到常温之后，将其置于离心管中，8000rpm离心10min，倒掉上层溶液后，加入等量的去离子水，混匀，8000rpm离心10min，去离子水重复洗涤3次后，将金纳米簇倒入瓷坩埚中，置于真空干燥箱，抽真空后，设定干燥箱温度为120℃，干燥8h。
3.2 GSSG-AuNCs中金元素含量测定及表征
实验条件同1.2。测得GSSG-AuNCs中金元素含量为1.48±0.01mmole/g。TEM实验表明，本实施例合成的GSSG-AuNCs与实施例1合成的GSSG-AuNCs在形貌和荧光光谱性质上没有明显的差别。
3.3测量溶液pH值的优化
分别称取适量的GSSG-AuNCs和MnO2-NSs，常温下分散于2mM指定pH值的磷酸盐缓冲溶液中制得探针溶液，使两种纳米材料的浓度都为0.05mM。
室温下将4.5mL探针溶液与0.5mL去离子水混合，摇匀，反应2分钟后以300nm的光线激发，测量溶液在615nm处的发射光谱，强度记为I0。
待测物半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽分别配成40μM的水溶液。室温下将4.5mL探针溶液与0.5mL待测物溶液混合，摇匀，反应2分钟后进行测量。此时测量到的615nm处的荧光强度记为I，以I/I0表示待测物的荧光响应。图4显示，反应时间为2min时，GSH在各个pH值下几乎都没有响应，而Hcy和Cys在pH为8.5时响应的差别最大，当pH大于8.5之后，两者的响应程度都开始降低，pH达到9.5之后，几乎都没有响应，因此，选择pH8.5-pH9.0进行后续的实验。
实施例4
本实施例研究温度对测量结果的影响。
称取适量的GSSG-AuNCs和MnO2-NSs，分别分散于10mM pH8.5的磷酸盐缓冲溶液中，恒温到指定温度后，以适当的比例混合制得探针溶液，使最终溶液中两种纳米材料的浓度都为0.15mM。
将4.5mL探针溶液与0.5mL恒温到指定温度的去离子水混合，摇匀，在指定温度下反应2分钟后以300nm的光线激发，测量溶液在615nm处的发射光谱，强度记为I0。
待测物半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽分别配成40μM的水溶液，并恒温到指定温度。然后，将4.5mL探针溶液与0.5mL待测物溶液混合，摇匀，在指定温度下反应2分钟后进行测量。此时测量到的615nm处的荧光强度记为I，以I/I0表示待测物的荧光响应。
从图5中可以看出，当温度低于10℃，在2分钟时，只有Cys有响应，随着温度逐渐升高，Hcy的响应程度甚至超过了Cys，而GSH在2分钟内几乎没有任何响应，因此选择10℃作为反应温度。
实施例5
本实施例研究测量时间的影响。
称取适量的GSSG-AuNCs和MnO2-NSs，分别分散于10mM pH9.0的磷酸盐缓冲溶液中，恒温到10℃后，以适当的比例混合制得探针溶液，使两种纳米材料的浓度都为0.10mM。
将4.5mL探针溶液与0.5mL恒温到10℃的去离子水混合，摇匀，在10℃下反应指定时间后以300nm的光线激发，测量溶液在615nm处的发射光谱，强度记为I0。
将待测物半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽配成浓度分别为40μM的混合溶液，并恒温到10℃。然后，将4.5mL探针溶液与0.5mL待测物溶液混合，摇匀，在10℃下反应指定时间后进行测量。此时测量到的615nm处的荧光强度记为I，以I/I0表示待测物的荧光响应。
图6可以看出，在2分钟时，Cys已经基本反应完全，在5分钟时，Hcy已经完成了反应，GSH的响应要慢一些，在30分钟时也基本完成了反应。
实施例6
本实施例研究生理条件下共存的其它氨基酸对测量结果的影响，实验条件如下：
反应和测量温度：10℃；
磷酸盐的浓度为5mM，pH8.5；
GSSG-AuNCs和MnO2-NSs的浓度为0.10mM；
GSH、Hcy、Cys的测量时间分别为30、5和2min；其它干扰物质的测量时间为30min。
在所选择的条件下，分别用浓度为40μM的GSH、Hcy、Cys和浓度为200μM的苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、缬氨酸(Val)、组氨酸(His)等氨基酸进行对比。结果发现，GSH、Hcy、Cys的响应程度要明显大于其他的氨基酸(图7)，因此说明该方法具有良好的选择性。
实施例7
本实施例分别建立Cys、Hcy和GSH的标准曲线，并将方法从检测限和线性范围两方面与已有技术相比较。
称取适量的GSSG-AuNCs和MnO2-NSs，分别分散于5mM pH8.5的磷酸盐缓冲溶液中，恒温到10℃后，以适当的比例混合制得探针溶液，使两种纳米材料的浓度都为0.10mM。
将4.5mL探针溶液与0.5mL恒温到10℃的去离子水混合，摇匀，在10℃下反应指定时间(2、5、30min，分别对应半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽测量的本底)后以300nm的光线激发，测量溶液在615nm处的发射光谱，强度记为I0。
将待测物半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽配成浓度分别为40μM的标准溶液，并恒温到10℃。然后，将4.5mL探针溶液与0.5mL待测物溶液混合，摇匀，在10℃下反应指定时间后进行测量(半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的反应时间分别为2、5、30min)。此时测量到的615nm处的荧光强度记为I，以I/I0表示待测物的荧光响应。
7.1 Cys标准曲线
将不同浓度的Cys分别加入到探针溶液中反应2分钟，由图8可知，金纳米簇的荧光强度随Cys浓度的增大而呈线性增加的趋势，当浓度增大到80μM之后，纳米簇的荧光强度不再增强，荧光强度与Cys浓度的关系为：y＝27337x+365477(图9)，在0.5～80μM范围内表现出良好的线性关系，R2值为0.9991，以LOD＝3σ/S计算检测限，其中σ表示线性曲线的斜率，S表示11次空白样的检测值的标准偏差，检测限为0.48μM。
7.2 Hcy标准曲线
将不同浓度的Hcy分别加入到探针溶液中反应5分钟，由图10可知，金纳米簇的荧光强度随Hcy浓度的增大而呈线性增大的趋势，当浓度增大到65μM之后，纳米簇的荧光强度不再增强，荧光强度与Hcy浓度的关系为：y＝26653x+363117，在1～65μM范围内表现出良好的线性关系，R2值为0.9995，检测限为0.49μM。
7.3 GSH标准曲线
将不同浓度的GSH分别加入到探针溶液中反应30分钟，由图11可知，金纳米簇的荧光强度随GSH浓度增大而呈线性增大的趋势，当浓度增大到100μM之后，纳米簇的荧光强度不再增强，荧光强度与GSH浓度的关系为：y＝5784.2x+782654，在5～100μM范围内表现出良好的线性关系，R2值为0.9991，检测限为2.26μM。
7.4与现有技术相比较
表1显示，本发明中Cys、Hcy和GSH的检测灵敏度均优于已有的方法，而线性范围与现有技术相当或更好。
表1本方法与已有技术的结果比较
Figure BDA0003370053320000071
备注：
[1]Yu,H.,Liu,Y.,Wang,J.M.,Liang,Q.,Liu,H.,Xu,J.,Shao,S.J.,NewJ.Chem.2017,41,4416-4423.
[2]Yue,Y.K.,Huo,F.J.,Wang,Y.T.,Ma,K.Q.,Li,X.Q.,Yin,C.X.,Chem.Commun.2020,56,9146-9149.
[3]Nolin,T.D.,McMenamin,M.E.,Himmelfarb,J.,Journal of ChromatographyB-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2007,852,554-561.
实施例8
采用实施例7建立的方法对血清样品(由北京市红十字会血液中心提供)中的半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽含量进行检测并计算加标回收率。
称取适量的GSSG-AuNCs和MnO2-NSs，分别分散于5mM pH8.5的磷酸盐缓冲溶液中，恒温到10℃后，以适当的比例混合制得探针溶液，使两种纳米材料的浓度都为0.10mM。
将4.5mL探针溶液与0.5mL恒温到10℃的去离子水混合，摇匀，在10℃下反应指定时间(2、5、30min，分别对应半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽测量的本底)后以300nm的光线激发，测量溶液在615nm处的发射光谱，强度分别记为I0-2、I0-5、I0-30。
将血清样品恒温到10℃。然后，将4.5mL探针溶液与0.5mL血清混合，摇匀，在10℃下反应到2、5、30min时进行测量，测量到的荧光发射强度分别计为I2、I5、I30，则，在定量计算过程中，血清中半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光响应分别为I2/I0-2、(I5-I2)/I0-5和(I30-I5)/I0-30，采用实施例7中的校正曲线分别计算样品中的待测物浓度，结果列于表2。
表2血清样品中半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽含量的检测
Figure BDA0003370053320000081
表2显示，本发明的方法对血清样品检测的加标回收率介于96.0％～113％，说明本方法可以对复杂样品中的半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽含量进行检测。
上述实施例说明，采用本发明的方法制得的GSSG-AuNCs，由于GSSG中含有半胱氨酸单元，对含半胱氨酸结构的不同生物硫醇分子具有选择性，从而可以实现对半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽进行分别检测，使用MnO2-NSs作为敏化剂可以提高检测灵敏度。该方法选择性好、灵敏度高，可以实现复杂样品中半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的同时检测。
以上实施例只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的专业技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，特征在于，包括以下步骤：
(1)将含10mM氧化型谷胱甘肽和2mM氯金酸的混合溶液微波循环断续加热60min后离心，将沉淀用去离子水洗涤三次后烘干，得金纳米簇；
所述循环断续加热的参数为微波加热每开启20s，停10s；
所述烘干通过120℃真空干燥8小时实现；
(2)以2-吗啉乙磺酸和高锰酸钾为原料合成二氧化锰纳米片；
(3)将金纳米簇和二氧化锰纳米片分别溶解于磷酸盐缓冲溶液中，将上述溶液和样品溶液放入恒温箱中，恒温至10℃；
(4)将步骤(3)中的金纳米簇溶液、二氧化锰纳米片溶液混合，制得探针溶液，将探针溶液与样品溶液以9:1混合，摇匀，制得测量溶液，将其置于10℃恒温箱中恒温并计时，2min时荧光法测量半胱氨酸的含量，5min时测量高半胱氨酸的含量，30min时测量谷胱甘肽的含量；
所述荧光法测量是指用波长为300nm的光激发，并根据615nm处发射光的强度进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中混合溶液的体积为50～100mL，微波加热功率为200～350W。
3.据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心机转速为4000～8000转/分钟，离心时间为10～20min。
4.根据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲溶液的浓度为2～10mM。
5.根据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲溶液的pH值为8.5～9.0。
6.根据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)探针溶液中金纳米簇的浓度，以金元素的含量计，为0.05～0.15mM。
7.根据权利要求1所述的测量半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的方法，其特征在于，所述步骤(4)探针溶液中二氧化锰纳米片的浓度，以锰元素的含量计，为0.05～0.15mM。
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