CN103439322B - 一种过氧乙酸残留的快速测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过氧乙酸残留的快速测定方法，该方法为一种响应时间快、灵敏度高、稳定性好、操作简便、经济实用的能现场快速检测样品中残留过氧乙酸含量的方法，最低可检测过氧乙酸的含量为0.5mg/L。本发明方法所用试纸中的pH调节剂保证了测试结果的准确性；试纸中的酶保护剂保证了酶试纸的稳定性，保质期至少可达到12个月；所用试纸面积小，且测试过程简单，无需其它仪器和配件，可大大节约测试成本；试纸的可持式底板可防止拿取的过程中受人手的污染，十分安全可靠。
Description
技术领域
本发明属于生物技术酶法分析领域，特别涉及一种过氧乙酸残留的快速测定方法。
背景技术
过氧乙酸作为一种新型高效低毒的杀菌消毒剂主要应用于食品加工器具，医疗器械和用品等的消毒。随着环境的恶化，全球的肾病患者越来越多，据不完全统计，2008年我国的血透析患者已超过10万人，所以过氧乙酸应用在血透析方面的消毒显得尤为重要。血透析机一般1-3个月内需进行一次消毒，可采用0.2%的过氧乙酸循环20分钟，浸泡30分钟消毒；储水罐和管道一般15天需要进行一次消毒，可采用0.2%的过氧乙酸浸泡30分钟消毒，每次消毒后均需用反渗水反复冲洗并进行残留的测试，确保无过氧乙酸残留。
过氧乙酸残留检测目前尚缺乏被广泛认可的方法，因此开发出一种便捷、灵敏度高、可靠性强的过氧乙酸残留测试产品迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种过氧乙酸残留的快速测定方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种过氧乙酸残留的快速测定方法，包括以下步骤：将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧乙酸残留的浓度数据；
其中，过氧乙酸残留快速测定试纸由以下方法制备：用纯水将辣根过氧化物酶、显色剂、pH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5～30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧乙酸残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.01～0.10g/L，显色剂的浓度为1.0～2.0g/L。
优选的，所述显色剂为四甲基联苯胺盐酸盐、四甲基联苯胺硫酸盐、四甲基联苯胺丙磺酸盐或2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
优选的，所述蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物。
优选的，所述蛋白酶保护剂中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种；蛋白质为牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
优选的，所述蛋白酶保护剂中，糖为海藻糖，氨基酸为甘氨酸，蛋白质为人血清白蛋白，聚合物为聚乙二醇。
优选的，所述混合液中，糖的浓度为4～20g/L，氨基酸的浓度为2～10g/L，蛋白质的浓度为1～5g/L，聚合物的浓度为4～20g/L。
优选的，所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028～0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11～0.14mol/L。
所述标准比色卡，由以下方法制备：
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧乙酸标准溶液，将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色；
2)同步骤1）所述方法，分别获得检测浓度为1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧乙酸标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种灵敏度高、稳定性好、操作简便、经济实用的能现场快速检测样品中残留过氧乙酸含量的方法，该方法响应时间快，不超过15秒，试纸检测灵敏度高，最低可检测过氧乙酸的含量为0.5mg/L。
本发明方法所用试纸中的pH调节剂即可保持辣根过氧化物酶的活性也可缓冲试样的pH，保证了测试结果的准确性；试纸中的酶保护剂保证了酶试纸的稳定性，在室温的条件下，避光密闭保存，保质期至少可达到12个月；试纸的面积小，单次测试试剂用量只有普通实验室方法的几百分之一，且测试过程简单，无需其它仪器和配件，可大大节约测试成本；试纸的可持式底板可防止拿取的过程中受人手的污染，十分安全可靠。
附图说明
图1为标准比色卡1#的视图。
具体实施方式
一种过氧乙酸残留的快速测定方法，包括以下步骤：将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧乙酸残留的浓度数据；
其中，过氧乙酸残留快速测定试纸由以下方法制备：用纯水将辣根过氧化物酶、显色剂、pH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5～30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧乙酸残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.01～0.10g/L，优选浓度为0.03～0.05g/L，最佳浓度为0.04g/L；显色剂的浓度为1.0～2.0g/L。
所述显色剂为易溶于水的四甲基联苯胺（TMB）盐酸盐、TMB硫酸盐、TMB丙磺酸盐以及2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）中的一种，其中TMB盐酸盐显蓝色，TMB硫酸盐、TMB丙磺酸盐以及ABTS均显蓝绿色。优选的显色剂为TMB盐酸盐，其在混合液中最佳浓度为1.5g/L。
所述的蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物，其中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种，优选为海藻糖；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种，优选为甘氨酸；蛋白质为牛血清蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）中的至少一种，优选为HSA；聚合物为聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中的至少一种，优选为PEG。所述混合液中，蛋白酶保护剂中糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的浓度分别为4～20g/L、2～10g/L、1～5g/L、4～20g/L；优选浓度分别为：5～15g/L、4～6g/L、2～4g/L、5～15g/L；最佳浓度分别为：10g/L、5g/L、3g/L、10g/L。
优选的，所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028～0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11～0.14mol/L。
所述滤纸为层析滤纸、定性滤纸和定量滤纸中的一种；优选为层析滤纸。
优选的，将滤纸置于低于30℃条件下真空干燥，烘干成形，将此滤纸裁切成25～100mm2的小块，用胶粘在长条状的底板一端，即制得用于测定过氧乙酸残留的试纸；所述底板的宽度为5～10mm，长度为50mm～120mm；所述底板由不吸水的塑料板制成。
所述标准比色卡，由以下方法制备：
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧乙酸标准溶液，将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色；
2)同步骤1）所述方法，分别获得检测浓度为1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧乙酸标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
本发明方法所用试纸对过氧化氢同样也有响应，因过氧乙酸消毒液中一般同时含有过氧化氢，所以该试纸只能用于过氧乙酸的半定量测试。但经过氧乙酸消毒的医疗器械和管道要求不得有过氧乙酸残留检出，所以一般只需定性测试即可，本发明方法能满足其测试需求。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
用纯水配制含0.04g/L辣根过氧化物酶、1.5g/LTMB盐酸盐、0.037mol/L柠檬酸、0.126mol/L磷酸氢二钠、10g/L海藻糖、5g/L甘氨酸、3g/LBSA、10g/LPEG4000的混合显色液。将层析滤纸完全浸泡至上述混合液中约10分钟，取出滤纸，在低于30℃温度下真空干燥，将此滤纸切成5×6mm的小块，用胶粘在5×80mm条状的底板一端，即制成过氧乙酸残留快速测定试纸1#。
实施例2
用纯水配制含0.01g/L辣根过氧化物酶、1.0g/LTMB硫酸盐、0.028mol/L柠檬酸、0.11mol/L磷酸氢二钠、10g/L海藻糖、5g/L精氨酸、5g/LBSA、10g/LPVP的混合显色液。将层析滤纸完全浸泡至上述混合液中5分钟，取出滤纸，在低于30℃温度下真空干燥，将此滤纸切成5×5mm的小块，用胶粘在5×50mm条状的底板一端，即制成过氧乙酸残留快速测定试纸2#。
实施例3
用纯水配制含0.025g/L辣根过氧化物酶、1.25g/LTMB丙磺酸盐、0.044mol/L柠檬酸、0.14mol/L磷酸氢二钠、2g/L蔗糖、2g/L海藻糖、2g/L甘氨酸、1g/LHSA、4g/LPEG6000的混合显色液。将定性完全浸泡至上述混合液中约20分钟，取出滤纸，在低于30℃温度下真空干燥，将此滤纸切成5×5mm的小块，用胶粘在5×50mm条状的塑料硬板一端，即制成过氧乙酸残留快速测定试纸3#。
实施例4
用纯水配制含0.1g/L辣根过氧化物酶、2.0g/LABTS、0.044mol/L柠檬酸、0.14mol/L磷酸氢二钠、20g/L蔗糖、6g/L谷氨酸、2g/L甘氨酸、2g/L精氨酸、4g/LHSA、20g/LPEG8000的混合显色液。将定量滤纸完全浸泡至上述混合液中30分钟，取出滤纸，在低于30℃温度下真空干燥，将此滤纸切成10×10mm的小块，用胶粘在10×120mm条状的塑料硬板一端，即制成过氧乙酸残留快速测定试纸4#。
实施例5
制备与过氧乙酸残留快速测定试纸1#配套使用的标准比色卡1#：
1)用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧乙酸标准溶液，将实施例1制备的试纸浸入溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，15秒后根据试纸所呈现的颜色在潘通色卡上找出色调一致的标准色；
2)同步骤1）所述方法，分别获得检测浓度为1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧乙酸标准溶液时试纸所呈现的标准色；
3)根据得到的各潘通标准色所列色值采用电脑调色和印制，得到标准比色卡1#（如图1所示）。
实施例6
同实施例5所述的方法，分别制备得到与检测试纸2#～4#配套使用的标准比色卡2#～4#。
实施例7
将过氧乙酸残留快速测定试纸1#～3#置于密实袋中，放置37℃烘箱中，每隔30天观察试纸外观及进行显色效果测试。测试方法：配制0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L系列过氧乙酸标准溶液，将试纸1#插入标准溶液中2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后观察显色效果，并分别与配套的标准比色卡对照，读出过氧乙酸浓度的数据。随着过氧乙酸含量的增加，试纸所显的颜色逐渐加深。检测结果如表1～3所示：
表1过氧乙酸残留快速测定试纸1#的稳定性
| 测试指标 | 放置30d后 | 放置60d后 | 放置90d后 |
| 外观 | 白色 | 白色 | 白色 |
| 色阶 | 明显 | 明显 | 明显 |
| 显色速度 | 约2秒显色完全 | 约6秒显色完全 | 约10秒显色完全 |
| 检测下限 | 0.5mg/L | 0.5mg/L | 0.5mg/L |
表2过氧乙酸残留快速测定试纸2#的稳定性
| 测试指标 | 放置30d后 | 放置60d后 | 放置90d后 |
| 色阶 | 明显 | 明显 | 明显 |
| 外观 | 白色 | 白色 | 白色 |
| 显色速度 | 约3秒显色完全 | 约7秒显色完全 | 约12秒显色完全 |
| 检测下限 | 0.5mg/L | 0.5mg/L | 0.5mg/L |
表3过氧乙酸残留快速测定试纸3#的稳定性
| 测试指标 | 放置30d后 | 放置60d后 | 放置90d后 |
| 色阶 | 明显 | 明显 | 明显 |
| 外观 | 白色 | 白色 | 白色 |
| 显色速度 | 约5秒显色完全 | 约10秒显色完全 | 约15秒显色完全 |
| 检测下限 | 0.5mg/L | 0.5mg/L | 0.5mg/L |
用本发明试纸检测过氧乙酸的响应时间少于15秒，显色完全后颜色可稳定30分钟，且最低可检测过氧乙酸的含量为0.5mg/L。
由表1～3可知，实施例1～3中的过氧乙酸残留快速测定试纸在37℃烘箱中放置90天后，除了显色速度稍微变慢外，其它均没有影响，过氧乙酸残留快速测定试纸4#的稳定性测试结果与上述结果相似，说明本发明方法所用试纸的保质期至少可达到1年。
实施例8
采用实施例1制备的试纸1#进行过氧乙酸残留的测试并进行加标回收实验。当样品显色液的色调与标准色阶一致时，直接取色阶指示浓度为测得值，若颜色深浅处于两色阶之间，则取两色阶指示浓度的中间浓度为测得值。
测试方法如下：器械管道采用渗透水冲洗时，采集部分冲洗液，取冲洗液进行测试。结果如表4所示。
表4实际样品测试与加标回收率实验
| 样品号 | 测得值，mg/L | 加标量，mg/L | 测得总值， mg/L | 回收率，% |
| 样品1 | 2.0 | 2.0 | 4.0 | 100.0 |
| 样品2 | 0.0 | 2.0 | 2.0 | 100.0 |
| 样品3 | 4.0 | 3.0 | 7.0 | 100.0 |
| 样品4 | 0.5 | 3.0 | 4.0 | 116.7 |
注：样品1为某医院采用过氧乙酸消毒的管道冲洗3分钟后的冲洗液；样品2为某医院采用过氧乙酸消毒后管道冲洗5分钟后的冲洗液；样品1为某医院采用过氧乙酸消毒的血透机冲洗3分钟后的冲洗液；样品2为某医院采用过氧乙酸消毒的血透机冲洗5分钟后的冲洗液。
本发明方法用于采用过氧乙酸消毒的器械、设备、管道等残留过氧乙酸浓度的测定，通过不同冲洗时间段过氧乙酸残留量的测试，可方便的控制冲洗时间和消毒剂残留，该检测方法无需其它的仪器和配件，操作简便、检测灵敏度高，结果可靠，具有较高的实用价值。
Claims (6)
1.一种过氧乙酸残留的快速测定方法，包括以下步骤：将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入待测样品制成的试液中，2秒后取出，甩去试纸上多余的溶液，显色完全后，将试纸所显的颜色与标准比色卡相比较，读出过氧乙酸残留的浓度数据；
其中，过氧乙酸残留快速测定试纸由以下方法制备：用纯水将辣根过氧化物酶、显色剂、pH调节剂、蛋白酶保护剂配制成混合液，将滤纸在混合液中浸泡5～30min后取出，烘干成形，裁切至设定尺寸，粘贴在底板上，制得用于测定过氧乙酸残留的试纸；所述混合液中，辣根过氧化物酶的浓度为0.01～0.10g/L，显色剂的浓度为1.0～2.0g/L；
所述蛋白酶保护剂为糖、氨基酸、蛋白质和聚合物的混合物；
所述蛋白酶保护剂中，糖为蔗糖、海藻糖中的至少一种；氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、精氨酸中的至少一种；蛋白质为牛血清蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述显色剂为四甲基联苯胺盐酸盐、四甲基联苯胺硫酸盐、四甲基联苯胺丙磺酸盐或2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白酶保护剂中，糖为海藻糖，氨基酸为甘氨酸，蛋白质为人血清白蛋白，聚合物为聚乙二醇。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述混合液中，糖的浓度为4～20g/L，氨基酸的浓度为2～10g/L，蛋白质的浓度为1～5g/L，聚合物的浓度为4～20g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述pH调节剂为柠檬酸与磷酸氢二钠的混合物，混合液中，柠檬酸的浓度为0.028～0.044mol/L，磷酸氢二钠的浓度为0.11～0.14mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准比色卡，由以下方法制备：
用纯水配制浓度为0.5mg/L的过氧乙酸标准溶液，将过氧乙酸残留快速测定试纸浸入标准溶液中，2秒后取出，甩去多余的溶液，待试纸所呈现的颜色稳定后，在潘通色卡上找出对应的标准色；
同步骤1）所述方法，分别获得检测浓度为1mg/L、2mg/L、4mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L的过氧乙酸标准溶液时试纸所呈现的标准色；
根据各标准色的色值制备得到标准比色卡。
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