CN111103243B - 用于检测硫化氢含量的显色剂及其制备方法和利用其检测硫化氢含量的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测硫化氢含量的显色剂及其制备方法和利用其检测硫化氢含量的方法和装置。该显色剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括含有铁和镍的普鲁士蓝类似物，所述第二试剂包括3,3',5,5'‑四甲基联苯胺。该显色剂制备工艺简单、原料易得、成本较低，易于工业化生产，利用该显色剂检测硫化氢含量时，线性范围宽，可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围，检出限低、灵敏度高，稳定性强、重现性好，可实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

Description

用于检测硫化氢含量的显色剂及其制备方法和利用其检测硫 化氢含量的方法和装置

技术领域

本发明涉及化学技术领域，具体地，涉及用于检测硫化氢含量的显色剂及其制备方法和利用其检测硫化氢含量的方法和装置。

背景技术

在相关技术中，检测硫化氢含量的方法的线性范围较窄；同时，无法实现快速、实时、连续地检测硫化氢，在很多检测环境下无法使用。

因而，现有的检测硫化氢含量的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备工艺简单、原料易得、成本较低、易于工业化生产、利用其检测硫化氢含量时的线性范围宽、可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围、检出限低、灵敏度高、稳定性强、重现性好、可实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测、适用于大部分环境下硫化氢的检测、应用范围广泛或者特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测的用于检测硫化氢含量的显色剂。

在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测硫化氢含量的显色剂。根据本发明的实施例，该显色剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括含有铁和镍的普鲁士蓝类似物，所述第二试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺。发明人发现，该显色剂制备工艺简单、原料易得、成本较低，易于工业化生产，利用该显色剂检测硫化氢含量时，线性范围宽，可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围，检出限低、灵敏度高，稳定性强、重现性好，可实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

根据本发明的实施例，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物满足以下条件的至少之一：形状为立方体；粒径不大于90nm，优选粒径不大于60nm；所述铁和所述镍的摩尔比为(1～2)：(1～2)；化学式为KNi[Fe(CN)₆]。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备前面所述的显色剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括制备所述第一试剂的步骤；和制备所述第二试剂的步骤，其中，制备所述第一试剂的步骤包括：将镍源和保护剂混合，得到第一混合物；将铁源与所述第一混合物混合，得到第二混合物；在20℃～60℃的条件下，使所述第二混合物在密闭反应器中反应12h～48h，得到所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。发明人发现，该方法操作简单、方便，容易实现，易于工业化生产，且可以有效制备得到前面所述的显色剂。

根据本发明的实施例，所述镍源包括硝酸镍、氯化镍、硫酸镍、磷酸镍、乙酸镍和草酸镍中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述铁源包括铁氰酸盐。

根据本发明的实施例，所述铁源为铁氰化钾。

根据本发明的实施例，所述保护剂包括柠檬酸盐。

根据本发明的实施例，所述保护剂为柠檬酸钠。

根据本发明的实施例，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比为(1～5)：(2.5～7.5)：(0.5～4)。

根据本发明的实施例，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比为3：4.5：2。

根据本发明的实施例，在40℃的条件下，使所述第二混合物反应。

根据本发明的实施例，使所述第二混合物反应24h。

在本发明的又一个方面，本发明提供了一种使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法。根据本发明的实施例，所述待测样品为液体样品，所述方法包括：将所述第一试剂与待测样品混合，得到预制反应液；将所述预制反应液与所述第二试剂混合，得到有色反应液；使光线照射所述有色反应液；根据所述光源发出的光透过所述有色反应液的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。发明人发现，该方法线性范围宽，可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围，检出限低、灵敏度高，稳定性强、重现性好，可实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

根据本发明的实施例，在将所述第一试剂与所述待测样品混合时，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为50μg/mL～200μg/mL。

根据本发明的实施例，在将所述第一试剂与所述待测样品混合时，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL。

根据本发明的实施例，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为6.0～9.0。

根据本发明的实施例，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为7.0。

根据本发明的实施例，该方法包括将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管中，得到预制反应液；将位于所述液体输送管中的所述预制反应液和所述第二试剂同步通入与所述液体输送管相连通的透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的所述有色反应液；使光学显微镜的光源发出的光照射所述有色反应液；利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照，并将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号；根据所述数字信号的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。

根据本发明的实施例，该方法包括将所述第一试剂和空白对照液连续同步通入所述液体输送管中，并将得到的混合溶液通入固定在所述光学显微镜的拍照视野内且与所述液体输送管相连通的所述透明毛细管中，使所述光学显微镜的光源发出的光照射所述透明毛细管，利用所述拍照模块对所述透明毛细管进行多次拍照，并将所得到的多张照片中显示的多个光强度信号转化为多个数字信号，计算多个所述数字信号的强度的平均值，记为背景光强度I₀；配制一系列不同浓度的硫化氢标准溶液，并分别将一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液和所述第一试剂同步通入所述液体输送管中，得到一系列所述预制反应液，分别将位于所述液体输送管中的所述一系列预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的一系列有色反应液，分别使所述光源发出的光照射所述一系列有色反应液，分别利用所述拍照模块对所述一系列有色反应液进行多次拍照，并分别将所得到的多组照片中显示的多组光强度信号转化为多组数字信号，分别计算得到多组所述数字信号的强度的平均值，记为I₁，I₂，······，I_n-1，I_n，并分别计算所述I₁，I₂，······，I_n-1，I_n与所述背景光强度I₀之差，得到多组标准光强度差值I₁-I₀，I₂-I₀，······，I_n-1-I₀，I_n-I₀，分别计算标准光强度差值与背景光强度I₀的多组标准光强度比例，记为(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，······，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀，其中，n为所述一系列不同浓度的硫化氢标准溶液的数量；计算一系列lgC的值，其中，所述C为一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液的摩尔浓度；根据所述多组标准光强度比例(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，······，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀的值和一系列所述lgC的值，确定标准曲线方程；将所述第一试剂和待测样品同步通入所述液体输送管中，得到所述预制反应液；将位于所述液体输送管中的预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的有色反应液；使光学显微镜的光源发出的光照射所述有色反应液；利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照，将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号，记为I_x，计算所述I_x与所述背景光强度I₀之差，得到所述待测样光强度差值I_x-I₀，并计算所述待测样的光强度比例(I_x-I₀)/I₀；将所述待测样光强度比例(I_x-I₀)/I₀代入所述标准曲线方程，计算得到所述待测样品中硫化氢的含量。

根据本发明的实施例，所述空白对照液包括人工脑脊液。

根据本发明的实施例，所述n的取值范围为3～10。

根据本发明的实施例，所述n为6。

根据本发明的实施例，所述C的取值范围为0.1μmol/L～20μmol/L。

根据本发明的实施例，所述C为0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。

根据本发明的实施例，所述拍照模块的拍摄模式为物镜40X，黑白模式。

根据本发明的实施例，所述液体输送管和所述透明毛细管的至少之一的内径为200μm～300μm。

根据本发明的实施例，所述液体输送管和所述透明毛细管的至少之一的内径为240μm～260μm。

根据本发明的实施例，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中的速度为1μL/min～5μL/min。

根据本发明的实施例，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中的速度为2μL/min。

根据本发明的实施例，将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管中的速度为1μL/min～5μL/min。

根据本发明的实施例，将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管中的速度为2μL/min。

根据本发明的实施例，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品通入所述液体输送管中的速度与将所述预制反应液和所述第二试剂通入所述透明毛细管中的速度相同。

根据本发明的实施例，在将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管中至少经过第一预定时间以后，将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中。

根据本发明的实施例，所述第一预定时间为450s。

根据本发明的实施例，所述将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中至少经过第二预定时间以后，利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照。

根据本发明的实施例，所述第二预定时间为450s。

根据本发明的实施例，所述多次拍照之间的时间间隔为1ms～5s。

根据本发明的实施例，所述拍照的曝光时间为40ms～45ms。

根据本发明的实施例，所述拍照的样本区域的形状为正方形。

根据本发明的实施例，所述样本区域的边长为250μm。

根据本发明的实施例，所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中至完成所述拍照的时间不少于20min。

根据本发明的实施例，所述方法满足以下条件的至少之一：所述标准曲线方程为(I-I₀)/I₀＝0.0116×lgC+0.0203；线性相关系数R₂不小于0.983；线性范围为0.1μmol/L～20μmol/L；检出限不高于33nmol/L。

在本发明的再一个方面，本发明提供了一种用于实施前面所述方法的装置。发明人发现，该装置结构简单，且可以有效实施前面所述的方法。

根据本发明的实施例，所述装置包括：液体输送管，所述液体输送管具有第一开口、第二开口和第三开口，所述第一开口和所述第二开口位于所述液体输送管的第一端，其中，所述第一开口用于通入所述待测样品，所述第二开口用于通入所述第一试剂，所述第三开口位于所述液体输送管的第二端；透明毛细管，所述透明毛细管具有第四开口、第五开口和第六开口，所述第四开口和所述第五开口位于所述透明毛细管的第一端，其中，所述第四开口与所述第三开口相连通，用于通入所述预制反应液，所述第五开口用于通入所述第二试剂，所述第六开口位于所述透明毛细管的第二端，用于排出经过拍照的所述有色反应液；光学显微镜，所述光学显微镜具有拍照模块，至少部分所述透明毛细管位于所述光学显微镜的拍照视野内。

附图说明

图1显示了本发明一个实施例的制备显色剂中第一试剂的步骤的流程示意图。

图2显示了本发明一个实施例的使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的流程示意图。

图3显示了本发明一个实施例的实施使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量方法的装置的结构(a)及检测原理示意图(b)。

图4显示了本发明实施例2～实施例10的使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法中光源发出的光透过有色反应液的强度与硫化氢在待测样品中的浓度的关系曲线。

图5显示了本发明实施例11的使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的线性测定结果。

图6显示了本发明实施例11的使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的稳定性测定结果。

图7显示了本发明实施例11的使用显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的重现性测定结果。

附图标记：

1：液体输送管 2：透明毛细管 3：第二送样管 4：第三送样管 5：第一送样管 6：第四送样管 7：第一泵 8：第二泵 9：第三泵 10：光源 50：拍照模块 100：含有铁和镍的普鲁士蓝类似物 200：还原型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺 300：氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺 400：硫化氢 500：反应产物 600：具有较浅蓝色的还原型3,3',5,5'-四甲基联苯胺和氧化型3,3',5,5'-四甲基联苯胺的混合物

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明是基于发明人的以下发现而完成的：

发明人基于对含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的性质进行了大量深入的考察与实验验证后，发明人发现，参照图3中的b图，含有铁和镍的普鲁士蓝类似物100具有较好的类氧化酶的性质，其在与还原型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺200混合以后，能够催化还原型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺200(无色)与氧气反应，并使其氧化成氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺300(蓝色)。然而，硫化氢400能够与含有铁和镍的普鲁士蓝类似物100发生化学反应，值得注意的是，生成的反应产物500却不能催化还原型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺200(无色)与氧气反应，也不能使其氧化成氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(蓝色)。当硫化氢400与含有铁和镍的普鲁士蓝类似物100发生反应时，该反应会消耗含有铁和镍的普鲁士蓝类似物100，从而含有铁和镍的普鲁士蓝类似物100的含量降低，其将3,3',5,5'-四甲基联苯胺200(无色)催化氧化成氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺300(蓝色)的能力也会相应减弱，氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(蓝色)的含量相应减少，颜色则会相应变浅，从产物外观上而言只能看到具有较浅蓝色的还原型3,3',5,5'-四甲基联苯胺和氧化型3,3',5,5'-四甲基联苯胺的混合物600。此时，若使光源发出的光线照射前面所述的氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，则透过所述氧化型的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的光线会相应增多，光的强度值也会相应增加。由此，可以基于该光线的强度值的强弱变化，来定量检测硫化氢的含量。

有鉴于此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测硫化氢含量的显色剂。根据本发明的实施例，该显色剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括含有铁和镍的普鲁士蓝类似物，所述第二试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺。发明人发现，该显色剂制备工艺简单、原料易得、成本较低，易于工业化生产，利用该显色剂检测硫化氢含量时，线性范围宽，可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围，检出限低、灵敏度高，稳定性强、重现性好，可实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

根据本发明的实施例，在本发明中，需要说明的是，显色剂的第一试剂和第二试剂分开使用，在显色剂不使用时，第一试剂和第二试剂并不是混合放置的，而是需要分别放置的。在开始使用该显色剂之前，直接将本发明中的第一试剂和第二试剂混合，是无法实现本发明的技术效果的。

根据本发明的实施例，进一步地，所述第一试剂中包括的含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的外观形状可以是立方体。由此，该含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的制备工艺较为简单、同时，能够具有较好的类氧化酶的活性。

根据本发明的实施例，进一步地，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的粒径不大于90nm。在本发明的一些具体的实施例中，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的粒径可以具体为55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm或者90nm等；更进一步地，含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的粒径应不大于60nm。由此，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的粒径在上述范围内，其粒径较小，能够具有较好的类氧化酶性质。

根据本发明的实施例，进一步地，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物中，所述铁和所述镍的摩尔比可以为(1～2)：(1～2)。具体地，在本发明的一些实施例中，所述铁和所述镍的摩尔比可以为1：1、1：2或者2：1等。由此，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物中所述铁和所述镍的摩尔比在上述范围内，其比例较为合适，铁和镍之间可以发挥较优的协同作用，进而使得含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的类氧化酶性质较佳。

根据本发明的实施例，更进一步地，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的化学式可以为KNi[Fe(CN)₆]。由此，该含有铁和镍的普鲁士蓝类似物与硫化氢之间的反应是按照下式进行的：

2KNi[Fe(CN)₆]+3H₂S＝＝2[Fe(CN)₆]^4-+2NiS+S+2K⁺+6H⁺；

其中，KNi[Fe(CN)₆]中的各原子之间可以发挥更好的协同作用，进而使得该含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的类氧化酶性质达到最佳。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备前面所述的显色剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括制备所述第一试剂的步骤；和制备所述第二试剂的步骤，其中，参照图1，制备所述第一试剂的步骤包括：

S1：将镍源和保护剂混合，得到第一混合物。

根据本发明的实施例，所述镍源的具体种类可以包括硝酸镍、氯化镍、硫酸镍、磷酸镍、乙酸镍和草酸镍中的至少一种。具体地，在本发明的一些实施例中，所述镍源可以为硝酸镍。由此，材料来源广泛、易得，且成本较低；同时，加入硝酸镍所引入的硝酸根相较于其他种类的阴离子而言，不会发生反应，故不会对后续反应产生不良影响。

根据本发明的实施例，所述保护剂包括柠檬酸盐。具体地，在本发明的一些实施例中，所述保护剂可以为柠檬酸钠。由此，材料来源广泛、易得，且成本较低；同时，可以较好地对反应体系中的其他反应物起到保护作用，以防止副反应的发生，利于后续应用。

S2：将铁源与所述第一混合物混合，得到第二混合物。

根据本发明的实施例，所述铁源可以包括铁氰酸盐。具体地，在本发明的一些实施例中，所述铁源可以为铁氰化钾。由此，材料来源广泛、易得，且成本较低；同时，可以较为有效地制备得到前面所述的含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。

根据本发明的实施例，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比可以为(1～5)：(2.5～7.5)：(0.5～4)。在本发明的一些实施例中，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比可以具体为3：4.5：2。由此，可以有效制备得到前面所述的具有最佳类氧化酶性质的KNi[Fe(CN)₆]。

S3：在20℃～60℃的条件下，使所述第二混合物在密闭反应器中反应12h～48h，得到所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。

根据本发明的实施例，上述步骤中的温度可以具体为20℃、30℃、40℃、50℃或者60℃等。具体地，在本发明的一些实施例中，在40℃的条件下，使所述第二混合物反应。由此，操作简单、方便，容易实现，反应条件温和，易于工业化生产，且可以有效制备得到前面所述的含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。

根据本发明的实施例，上述步骤中的时间可以具体为12h、24h、36h或者48h等。具体地，在本发明的一些实施例中，使所述第二混合物反应24h。由此，操作简单、方便，容易实现，生产效率较高，易于工业化生产，且可以有效制备得到前面所述的含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。

另外，根据本发明的实施例，制备所述第二试剂的步骤可以包括：在常温条件下，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末溶解于有机溶剂中后，加入稳定剂。在本发明的一些实施例中，所述有机溶剂可以具体为二甲亚砜，所述稳定剂可以具体为柠檬酸。前面所述的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的溶解方式即为本领域中常规的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶解方式，在此不再过多赘述。

在本发明的又一个方面，本发明提供了一种使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法。根据本发明的实施例，所述待测样品为液体样品，参照图2和图3中的a图，所述方法包括以下步骤：

S10：将所述第一试剂与待测样品混合，得到预制反应液。

根据本发明的实施例，在将所述第一试剂与所述待测样品混合时，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为50μg/mL～200μg/mL。具体地，在本发明的一些实施例中，所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度可以为50μg/mL、70μg/mL、100μg/mL、150μg/mL或者200μg/mL等。进一步地，发明人发现，当使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL时，在后续使光源发出的光线照射有色反应液时，拍摄转换并记录透过所述有色反应液的光的强度值，进一步计算的与背景光强度I₀的光强度比例(I-I₀)/I₀比例与硫化氢摩尔浓度的对数值呈现十分良好的线性关系，进而使得该使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的线性良好。

根据本发明的实施例，具体地，参照图3中的a图，将所述第一试剂与待测样品混合，得到预制反应液的步骤可以是将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管1中，得到预制反应液。进一步来说，所述第一试剂可以是通过先将其装入第一泵7中，然后通过两端分别与第一泵7和液体输送管1的一端相连接的第一送样管5通入所述液体输送管1中的；所述待测样品可以是通过先将待测样品的溶剂装入第二泵8中，再通过两端分别与所述第二泵8和待测样品连接的第二送样管3将所述溶剂通入待测样品中取样，最后再使所述第二泵8继续施加压力，进而将待测样品通过一端与其相连接、另一端与液体输送管1相连接的第三送样管4通入所述液体送样管1中。由此，将所述第一试剂和待测样品均通入所述液体输送管1中，从而将所述第一试剂与所述待测样品混合。

S20：将所述预制反应液与所述第二试剂混合，得到有色反应液。

根据本发明的实施例，具体地，参照图3中的a图，将所述预制反应液与所述第二试剂混合，得到有色反应液的步骤可以是将所述预制反应液与所述第二试剂同步通入透明毛细管2中，得到有色反应液。进一步来说，所述预制反应液可以是通过S10中的具体步骤形成在所述液体输送管1中的，该预制反应液可以通过第一泵7和第二泵8所施加的压力从液体输送管1中通入所述透明毛细管2中；所述第二试剂可以是通过先将其装入第三泵中，然后通过两端分别与第三泵9和液体输送管1的一端相连接的第四送样管6通入所述透明毛细管2中的。由此，将所述预制反应液和第二试剂均通入所述透明毛细管2中，从而将所述预制反应液与所述第二试剂混合。

在本发明的一个具体的实施例中，前面所述的将所述第一试剂与待测样品混合和将所述预制反应液与所述第二试剂混合可以是连续进行的。也就是说，同时对第一泵7、第二泵8和第三泵9施加压力，在将所述第一试剂与待测样品混合，在所述液体输送管1中得到预制反应液的同时，继续施加压力以将预制反应液通入所述透明毛细管2中，在继续将预制反应液通入所述透明毛细管2中，所述第二试剂也进入所述透明毛细管2。由此，将所述预制反应液和第二试剂均通入所述透明毛细管2中，从而将所述预制反应液与所述第二试剂混合，且操作简单、方便，容易实现，易于产业化；同时，由于上述方案可以实现将待测样品连续通入该透明毛细管2中，故可以使得本发明所述的方法实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

S30：使光线照射所述有色反应液。

根据本发明的实施例，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为6.0～9.0。具体地，在本发明的一些实施例中，可以使所述有色反应液的pH值为6.0、7.0、8.0或者9.0等。进一步地，发明人发现，当使所述有色反应液的pH值为7.0时，在后续使光源发出的光线照射有色反应液时，拍摄转换并记录透过所述有色反应液的光的强度值，进一步计算的与背景光强度I₀的光强度比例(I-I₀)/I₀比例与硫化氢摩尔浓度的对数值呈现十分良好的线性关系，进而使得该使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的线性良好。

根据本发明的实施例，使光线照射所述有色反应液的具体方式可以是利用光学显微镜的光源发出的光对其进行照射的。由此，在利用光学显微镜的光源发出的光对其进行照射时，在后续应用中可以采用光学显微镜的拍照模块50对有色反应液进行拍照，操作简单、方便，容易实现，易于产业化，且通过所收集的光线的强度值信号来对待测样品中的硫化氢含量进行分析，其仪器设备简单、成本较低，灵敏度高。

S40：根据所述光源发出的光透过所述有色反应液的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。

根据本发明的实施例，具体而言，可以是先利用所述光学显微镜的拍照模块50对所述有色反应液进行拍照，并将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号，而后根据所述数字信号的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。由此，操作简单、方便，容易实现，易于产业化。

在本发明一个具体的实施例中，参照图3中的a图，该方法包括以下步骤：

S100：将所述第一试剂和空白对照液连续同步通入所述液体输送管1中，并将得到的混合溶液通入固定在所述光学显微镜的拍照视野内且与所述液体输送管1相连通的所述透明毛细管2中，使所述光学显微镜的光源10发出的光照射所述透明毛细管2，利用所述拍照模块50对所述透明毛细管2进行多次拍照，并将所得到的多张照片中显示的多个光强度信号转化为多个数字信号，计算多个所述数字信号的强度的平均值，记为背景光强度I₀。

根据本发明的实施例，所述空白对照液包括人工脑脊液。由此，可以使得该方法特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

根据本发明的实施例，所述拍照模块50的拍摄模式为物镜40X，黑白模式。由此，可实现最优的拍摄及检测效果：设置物镜为40X，目的在于使视野中大部分面积为毛细管内部，更加易于选定光强度识别区域，且识别信号不易受到管壁对光线的折射影响；同时只有在应用黑白拍摄模式时，所述来自光学显微镜光源的光线透过有色溶液后的光强度，可与待测样品浓度间存在计量关系，以实现定量分析。

根据本发明的实施例，所述液体输送管1和所述透明毛细管2的至少之一的内径为200μm～300μm。具体地，在本发明的一些实施例中，所述液体输送管1和所述透明毛细管2的至少之一的内径可以是200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm或者300μm等。进一步地，所述液体输送管1和所述透明毛细管2的至少之一的内径为240μm～260μm。由此，可以保证对硫化氢检测的稳定性，且使得时间分辨率满足实验要求，既不会因为该内径过低而导致管路堵塞，影响实验数据稳定性，也不会因为该内径过高而导致时间分辨率过低。

根据本发明的实施例，所述多次拍照之间的时间间隔为1ms～5s。具体地，在本发明的一些实施例中，所述多次拍照之间的时间间隔可以为1ms、10ms、100ms、1s、3s或者5s等。进一步地，所述多次拍照之间的时间间隔为5s。由此，设置该时间间隔越短，即可更加灵敏的连续监测快速化学反应过程，由于本发明中所述硫化氢在活体脑内神经化学过程中的变化，以及显色剂对硫化氢的响应速度均在秒分辨率级别，因此设置时间间隔为5s即可满足试验要求。

根据本发明的实施例，所述拍照的曝光时间为40ms～45ms。具体地，在本发明的一些实施例中，所述拍照的曝光时间可以为40ms、41ms、42ms、43ms、44ms或者45ms等。进一步地，所述拍照的曝光时间为43ms。由此，可以使得图片亮度在准确的可识别范围内，以保证分析方法的准确性，既不会因为该曝光时间过短而使得拍摄图片过暗，导致识别的光强度值低，从而影响分析准确性；也不会因为该曝光时间过长而使得拍摄到的图片过亮，导致识别的光强度值高，从而影响分析准确性。

根据本发明的实施例，所述样本区域的边长为250μm。由此，可以使得整个毛细管内径均被包括在光强度识别区域内。

根据本发明的实施例，所述拍照的样本区域的形状为正方形。由此，可以使得光强度识别区域位于显微镜视野正中间，且此部分对应的毛细管的死体积被计算为此分析方法的检测器死体积，具体为0.0113μL。此检测器的极小死体积保证了与传统在线方法相比的极高时间分辨率。

S200：配制一系列不同浓度的硫化氢标准溶液，并分别将一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液和所述第一试剂同步通入所述液体输送管1中，得到一系列所述预制反应液，分别将位于所述液体输送管1中的所述一系列预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管2中，得到位于所述透明毛细管2中的一系列有色反应液，分别使所述光源10发出的光照射所述一系列有色反应液，分别利用所述拍照模块50对所述一系列有色反应液进行多次拍照，并分别将所得到的多组照片中显示的多组光强度信号转化为多组数字信号，分别计算得到多组所述数字信号的强度的平均值，记为I₁，I₂，······，I_n-1，I_n，分别计算所述I₁，I₂，······，I_n-1，I_n与所述背景光强度I₀之差，得到多组标准光强度差值I₁-I₀，I₂-I₀，······，I_n-1-I₀，I_n-I₀，进一步分别计算标准光强度差值与背景光强度I₀的多组标准光强度比例，记为(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，······，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀，其中，n为所述一系列不同浓度的硫化氢标准溶液的数量。

根据本发明的实施例，所述n的取值范围为3～10。具体地，在本发明的一些实施例中，所述n的取值可以是3、4、5、6、7、8、9或者10等。进一步地，所述n可以为6。由此，可以得到对硫化氢在线连续检测的线性关系浓度分析区间。

根据本发明的实施例，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管1中，以及将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管2中的速度均为1μL/min～5μL/min。具体地，在本发明的一些实施例中，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管1中的速度可以是1μL/min、2μL/min、3μL/min、4μL/min或者5μL/min等。进一步地，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管1中，以及将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管2中的速度可以为2μL/min。由此，可以使得硫化氢在线连续检测的高效和稳定，既不会因为该速度过高而导致管路体系中压力过大而损坏，以及微透析过程中透析效率低的问题，也不会因为该速度过低而导致分析速度缓慢，分析效率降低的问题。

根据本发明的实施例，更进一步地，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品通入所述液体输送管1中的速度与将所述预制反应液和所述第二试剂通入所述透明毛细管2中的速度相同。由此，可以使得本发明所述的方法实现快速、实时、连续对待测样品中的硫化氢进行检测，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

S300：计算一系列lgC的值，其中，所述C为一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液的摩尔浓度。

根据本发明的实施例，所述C的取值范围为0.1μmol/L～20μmol/L。具体地，在本发明的一些实施例中，所述C可以具体为0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。由此，该方法线性范围较宽，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

S400：根据所述多组标准光强度比例(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，……，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀的值和一系列所述lgC的值，确定标准曲线方程。

在本发明的一些实施例中，所述标准曲线方程可以为(I-I₀)/I₀＝0.0116×lgC+0.0203，线性相关系数R²不小于0.983。具体地，所述线性相关系数R²可以为0.983。由此，该方法可完全覆盖硫化氢的生理浓度范围，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

S500：将所述第一试剂和待测样品同步通入所述液体输送管中，得到所述预制反应液。

根据本发明的实施例，在将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管中至少经过第一预定时间以后，将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中。具体地，在本发明的一些实施例中，所述第一预定时间可以为450s。由此，可以使得所述第一试剂和待测样品之间的反应较为稳定，得到较为稳定的预制反应液以后，才将其通入所述透明毛细管中，从而利于后续反应。

根据本发明的实施例，所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中至完成所述拍照的时间不少于20min。具体地，在本发明的一些实施例中，例如，将空白对照液通入所述液体输送管20min以后，转换为第一所述硫化氢标准溶液通入所述液体输送管20min，再依次通入其余硫化氢标准溶液且每个所述硫化氢标准溶液的通入所述液体输送管的持续时间均为20min，再通入将所述待测样品通入所述液体输送管，持续时间也为20min，并完成拍照，如待测样品为多个，依次将各所述待测样品通入所述液体输送管20min并拍照即可。由此，可以使得本发明所述的显色剂与样品充分反应、系统显色稳定，同时为可以较好地避免相邻通入的样品之间的相互干扰。

S600：将位于所述液体输送管中的预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的有色反应液。

根据本发明的实施例，所述将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中至少经过第二预定时间以后，利用所述光学显微镜的拍照模块50对所述有色反应液进行拍照。具体地，在本发明的一些实施例中，所述第二预定时间可以为450s。由此，可以使得所述第二试剂和预制反应液之间的反应较为稳定

S700：使光学显微镜的光源发出的光照射所述有色反应液。

S800：利用所述光学显微镜的拍照模块50对所述有色反应液进行拍照，将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号，记为I_x，计算所述I_x与所述背景光强度I₀之差，得到所述待测样光强度差值I_x-I₀，并计算所述待测样的光强度比例(I_x-I₀)/I₀。

S900：将所述待测样光强度比例(I_x-I₀)/I₀代入所述标准曲线方程，计算得到所述待测样品中硫化氢的含量。

根据本发明的实施例，本发明所述的方法的线性范围为0.1μmol/L～20μmol/L。由此，该方法线性范围较宽，适用于大部分环境下硫化氢的检测，应用范围广泛，且特别适合用于活体脑神经生理过程中硫化氢的检测。

根据本发明的实施例，本发明所述的方法的检出限不高于33nmol/L。具体地，在本发明的一些实施例中，所述检出限可以是33nmol/L。由此，该方法检出限低、灵敏度高。

在本发明的再一个方面，本发明提供了一种用于实施前面所述方法的装置。发明人发现，该装置结构简单，且可以有效实施前面所述的方法。

根据本发明的实施例，参照图3中的a图，所述装置包括：液体输送管1，所述液体输送管1具有第一开口、第二开口和第三开口，所述第一开口和所述第二开口位于所述液体输送管的第一端，其中，所述第一开口用于通入所述待测样品，所述第二开口用于通入所述第一试剂，所述第三开口位于所述液体输送管的第二端；透明毛细管2，所述透明毛细管2具有第四开口、第五开口和第六开口，所述第四开口和所述第五开口位于所述透明毛细管的第一端，其中，所述第四开口与所述第三开口相连通，用于通入所述预制反应液，所述第五开口用于通入所述第二试剂，所述第六开口位于所述透明毛细管的第二端，用于排出经过拍照的所述有色反应液；光学显微镜，所述光学显微镜具有拍照模块50，至少部分所述透明毛细管位于所述光学显微镜的拍照视野内。由此，该装置结构简单、成本较低，直接使用了相关技术中的部件进行搭建，且可以有效实施前面所述的方法。

下面详细描述本发明的实施例。下述实施例中的试剂包括：3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，抗坏血酸(AA)，柠檬酸(C₆H₈O₇)，柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，硫化钠(Na₂S)，铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])，氢氧化钠(NaOH)，硝酸镍[Ni(NO₃)₂·6H₂O]，过氧化氢(H₂O₂，30％)，盐酸(HCl，37％)，二甲基亚砜(DMSO)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，氯化钙(CaCl₂)，氯化镁(MgCl₂)，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，碳酸氢钠(NaHCO₃)，硫酸钠(Na₂SO₄)所有试剂均为分析纯，除特殊说明，所提及的水溶剂均为二次水。所有实验均在室温条件下完成。显微镜下拍摄透过透明毛细管中的液体样品的光强度值，所用到的毛细管内径为250μm。人工脑脊液(aCSF)的配制：126mMNaCl，2.4mMKCl，0.5mM KH₂PO₄，0.85mMMgCl₂，27.5mM NaHCO₃，0.5mM Na₂SO₄，1.1mM CaCl₂。aCSF作为部分硫化氢标准溶液和待测溶液的溶剂。

实施例1

制备显色剂的方法

1、制备第一试剂的步骤：

将0.9mmol的柠檬酸钠和0.6mmol的硝酸镍溶解在20mL蒸馏水中作为溶液A；同时将0.4mmol的铁氰化钾溶解于10mL蒸馏水中作为溶液B。在磁力搅拌下在室温下将溶液B快速加入到溶液A中搅拌1分钟，后将烧杯密封并在40℃下加热24小时。离心分离，用双蒸水洗涤两次，在60℃下干燥过夜，再将所得到的产物溶于水中，得到所述第一试剂。

2、制备第二试剂的步骤：

将10mg TMB分散于1mL的DMSO中，加入0.1mM的柠檬酸溶液1mL后定容至40mL，即得到2mM的所述第二试剂。

实施例2

将实施例1制备得到的显色剂以50μg/mL的第一试剂的浓度条件和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s(需要说明的是，在实施例中，液体输送管与透明毛细管的长度相同，此处时间包括450s的第一预定时间和450s的第二预定时间，后文中不在重复赘述)后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间为43ms，用图像分析软件CellSens Dimension 2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与前面所述的显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的A图中。

实施例3

将实施例1制备得到的显色剂以70μg/mL的第一试剂的浓度条件和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间为43ms，用图像分析软件CellSens Dimension 2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与前面所述的显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的A图中。

实施例4

将实施例1制备得到的显色剂以100μg/mL的第一试剂的浓度条件和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间为43ms，用图像分析软件CellSens Dimension 2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与前面所述的显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的A图中。

实施例5

将实施例1制备得到的显色剂以150μg/mL的第一试剂的浓度条件和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间为43ms，用图像分析软件CellSens Dimension2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与前面所述的显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的A图中。

实施例6

将实施例1制备得到的显色剂以200μg/mL的第一试剂的浓度条件和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间为43ms，用图像分析软件CellSens Dimension 2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与前面所述的显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的A图中。

由实施例2～实施例6的实验结果可知，当使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL时，在后续使光源发出的光线照射有色反应液时，拍摄转换并记录透过所述有色反应液的光的强度值，进一步计算的与背景光强度I₀的光强度比例(I-I₀)/I₀与硫化氢摩尔浓度的对数值呈现十分良好的线性关系，进而使得该使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的线性良好。

实施例7

在实施例2～实施例6的基础上，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为6.0，与aCSF共同同步通入透明毛细管中，稳定后连续拍照，并将光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中，硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的B图中。

实施例8

在实施例2～实施例6的基础上，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为7.0，与aCSF共同同步通入透明毛细管中，稳定后连续拍照，并将光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中，硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的B图中。

实施例9

在实施例2～实施例6的基础上，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为8.0，与aCSF共同同步通入透明毛细管中，稳定后连续拍照，并将光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中，硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的B图中。

实施例10

在实施例2～实施例6的基础上，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为9.0，与aCSF共同同步通入透明毛细管中，稳定后连续拍照，并将光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀。

待aCSF通入20min后，分别用4份不同浓度的硫化氢标准品替代aCSF，依次与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中，硫化氢浓度分别为5μM、10μM、20μM以及50μM。每个标准品的通入时间均为20min，采用与前面所述相同的方法进行拍照、信号转化后，分别得到4个(5组)光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，并以硫化氢浓度为横坐标，光强度数值为纵坐标作图，结果显示于图4的B图中。

由实施例7～实施例10的实验结果可知，当使所述有色反应液的pH值为7.0时，在后续使光源发出的光线照射有色反应液时，拍摄转换并记录透过所述有色反应液的光的强度值，进一步计算的与背景光强度I₀的光强度比例(I-I₀)/I₀比例与硫化氢摩尔浓度的对数值呈现十分良好的线性关系，进而使得该使用前面所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法的线性良好。

实施例11

采用实施例1制备得到的显色剂，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150μg/mL；使所述有色反应液的pH值为7.0，在光学在线体系中对硫化氢进行监测。具体步骤如下：

(1)将实施例1制备得到的显色剂和aCSF持续以2μL/min的速度，同步通入固定在光学显微镜下的内径250μm的透明毛细管中，通入900s后用光学显微镜(物镜40X、黑白模式)在150s内用光学显微镜对所述透明毛细管连续拍照30次，每隔5s拍照一次、每次曝光时间43ms，用图像分析软件CellSens Dimension 2.1将连续拍照所得的30张照片的光强信号分别转化为数字信号，取平均值，作为光强数值I₀；

(2)待aCSF通入20min后，分别用6份不同浓度的硫化氢的混合标准品替代aCSF，依次与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中。硫化氢浓度分别为0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM以及20μM(参照图5中的A图和B图)，每个标准品的通入时间均为20min，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到6个光强数值I₁，I₂，I₃，I₄，I₅，I₆，分别求得与I₀的光强差值I₁-I₀，I₂-I₀，I₃-I₀，I₄-I₀，I₅-I₀，I₆-I₀，进一步分别计算光强度差值与背景光强度I₀的光强度比例(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，(I₃-I₀)/I₀，(I₄-I₀)/I₀，(I₅-I₀)/I₀，(I₆-I₀)/I₀；

(3)分别以所述6份硫化氢标准品的浓度为横坐标、相应的光强差值比例为纵坐标，在平面直角坐标系中做图(参照图5中B图的插图)，得到硫化氢浓度对光强差值的标准曲线方程(I-I₀)/I₀＝0.0116×lgC+0.0203；

(4)将待测样品与所述显色剂持续同步通入所述透明毛细管中，采用与步骤(1)相同的方法进行拍照、信号转化后，得到硫化氢浓度对应的光强数值I_x，求得与I₀的光强差值I_x-I₀，并计算所述待测样的光强度比例(I_x-I₀)/I₀；

(5)将所述光强差值比例(I_x-I₀)/I₀代入步骤(3)对应待测物所得的标准曲线方程中，求得对应硫化氢的浓度C，即为待测样品中硫化氢的浓度。

本实施例所得标准曲线方程如图5中B图的插图所示，线性相关系数为0.983，说明本发明提供的方法对0.1μM～20μM的硫化氢浓度有良好的响应。

采用实施例1制备得到的显色剂，与实施例11所述相同的步骤，在光学在线体系中对硫化氢进行稳定性和重现性响应监测。具体步骤如下：

a、以实施例11的第(1)步中所述的方式通入显色剂和aCSF，并稳定20min；以上述方法利用显微镜拍照，并记录光强度；

b、在上述步骤a的基础上，如图6所示，使10μM的硫化氢标准样品替代aCSF，与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中至少维持5000s，记录实时变化光强度情况。由图6可知，本发明所述的方法的稳定性强；

c、在上述步骤a的基础上，如图7所示，使20μM硫化氢标准样品替代aCSF，与所述显色剂持续通入所述透明毛细管中，使aCSF与20μM硫化氢标准样品依次相互替代9次，记录实时变化光强度情况。由图7可知，本发明所述的方法的重现性强。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (43)

1.一种用于检测硫化氢含量的显色剂，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括含有铁和镍的普鲁士蓝类似物，所述第二试剂包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺，其中，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物满足以下条件的至少之一：

形状为立方体；

粒径不大于90 nm；

所述铁和所述镍的摩尔比为（1~2）：（1~2）；

化学式为KNi[Fe(CN)₆]。

2.根据权利要求1所述的用于检测硫化氢含量的显色剂，其特征在于，所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的粒径不大于60nm。

3.一种制备权利要求1或2所述的显色剂的方法，其特征在于，包括制备所述第一试剂的步骤；和制备所述第二试剂的步骤，

其中，制备所述第一试剂的步骤包括：

将镍源和保护剂混合，得到第一混合物；

将铁源与所述第一混合物混合，得到第二混合物；

在20℃~60℃的条件下，使所述第二混合物在密闭反应器中反应12 h~48 h，得到所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物。

4.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述镍源包括硝酸镍、氯化镍、硫酸镍、磷酸镍、乙酸镍和草酸镍中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述铁源包括铁氰酸盐。

6.根据权利要求5所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述铁源为铁氰化钾。

7.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述保护剂包括柠檬酸盐。

8.根据权利要求7所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述保护剂为柠檬酸钠。

9.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比为（1~5）：（2.5~7.5）：（0.5~4）。

10.根据权利要求9所述的制备显色剂的方法，其特征在于，所述镍源、所述保护剂和所述铁源的摩尔比为3：4.5：2。

11.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，在40℃的条件下，使所述第二混合物反应。

12.根据权利要求3所述的制备显色剂的方法，其特征在于，使所述第二混合物反应24h。

13.一种使用权利要求1或2所述的显色剂检测待测样品中硫化氢含量的方法，其特征在于，所述待测样品为液体样品，所述方法包括：

将所述第一试剂与待测样品混合，得到预制反应液；

将所述预制反应液与所述第二试剂混合，得到有色反应液；

使光线照射所述有色反应液；

根据光源发出的光透过所述有色反应液的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在将所述第一试剂与所述待测样品混合时，使所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为50 µg/mL～200 µg/mL。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一试剂中所述含有铁和镍的普鲁士蓝类似物的浓度为150 µg/mL。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在使用所述光源照射所述有色反应液时，使所述有色反应液的pH值为6.0～9.0。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述有色反应液的pH值为7.0。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，包括：

将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管中，得到预制反应液；

将位于所述液体输送管中的所述预制反应液和所述第二试剂同步通入与所述液体输送管相连通的透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的所述有色反应液；

使光学显微镜的光源发出的光照射所述有色反应液；

利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照，并将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号；

根据所述数字信号的强度，确定所述待测样品中硫化氢的含量。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，包括：

将所述第一试剂和空白对照液连续同步通入所述液体输送管中，并将得到的混合溶液通入固定在所述光学显微镜的拍照视野内且与所述液体输送管相连通的所述透明毛细管中，使所述光学显微镜的光源发出的光照射所述透明毛细管，利用所述拍照模块对所述透明毛细管进行多次拍照，并将所得到的多张照片中显示的多个光强度信号转化为多个数字信号，计算多个所述数字信号的强度的平均值，记为背景光强度I₀；

配制一系列不同浓度的硫化氢标准溶液，并分别将一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液和所述第一试剂同步通入所述液体输送管中，得到一系列所述预制反应液，分别将位于所述液体输送管中的所述一系列预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的一系列有色反应液，分别使所述光源发出的光照射所述一系列有色反应液，分别利用所述拍照模块对所述一系列有色反应液进行多次拍照，并分别将所得到的多组照片中显示的多组光强度信号转化为多组数字信号，分别计算得到多组所述数字信号的强度的平均值，记为I₁，I₂，······，I_n-1，I_n，并分别计算所述I₁，I₂，······，I_n-1，I_n与所述背景光强度I₀之差，得到多组标准光强度差值I₁-I₀，I₂-I₀，······，I_n-1-I₀，I_n-I₀，分别计算标准光强度差值与背景光强度I₀的多组标准光强度比例，记为(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，······，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀，其中，n为所述一系列不同浓度的硫化氢标准溶液的数量；

计算一系列lgC的值，其中，所述C为一系列不同浓度的所述硫化氢标准溶液的摩尔浓度；

根据所述多组标准光强度比例(I₁-I₀)/I₀，(I₂-I₀)/I₀，······，(I_n-1-I₀)/I₀，(I_n-I₀)/I₀的值和一系列所述lgC的值，确定标准曲线方程；

将所述第一试剂和待测样品同步通入所述液体输送管中，得到所述预制反应液；

将位于所述液体输送管中的预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中，得到位于所述透明毛细管中的有色反应液；

使光学显微镜的光源发出的光照射所述有色反应液；

利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照，将所得到的照片中显示的光强度信号转化为数字信号，记为I_x，计算所述I_x与所述背景光强度I₀之差，得到所述待测样品光强度差值I_x-I₀，并计算所述待测样品的光强度比例(I_x-I₀)/I₀；

将所述待测样品的光强度比例(I_x-I₀)/I₀代入所述标准曲线方程，计算得到所述待测样品中硫化氢的含量。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述空白对照液包括人工脑脊液。

21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述n的取值范围为3~10。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述n为6。

23.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述C的取值范围为0.1 μmol/L～20 μmol/L。

24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述C为0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L或20 μmol/L。

25.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述拍照模块的拍摄模式为物镜40X，黑白模式。

26.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述液体输送管和所述透明毛细管的至少之一的内径为200 μm~300 μm。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述液体输送管和所述透明毛细管的至少之一的内径为240 μm~260 μm。

28.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中的速度为1 μL/min~5 μL/min。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中的速度为2 μL/min。

30.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管中的速度为1 μL/min~5 μL/min。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，将所述预制反应液和所述第二试剂中的至少之一通入所述透明毛细管中的速度为2 μL/min。

32.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，将所述第一试剂、所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品通入所述液体输送管中的速度与将所述预制反应液和所述第二试剂通入所述透明毛细管中的速度相同。

33.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，在将所述第一试剂和待测样品同步通入液体输送管中至少经过第一预定时间以后，将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中。

34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述第一预定时间为450 s。

35.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述将所述预制反应液和所述第二试剂同步通入所述透明毛细管中至少经过第二预定时间以后，利用所述光学显微镜的拍照模块对所述有色反应液进行拍照。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述第二预定时间为450 s。

37.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多次拍照之间的时间间隔为1 ms~5s。

38.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述拍照的曝光时间为40 ms~45 ms。

39.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述拍照的样本区域的形状为正方形。

40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述样本区域的边长为250 μm。

41.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述空白对照液、所述硫化氢标准溶液和所述待测样品中的至少之一通入所述液体输送管中至完成所述拍照的时间不少于20min。

42.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法满足以下条件的至少之一：

所述标准曲线方程为(I-I₀)/I₀= 0.0116×lgC + 0.0203；

线性相关系数R²不小于0.983；

线性范围为0.1 μmol/L～20 μmol/L；

检出限不高于33 nmol/L。

43.一种用于实施权利要求13~42中任一项所述方法的装置，

所述装置包括：

液体输送管，所述液体输送管具有第一开口、第二开口和第三开口，所述第一开口和所述第二开口位于所述液体输送管的第一端，其中，所述第一开口用于通入所述待测样品，所述第二开口用于通入所述第一试剂，所述第三开口位于所述液体输送管的第二端；

透明毛细管，所述透明毛细管具有第四开口、第五开口和第六开口，所述第四开口和所述第五开口位于所述透明毛细管的第一端，其中，所述第四开口与所述第三开口相连通，用于通入所述预制反应液，所述第五开口用于通入所述第二试剂，所述第六开口位于所述透明毛细管的第二端，用于排出经过拍照的所述有色反应液；

光学显微镜，所述光学显微镜具有拍照模块，至少部分所述透明毛细管位于所述光学显微镜的拍照视野内。

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