CN105974107A - 单组份tmb显色液及其配制方法 - Google Patents

单组份tmb显色液及其配制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种单组份TMB显色液及其配制方法。该单组份TMB显色液包括以下组分：TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、糖类化合物或其衍生物、缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0‑7.0；所述缓冲液选自柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸‑EDTA缓冲液、柠檬酸‑乙酸钠缓冲液或柠檬酸‑磷酸氢二钠缓缓冲液；所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。所述单组份TMB显色液能够用于Western、IHC或原位杂交等实验，灵敏度高、稳定性好、保存时间长。

Description

单组份TMB显色液及其配制方法
技术领域
本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，特别是涉及一种单组分TMB显色液及其制备方法。
背景技术
在分子生物学与病理领域中，进行Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等试验时，传统的方法一般使用DAB(3,3’-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物，在显色反应中产生棕色沉淀。DAB具有一定的致癌性，而且DAB作为HRP的底物，配成溶液后稳定性差，灵敏度也比较低。TMB(3,3",5,5"-四甲基联苯胺)是一种无致癌特性的试剂，也是HRP的显色底物之一，具有高灵敏度的特性，因此被广泛用于ELISA反应(酶联免疫反应)。
现有市售的酶联免疫试剂盒所采用的TMB显色液大多为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，因此存在以下缺点：使用不够方便、提高了包装材料的成本、浪费资源，且使用中的混合过程容易造成批间质量不均一。市售的酶联免疫试剂盒也有采用单组份的TMB显色液，但是现有的单组份TMB显色液存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等问题。而且，TMB与HRP作用后只产生蓝色溶液而不能产生沉淀，因此，传统的TMB显色液只能用于ELISA反应，而不能用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验。
发明内容
基于此，本发明提供了一种单组份TMB显色液，该显色液可用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验。
具体技术方案如下：
一种单组份TMB显色液，包括以下组分：0.1-2mg/mL TMB、体积分数为0.1-3％的二甲基亚砜、体积分数为1-10％的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化剂、0.5-10mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1-2.5mol/L缓冲液；
所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0；所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述糖类化合物或其衍生物选自葡聚糖或其衍生物。
在其中一些实施例中，所述葡聚糖或其衍生物选自DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。
在其中一些实施例中，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化氢、过氧化脲和过硼酸钠中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述氧化剂选自过氧化脲。
在其中一些实施例中，所述单组份TMB显色液包括以下组分：0.3-0.5mg/mLTMB、体积分数为0.4-0.6％的二甲基亚砜、体积分数为8-10％的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化剂、2.5-3.5mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.2-0.3mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-5.0。
本发明还提供了上述单组份TMB显色液的配制方法。
具体技术方案如下：
上述单组份TMB显色液的配制方法，包括以下步骤：
配制缓冲液，用酸调节pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A；
将TMB溶解于二甲基亚砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B；
在所述混合溶液B中加入糖类化合物或其衍生物以及氧化剂，充分混匀，即得所述单组份TMB显色液。
在其中一些实施例中，用于调节pH值的酸为浓盐酸。
本发明的单组份TMB显色液具有以下有优点和有益效果：
本发明的单组份TMB显色液，通过在显色体系中加入糖类化合物或其衍生物作为着附剂，使TMB与HRP显色反应的反应产物能够固定于反应膜或者细胞原位上，形成与DAB一致的显色斑点，因此能够用于Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等实验，解决了传统的TMB显色液不能用于Western、IHC或原位杂交实验的问题。
本发明的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，可以实现以混合的单一液体存在，无需分成A液、B液，该单组份TMB显色液可直接使用，操作更为便利，也可降低包装成本，减少了A液、B液在混匀过程中的实验误差和批间质量不均一的问题。
本发明的单组份TMB显色液，通过糖类化合物或其衍生物与其它各组分(TMB、二甲基亚砜、甘油、氧化剂、缓冲液)以特定浓度互配，使其灵敏度高、稳定性好、保存时间长、灵敏度与稳定性均比DAB显色液强，同时解决了现有的单组份TMB显色液的稳定性问题。
附图说明
图1为单组分TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较结果示意图；
图2为经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液的灵敏度比较结果示意图；
图3为本发明的单组份TMB显色液与传统单组份TMB显色液的显色效果比较示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的单组份TMB显色液和配制方法作进一步详细的说明。
以下实施例中所用试剂如无特殊说明均为市售普通试剂。
实施例1
本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到：
称取25g柠檬酸(0.13mol)与29g二水柠檬酸三钠(0.099mol)，溶于800ml去离子水中，用浓盐酸调pH至4.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。
称取350mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。
向上述混合液B中加入3g DEAE葡聚糖盐酸盐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4℃保存。
实施例2
本实施例的单组份TMB显色液由以下方法配制得到：
称取120g柠檬酸(0.62mol)与150g乙酸钠(1.83mol)，溶于800ml去离子水中，用浓盐酸调pH至6.0，加入100ml甘油后再定容到1000ml，即得混合溶液A。
称取300mg TMB粉末，溶解于5ml二甲基亚砜中，完全溶解后加入到上述混合溶液A中，得到新的混合液B。
向上述混合液B中加入3.5g右旋糖酐与350mg过氧化脲，充分混匀，即得所述单组分TMB显色液，避光4℃保存。
实施例3TMB显色液与DAB显色液的灵敏度比较
用abcam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取1ul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于上述实施例1所配置的单组分TMB显色液与DAB显色液(广州捷倍斯生物科技有限公司的产品，货号G3433)中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。显色结果如图1所示，A为TMB显色液，B为DAB显色液。
从图1可以看出，本发明的单组分TMB显色液对1:4500稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗能够检出，而DAB显色液对1:2000稀释度的HRP标记羊抗鼠二抗也无法检测，表明本发明的单组分TMB显色液具有比DAB显色液更高的灵敏度。
实施例4TMB显色液的稳定性
用abcam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取1ul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于经过不同保存条件保存后的单组分TMB显色液中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。其中单组分TMB显色液按照上述实施例1的方法配制。结果如图2所示，C为新鲜配制的单组分TMB显色液；D为室温避光保存1年的单组分TMB显色液。
从图2中可以看出，室温避光保存一年的单组分TMB显色液(C)与新鲜配制的单组分TMB显色液(D)对HRP标记羊抗鼠二抗的检测灵敏度无明显差异，表明本发明的单组分TMB显色液稳定性优越。
实例5本发明的单组份TMB显色液与传统单组份TMB显色液的比较
用abcam公司的HRP标记羊抗鼠二抗(货号ab6789)做梯度稀释后，取1ul直接在复印纸上划线，待完全吸收干燥后，分别浸泡于上述实施例1所配置的单分TMB显色液与传统单组份TMB显色液(广州捷倍斯生物科技有限公司的产品，货号G4308)中，浸泡30分钟后用自来水冲洗终止显色。显色结果如图3所示，G为实施例1所配置的TMB显色液，H为传统单组份TMB显色液。
从图3中可以看出，传统的TMB显色液，用水冲洗终止显色时，会把显色产物一并冲洗掉，而本发明的单组份TMB显色液能够将显色产物固定在膜上。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分：0.1-2mg/mL TMB、体积分数为0.1-3％的二甲基亚砜、体积分数为1-10％的甘油、0.01-0.5mg/ml氧化剂、0.5-10mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.1-2.5mol/L缓冲液；
所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-7.0；所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-EDTA缓冲液、柠檬酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
所述糖类化合物或其衍生物选自糖苷或其衍生物、葡聚糖或其衍生物和聚蔗糖或其衍生物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述糖类化合物或其衍生物选自葡聚糖或其衍生物。
3.根据权利要求2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述葡聚糖或其衍生物选自DEAE葡聚糖盐酸盐或右旋糖酐。
4.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述缓冲液选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
5.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化氢、过氧化脲和过硼酸钠中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述氧化剂选自过氧化脲。
7.根据权利要求1-6任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，包括以下组分：0.3-0.5mg/mL TMB、体积分数为0.4-0.6％的二甲基亚砜、体积分数为8-10％的甘油、0.3-0.4mg/mL氧化剂、2.5-3.5mg/mL糖类化合物或其衍生物、0.2-0.3mol/L缓冲液；所述单组份TMB显色液的pH值为3.0-5.0。
8.权利要求1-7任一项所述的单组份TMB显色液的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制缓冲液，用酸调节pH值，再加入甘油，用水定容，得混合溶液A；
将TMB溶解于二甲基亚砜中，再加入到所述混合溶液A中，得混合溶液B；
在所述混合溶液B中加入糖类化合物或其衍生物以及氧化剂，充分混匀，即得所述单组份TMB显色液。
9.根据权利要求8所述的单组份TMB显色液的配制方法，其特征在于，用于调节pH值的酸为浓盐酸。
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