CN108872206A - 一种化学发光法检测硫酸软骨素的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学发光法检测硫酸软骨素的分析方法，待测硫酸软骨素样品经硫酸软骨素ABC酶处理后，其酶解产物能够催化过氧化氢氧化鲁米诺，从而显现蓝色荧光，通过检测荧光强度可以灵敏的检测待测硫酸软骨素的含量。本发明检测方法检测下限为5ng/mL，具有良好检测精度，且操作简便，可应用于食品及药品中硫酸软骨素的含量检测。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的检测领域，具体涉及一种化学发光法检测硫酸软骨素的分析方法。
背景技术
硫酸软骨素(CS)是一类由葡萄糖醛酸(GlcA)和氨基半乳糖(GalNAc)的重复二糖单元组成的酸性糖胺聚糖。硫酸软骨素具有抗炎、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗病毒性肝炎等活性，广泛应用于骨科、眼科、心脑血管科、生物医学等。硫酸软骨素来源多样、结构不一、应用广泛，因此硫酸软骨素的质量控制具有重要意义。
现有技术常用的硫酸软骨素的分析方法有物理法(比旋度)、化学水解法(单糖组成分析)、生物法(二糖组成分析)、光谱法、波谱法、质谱法等。由于硫酸软骨素具有分子量和电荷不均一、硫酸化的位置和数量不固定以及没有紫外吸收等特点，对其质量控制和分析检测存在一定的困难。
硫酸软骨素ABC酶主要由Proteus vulgaris表达，对CSA，CSB(硫酸皮肤素，DS)和CSC都显示催化裂解活性，它能将硫酸软骨素酶解得到不同的二糖组成单元，通过高效离子色谱法或者高效液相色谱法对各种二糖进行定量分析。目前已建立的的分析方法对CS的分析存在检测灵敏度低，操作复杂和峰形差等难点。
化学发光是指在一些特殊的化学反应中发出可见光的现象，其发光机理是反应体系中的某些物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁至激发态，从激发态返回基态时将能量以光辐射的形式释放出来，产生发光现象。化学发光分析法则是依据某一时刻化学发光强度或化学发光总量来确定反应中相应组分含量的一种微量及痕量分析法，具有高灵敏度、线性范围宽、设备简单、操作简便、易于实现自动化和分析快速等特点。近年来，与流动注射、微流控系统、电化学、高效液相色谱和毛细管电泳等方法的联用，使得化学发光分析法已广泛应用于药物分析、临床分析、环境分析和材料分析等领域。在众多的化学发光试剂当中，鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)因其具有较高的发光量子产率和较好的水溶性，可与多种氧化剂发生化学发光反应，已成为应用最广泛的化学发光试剂。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明目的之一在于提供一种通过化学发光检测硫酸软骨素的检测方法，待测硫酸软骨素经ABC酶处理后，将酶解产物加入鲁米诺化学试剂中，通过检测鲁米诺系统化学发光强度的改变对硫酸软骨素的含量进行测定。
本领域公知，鲁米诺能够被过氧化氢氧化显现出蓝色荧光，而上述两种试剂在正常状况下的反应速度缓慢，需要催化剂的加入。发明人在研究过程中发现，酶解后的硫酸软骨素具有催化鲁米诺与过氧化氢反应的酶样活性，显著提高鲁米诺-双氧水体系的化学发光强度。本发明的技术方案应用于硫酸软骨素的检测，检测限能达到5ng/ml，具有良好技术效果。
优选的，上述检测方法，包括以下步骤：
(1)样品的制备：向待测硫酸软骨素中加入硫酸软骨素ABC酶溶液，然后加入孵育缓冲液，混匀后恒温水浴加热一段时间；水浴结束后，将酶解样品置于沸水中加热使酶灭活；
(2)向步骤(1)中的酶解样品中加入氢氧化钠调节pH至11；将待测样品、载流、鲁米诺、过氧化氢通过管路两次混合输入测试系统，通过进样阀进入检测器。
优选的，上述检测方法的步骤(1)中，硫酸软骨素ABC酶溶液的浓度为1U/mL。
优选的，上述检测方法的步骤(1)中，恒温水浴的温度为37℃，时间为1h。
优选的，上述检测方法的步骤(1)中，样品置于沸水中加热的时间为3min。
进一步优选的，步骤(1)中的具体操作为：取硫酸软骨素溶液50μL于1.5mLEP管内，加入1U/mL硫酸软骨素ABC酶溶液50μL，然后加入孵育缓冲液100μL，将其混匀后于37℃恒温水浴1h，取出后于沸水中加热3分钟使酶灭活。
优选的，上述检测方法的步骤(2)中，鲁米诺浓度为0.2mmol/L，氢氧化钠浓度为0.02mol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L。
优选的，上述检测方法的步骤(2)中，所使用的载流为超纯水。
优选的，上述检测方法的步骤(2)中，所使用的检测系统为MPI-B型多参数化学发光分析仪。
优选的，上述化学发光分析仪的使用参数为光电倍增管高压600V，泵速3mL/min。
本发明目的之二在于提供上述检测方法在硫酸软骨素含量检测方面的应用。本发明提供的硫酸软骨素检测方法，具有良好的精密度和准确性，检测范围为25～250ng/mL，可应用于药物或食品中的硫酸软骨素的检测等。
本发明的有益效果
1.本发明检测方法的线性范围为25～250ng/mL；连续6次测定低浓度(37.5ng/mL)、中间浓度(125ng/mL)、高浓度(225ng/mL)样品的发光值，测得相对标准偏差值分别为1.8％、2.0％、3.6％，精密度良好；平均回收率为104.7％；作为一种硫酸软骨素的检测方法，检测精度高，操作简便。
2.本领域公知，金属铁离子及部分多糖具有催化过氧化氢氧化鲁米诺发光的活性。本发明研究过程中发现硫酸软骨素被ABC酶解后的产物也具有类似的酶活性，该技术对于硫酸软骨素检测技术及鲁米诺化学发光检测技术的进一步开发，具有启示意义。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为本发明方法得到化学发光动力学曲线图。
其中，曲线a为鲁米诺-过氧化氢；曲线b为鲁米诺-过氧化氢-空白对照；曲线c为鲁米诺-过氧化氢-酶解后硫酸软骨素。
图2为本发明中获得的硫酸软骨素浓度与化学发光强度线性关系图。
图3为本发明实施例2单因素考察结果图。
其中，图3a表示固定氢氧化钠和过氧化氢浓度的前提下，鲁米诺试剂浓度与发光强度的关系；
图3b表示固定鲁米诺与过氧化氢浓度的前提下，氢氧化钠试剂浓度与发光强度的关系；
图3c表示鲁米诺与氢氧化钠浓度固定的前提下，过氧化氢浓度与发光强度的关系；
图3d表示鲁米诺试剂放置时间与发光强度的关系。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术中对硫酸软骨素的检测存在检测灵敏度低以及操作复杂等缺点，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种通过化学发光检测硫酸软骨素的分析方法。
本发明的一种典型实施方式中，提供一种通过化学发光检测硫酸软骨素的检测方法，待测硫酸软骨素经ABC酶处理后，将酶解产物加入鲁米诺化学试剂中，通过检测系统检测鲁米诺化学发光强度对硫酸软骨素的含量进行检测。
优选的实施方式中，包括以下步骤：
(1)样品的制备：向待测硫酸软骨素中加入硫酸软骨素ABC酶溶液，然后加入孵育缓冲液，混匀后恒温水浴加热一段时间；水浴结束后，将酶解样品置于沸水中加热使酶灭活；
(2)向步骤(1)中的酶解样品中加入氢氧化钠调节pH至11；将待测样品、载流、鲁米诺、过氧化氢通过管路两次混合输入测试系统，通过进样阀进入检测器。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(1)中，硫酸软骨素ABC酶溶液的浓度为1U/mL。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(1)中，恒温水浴的温度为37℃，时间为1h。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(1)中，样品置于沸水中加热的时间为3min。
进一步优选的实施方案中，步骤(1)中的具体操作为：取硫酸软骨素溶液50μL于1.5mL EP管内，加入1U/mL硫酸软骨素ABC酶溶液50μL，然后加入孵育缓冲液100μL，将其混匀后于37℃恒温水浴1h，取出后于沸水中加热3分钟使酶灭活。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(2)中，鲁米诺浓度为0.2mmol/L，氢氧化钠浓度为0.02mol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(2)中，所使用的载流为超纯水。
优选的实施方案中，上述检测方法的步骤(2)中，所使用的检测系统为MPI-B型多参数化学发光分析仪，光电倍增管高压600V，泵速3mL/min。
本发明的又一种典型实施方式中，提供上述检测方法在硫酸软骨素含量检测方面的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。
实施例1
样品的制备：CS酶解样品：取待测硫酸软骨素溶液50μL于1.5mL EP管内，加入1U/mL硫酸软骨素ABC酶溶液50μL，然后加入孵育缓冲液100μL，将其混匀后于37℃恒温水浴1h，取出后于沸水中加热3分钟使酶灭活。处理好的样品放于4℃冰箱内储存，测定前加入1μL5mol/L的氢氧化钠调节pH。
化学发光条件：鲁米诺浓度为0.2mmol/L，NaOH浓度为0.01mol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L时。
测定方法：分别将载流，鲁米诺，过氧化氢通过管路两次混合输入测试系统，通过进样阀进入检测器。
实施例2
1.单因素考察
1.1管路的优化
经考察鲁米诺-过氧化氢体系的静态动力学发光曲线，该体系发光值在6s时达峰值。因此通过调整管路长度和泵速，使其通过流动池被检测时的发光强度最大。最终优化的管路总长度为30cm，泵速3mL/min。
1.2鲁米诺浓度的优化
如图3a所示，固定氢氧化钠浓度为0.02mol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L，考察了鲁米诺浓度在0.1mmol/L～0.3mmol/L的发光强度，结果显示在鲁米诺浓度为0.2mmol/L时发光最稳定且浓度大于0.2mmol/L后发光强度增加趋势减缓。因此选择0.2mmol/L作为鲁米诺的最优浓度。
1.3氢氧化钠浓度的优化
如图3b所示，固定鲁米诺浓度为0.2mmol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L，考察了氢氧化钠浓度在0.005～0.1mol/L的发光强度，结果显示在氢氧化钠浓度为0.02mol/L时发光最稳定且浓度大于0.02mol/L后发光强度增加趋势减缓。因此选择0.02mol/L作为氢氧化钠的最优浓度。
1.4过氧化氢浓度的优化
如图3c所示，固定鲁米诺浓度为0.2mmol/L，氢氧化钠浓度为0.02mol/L，考察了过氧化氢浓度在0.01～0.1mol/L的发光强度，结果显示在过氧化氢浓度为0.05mol/L时发光最稳定且浓度大于0.05mol/L后发光强度增加趋势减缓。因此选择0.05mol/L作为过氧化氢的最优浓度。
1.5鲁米诺放置时间的优化
如图3d所示，鲁米诺浓度0.2mmol/L，氢氧化钠浓度0.02mol/L，过氧化氢浓度0.05mol/L。按上述浓度配制鲁米诺储备液，分别放置1,3,5,7,9天后进行测定，实验结果显示放置7天后发光强度最大且最稳定。同时考察了放置1,3,5,7,9天后鲁米诺碱性溶液的发光强度，实验结果显示放置7天后溶液中的溶解氧被耗尽，发光强度最低。猜测该发光强度随鲁米诺放置时间而变化的原因是储备液中溶解氧和过氧化氢的竞争性抑制作用。
2.方法学验证
准确度：选择低(37.5ng/mL)、中(125ng/mL)、高(225ng/mL)三个浓度，配制标准溶液，连续6次进样计算平均值，代入线性方程中，计算回收率，分别是104.0％，103.0％和107.1％。
精密度：选择低(37.5ng/mL)、中(125ng/mL)、高(225ng/mL)三个浓度，配制标准溶液，连续6次进样，计算相对标准偏差，分别是1.8％，2.0％和3.6％。
线性范围：配制一系列硫酸软骨素标准溶液，酶解后进行测定，结果显示硫酸软骨素浓度范围在25～250ng/mL的范围内线性良好，线性方程为y＝1.0417x+31.133，r＝0.9990(n＝6)。
定量限：配制一系列硫酸软骨素标准溶液，酶解后进行测定，结果显示硫酸软骨素浓度为10ng/mL时，△I值为23.3，可被定量检测，因此确定25ng/mL作为定量限。
检测限：配制一系列硫酸软骨素标准溶液，酶解后进行测定，结果显示硫酸软骨素浓度低于5ng/mL时，△I值几乎不变，因此确定5ng/mL作为检测限。
专属性：干扰离子试验。
3.检测方法验证
将本发明方法应用于复方硫酸软骨素片和复方硫酸软骨素滴眼液的测定。片剂处理方法为取十片称重，计算得平均片重，研磨成粉末状，称量适量溶解在超纯水中。滴眼液处理方法为用超纯水直接稀释。最终根据标示量计算并配制出浓度为125ng/mL的样品溶液进行测定。结果显示，片剂含量为标示量的101.0％，滴眼液含量为标示量的103.8％。同时用药典方法进行测定，结果显示，片剂含量为101.8％，滴眼液含量为标示量的102.5％，与新建方法所测结果一致。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种化学发光法检测硫酸软骨素的检测方法，待测硫酸软骨素样品经硫酸软骨素ABC酶处理后，将酶解产物与鲁米诺化学发光试剂通过多参数化学发光分析仪检测系统进行检测。
2.如权利要求1所述检测方法，包括以下步骤：
(1)样品的制备：向待测硫酸软骨素中加入硫酸软骨素ABC酶溶液，然后加入孵育缓冲液，混匀后恒温水浴加热一段时间；水浴结束后，将酶解样品置于沸水中加热使酶灭活；
(2)向步骤(1)中的酶解样品中加入氢氧化钠调节pH至11；将待测样品、载流、鲁米诺、过氧化氢通过管路两次混合输入测试系统，通过进样阀进入检测器。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫酸软骨素ABC酶溶液的浓度为1U/mL。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述恒温水浴的温度为37℃，时间为1h。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述置于沸水中加热时间为3min。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述鲁米诺浓度为0.2mmol/L，氢氧化钠浓度为0.01mol/L，过氧化氢浓度为0.05mol/L。
7.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述载流为超纯水。
8.如权利要球2所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述检测系统为MPI-B型多参数化学发光分析仪。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述多参数化学发光分析仪的使用参数为光电倍增管高压600V，泵速3mL/min。
10.如权利要求1-9所述的检测方法在硫酸软骨素含量检测方面的应用。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063657A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法 |
| CN107024471A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-08 | 福州大学 | 一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103063657A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-24 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 基于化学发光法检测蛋白酶活性及其抑制剂活性的方法 |
| CN107024471A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-08 | 福州大学 | 一种基于化学发光体系的硫化氢检测方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| HIROAKI KUBO ET AL.: "Chemiluminescence flow injection analysis of reducing agents based on the luminol reaction", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| MAKOTO TSUNODA ET AL.: "Analytical applications of peroxyoxalate chemiluminescence", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| 吴亮等: "纳米粒子参与的鲁米诺化学发光及其分析应用", 《化学进展》 * |
| 张莉: "硫酸软骨素含量测定方法的研究进展", 《天津药学》 * |
| 李艳平: "化学发光法快速测定硫酸软骨素注射液的含量", 《华西药学杂志》 * |
| 熊双丽、金征宇: "不同分子量硫酸软骨素的制备和抗氧化活性探讨", 《中成药》 * |
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|---|---|
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