CN107024471A - 一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，借助鲁米诺‑过氧化氢体系，构建用于检测硫化氢的化学发光体系，通过不同浓度的硫化氢测定各发光体系的发光信号，信号强度和硫化氢浓度呈线性相关，根据得到的线性关系用于待测样品中硫化氢浓度的检测。本发明能够直接用于快速定量检测硫化氢，原料易得、成本低、操作简单、重现性好而且灵敏度高，有望在生命科学及医学临床检测等领域得到广泛应用。

Description

一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法。

背景技术

硫化氢（H₂S）已经被报道是生物体内扮演着重要功能的生物信号分子，它是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后被广泛认可的第三种气体递质。生物体内的硫化氢主要是三种酶反应的副产物产生的。硫化氢参与一系列的生理活动，比如保护血管流量和压力、调节细胞生长和死亡、减少缺血再灌注损伤、调节炎症以及与自由基反应产生的抗氧化效应等。生物体内硫化氢的浓度是受到严格控制的，正常血液中硫化氢浓度大约在30-100 µM。硫化氢浓度的异常与许多疾病有关，如高血压、动脉粥硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等，实现对体内硫化氢的检测显得尤为重要。现阶段，研究人员开发出的主要检测方法有荧光法、表面增强拉曼法、电致化学发光法、气象色谱法等。但是这些方法均需要复杂而漫长的前期准备工作或贵重繁琐的仪器操作。因此，发展一种简单快捷的硫化氢检测方法是迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、操作简单、重现性好的基于化学发光体系的硫化氢检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，包括以下步骤：

步骤S1：制备辣根过氧化物酶催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，得到第一发光强度；

步骤S2：将不同浓度的硫化氢分别和辣根过氧化物酶混合，然后分别加入到鲁米诺-过氧化氢化学发光体系内，用BPCL微弱化学发光测量仪测定各体系的化学发光信号，得到不同浓度硫化氢下体系的发光强度并结合第一发光强度，绘制标准曲线；

步骤S3：将待测样品和辣根过氧化物酶混合，然后加入到鲁米诺-过氧化氢化学发光体系内，用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，得到第二发光强度并结合标准曲线，实现待测样品中硫化氢浓度的检测。

进一步，所述步骤S1具体如下：

步骤S1-1：将辣根过氧化物酶溶液与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S1-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S1-3：将第一溶液与第二溶液混合，得到辣根过氧化物酶催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定体系的化学发光信号，得到第一发光强度。

进一步，所述步骤S2具体如下：

步骤S2-1：将不同浓度的硫化氢分别与辣根过氧化物酶溶液混合，室温反应数分钟，然后再与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S2-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S2-3：将第一溶液与第二溶液混合，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定各体系的化学发光信号，得到不同浓度硫化氢下体系的发光强度并结合第一发光强度，绘制标准曲线。

进一步，所述步骤S3具体如下：

步骤S3-1：将待测样品与辣根过氧化物酶溶液混合，室温反应数分钟，然后再与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S3-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S3-3：将第一溶液与第二溶液混合，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定体系的化学发光信号，得到第二发光强度并结合标准曲线，实现待测样品中硫化氢浓度的检测。

进一步，所述辣根过氧化物酶的浓度为4-6 µg/mL， H₂O₂溶液的浓度为3-5 mM，辣根过氧化物酶与H₂O₂的体积比为1-2:5；

所述鲁米诺溶液的浓度为5-7 mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为18-22 mM，鲁米诺溶液与Tris-HCl缓冲液的体积比为1-2:8；

所述辣根过氧化物酶与鲁米诺溶液的体积比为1-2:5。

优选地，所述辣根过氧化物酶的浓度为5 µg/mL，辣根过氧化物酶用量为20 µL，所述H₂O₂的浓度为4 mM，H₂O₂的用量为50 µL；

所述鲁米诺溶液的浓度为6 mM，鲁米诺溶液用量为100 µL，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20 mM，Tris-HCl缓冲液的用量为100 µL。

本发明采用以上技术方案，借助鲁米诺-过氧化氢体系，构建了一个用于检测硫化氢的化学发光体系，辣根过氧化物酶作为催化剂，可以增强该化学发光体系的发光强度。硫化氢是辣根过氧化酶的抑制剂，可以抑制酶的活性，降低其催化发光的能力，当硫化氢存在时，作为催化剂的辣根过氧化酶活性被抑制，进而鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光会减弱，用不同浓度的硫化氢测定各体系的发光信号，信号强度和硫化氢浓度呈线性相关，根据得到的线性关系用于待测样品中硫化氢浓度的检测。

本发明的显著优点在于：

1、所需要的原材料简单易得，成本低廉，不需要复杂的合成步骤。

2、操作简单，无须昂贵的仪器和复杂的操作，对硫化氢的检测简单而又快速。

3、本发明方法能够直接用于检测硫化氢，从0.78 µM到40 µM的浓度范围内对硫化氢呈现较好的线性响应。

附图说明

图1为本发明的硫化氢检测示意图；

图2为不同浓度硫化氢的发光光谱，加入不同浓度的硫化氢，相应的发光强度会变化，从a到h的硫化氢浓度分别为0 µM、0.78 µM、1.56 µM、3.12 µM、6.25 µM、12.5 µM、25 µM、40µM；

图3为不同浓度硫化氢相应的化学发光强度的变化，△I = I₀-I，I₀与I分别为硫化氢不存在和存在时的化学发光强度。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

溶液配制：

辣根过氧化物酶溶液：称取1 mg辣根过氧化物酶，加水溶解于1 mL离心管中，得到浓度为1 mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，使用时，根据需要逐级稀释配制成4 µg/mL、5 µg/mL、6µg/mL……的溶液备用。

H₂O₂溶液：取浓度为30%的H₂O₂溶液500 µL到离心管，加水到5mL得到浓度1 M的贮备液，使用时，根据需要逐级稀释配制成3 mM、、4 mM、5 mM……的溶液备用。

鲁米诺溶液：称取鲁米诺0.08858 g到5 mL的离心管中，用0.1 M NaOH溶液溶解，得到100 mM的贮备液备用，使用时，根据需要逐级稀释配制成5 mM、6 mM、7 mM……的溶液备用。

实施例1

辣根过氧化物酶催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系

（1）取5 µg/mL的辣根过氧化物酶20 µL和4 mM的H₂O₂溶液50 µL在离心管混合，室温反应三分钟；

（2）将6 mM的鲁米诺溶液100 µL和20 mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液800 µL加入到化学发光池。

（3）将步骤（1）所得的混合液加入到化学发光池内，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，因为辣根过氧化物酶是该体系化学发光反应的催化剂，所以得到较强的发光强度。

实施例2

标准曲线的绘制

（1）取5 µg/mL的辣根过氧化物酶20 µL分别与不同浓度的硫化氢混合，室温反应三分钟；然后再加入4mM的H₂O₂溶液50 µL，室温反应三分钟；

（2）将6 mM的鲁米诺溶液100 µL和20 mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液800 µL加入到化学发光池；

（3）将步骤（1）所得的混合液加入到化学发光池内，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定不同浓度硫化氢下各体系的化学发光信号，记录监测结果。

随着硫化氢浓度升高，相对应体系的发光信号降低，根据记录的读数拟合相关线性方程，得到的线性方程用于待测样品中硫化氢浓度的检测。

如图2所示，因为硫化氢可以抑制过氧化物酶的催化活性，从而使酶的催化能力降低，导致化学发光强度的减弱，从a到h的硫化氢浓度分别为0 µM、0.78 µM、1.56 µM、3.12 µM、6.25 µM、12.5 µM、25 µM、40 µM；从图2可以得出，各体系的发光强度随着硫化氢浓度的增加而逐渐减弱。

图3为不同浓度硫化氢相应的化学发光强度的变化，△I = I₀-I，I₀与I分别为硫化氢不存在和存在时的化学发光强度，得到的标准曲线方程为：

Y=32411 Log C + 11759，相关系数R²=0.9904；

其中，C表示硫化氢浓度，Y表示△I。

实施例3

待测样品中硫化氢浓度的检测

准备以下溶液：

辣根过氧化物酶：浓度4-6µg/mL；

H₂O₂溶液：浓度3-5mM；

鲁米诺溶液：浓度5-7mM，

Tris-HCl缓冲液：浓度18-22mM，

（1）取5 µg/mL的辣根过氧化物酶20 µL与待测样品混合，室温反应三分钟；然后再加入4mM的H₂O₂溶液50µL，室温反应三分钟；

（2）将6 mM的鲁米诺溶液100 µL和20 mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液800 µL加入到化学发光池；

（3）将步骤（1）所得的混合液加入到化学发光池内，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，收集待测样品的化学发光强度，代入实施例2的标准曲线方程，从而获得待测样品中的硫化氢浓度。

进一步，测定过程中，各溶液的浓度及用量可以选择如下：辣根过氧化物酶的浓度为4-6 µg/mL，H₂O₂溶液的浓度为3-5 mM，辣根过氧化物酶与H₂O₂的体积比为1-2:5；

鲁米诺溶液的浓度为5-7 mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为18-22 mM，鲁米诺溶液与Tris-HCl缓冲液的体积比为1-2:8；

辣根过氧化物酶与鲁米诺溶液的体积比为1-2:5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

步骤S1：制备辣根过氧化物酶催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，得到第一发光强度；

步骤S2：将不同浓度的硫化氢分别和辣根过氧化物酶混合，然后分别加入到鲁米诺-过氧化氢化学发光体系内，用BPCL微弱化学发光测量仪测定各体系的化学发光信号，得到不同浓度硫化氢下体系的发光强度并结合第一发光强度，绘制标准曲线；

步骤S3：将待测样品和辣根过氧化物酶混合，然后加入到鲁米诺-过氧化氢化学发光体系内，用BPCL微弱化学发光测量仪测定该体系的化学发光信号，得到第二发光强度并结合标准曲线，实现待测样品中硫化氢浓度的检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述步骤S1具体如下：

步骤S1-1：将辣根过氧化物酶溶液与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S1-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S1-3：将第一溶液与第二溶液混合，得到辣根过氧化物酶催化的鲁米诺-过氧化氢化学发光体系，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定体系的化学发光信号，得到第一发光强度。

3.根据权利要求1所述的一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述步骤S2具体如下：

步骤S2-1：将不同浓度的硫化氢分别与辣根过氧化物酶溶液混合，室温反应数分钟，然后再与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S2-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S2-3：将第一溶液与第二溶液混合，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定各体系的化学发光信号，得到不同浓度硫化氢下体系的发光强度并结合第一发光强度，绘制标准曲线。

4.根据权利要求1所述的一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述步骤S3具体如下：

步骤S3-1：将待测样品与辣根过氧化物酶溶液混合，室温反应数分钟，然后再与过氧化氢溶液混合，室温反应数分钟，得到第一溶液；

步骤S3-2：将鲁米诺溶液添加到pH为7.0的Tris-HCl缓冲液中，得到第二溶液；

步骤S3-3：将第一溶液与第二溶液混合，立即用BPCL微弱化学发光测量仪测定体系的化学发光信号，得到第二发光强度并结合标准曲线，实现待测样品中硫化氢浓度的检测。

5. 根据权利要求2-4之一所述的一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述辣根过氧化物酶的浓度为4-6 µg/mL， H₂O₂溶液的浓度为3-5 mM，辣根过氧化物酶与H₂O₂的体积比为1-2:5；

所述鲁米诺溶液的浓度为5-7 mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为18-22 mM，鲁米诺溶液与Tris-HCl缓冲液的体积比为1-2:8；

所述辣根过氧化物酶与鲁米诺溶液的体积比为1-2:5。

6. 根据权利要求5所述的一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法，其特征在于：所述辣根过氧化物酶的浓度为5 µg/mL，辣根过氧化物酶用量为20 µL，所述H₂O₂的浓度为4mM，H₂O₂的用量为50 µL；

所述鲁米诺溶液的浓度为6 mM，鲁米诺溶液用量为100 µL，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20 mM，Tris-HCl缓冲液的用量为100 µL。