CN110376376A - 一种tmb二合一底物 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种TMB二合一底物包含一水合柠檬酸3‑6g/L，二水合柠檬酸钠1‑3g/L，0.5‑1g/L的TMB‑HCl，0.1‑0.5g/L EDTA‑2Na，5‑10g/L β环糊精，0.1‑0.5g/L过氧化脲，0.2‑0.5ml/L P300，0.005‑0.01g/L荧光桃红B和还原剂，其余为水。本发明提出的底物，通过加入β环糊精来稳定TMB和过氧化氢混合后的反应；同时加入抗氧化剂，不仅抑制本底反应的发生，还可以保持正常HRP的催化反应效果，既消除本底信号同时反应线性范围宽度不受影响。

Description

一种TMB二合一底物
技术领域
本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种TMB二合一底物。
背景技术
酶联免疫分析是一种基于抗原抗体特异性亲和反应原理的检测技术，抗体和相应的抗原相互反应，并使用标记到免疫反应物之一的酶检测该反应。目前主流技术中使用的标记物包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶等。为了检测酶的活性，使用显色底物和显色原，显色原在酶催化过程中产生颜色。这项技术在诊断和基础研究工作中都非常有用，用三种相对便宜的试剂和设备就可以获得很高的灵敏度和特异性。酶联免疫吸附试验有很多种反应模型，在聚苯乙烯或聚丙烯的反应孔中进行。其中辣根过氧化物酶经常被用于生物材料的标记，为了检测酶活性，常用的显色原有邻苯二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB-HCl)。
TMB是一种无色无害基质，在显色底物(主要成分过氧化氢或过氧化脲)和HRP共同作用下形成一种强烈的蓝色氧化产物，产物量与酶量呈现正相关，可用于定量被标记物。选TMB作为底物敏感度且高毒性比小，因此广泛应用于酶联免疫分析技术。但是TMB底物反应只能以显色底物(主要成分过氧化氢或过氧化脲)和显色原(主要成分TMB)两种组分的形式出现，使用时再进行混合加样，造成操作步骤繁琐。如果提前混合会出现自身显色反应造成本底升高，暴露在日光或灯光的情况下会加剧反应，不能准确识别辣根过氧化物酶的含量。目前国内无论科研使用还是商品化底物都是这样的双组份产品现状。
国际上现有技术中有针对二合一底物的研究，并且有厂家实现了有色二合一底物的生产使用，但是该底物均存在本底偏高且不稳定的情况。
本发明意在解决这一问题，实现有色TMB底物的合二为一的同时，并保持其低本底的特性和更长时间的稳定性，延长产品有效期是本领域技术人员亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明正是基于上述技术问题至少之一，提出了一种TMB二合一底物，通过加入β环糊精来稳定TMB和过氧化氢混合后的反应；同时加入抗氧化剂，不仅抑制本底反应的发生，还可以保持正常HRP的催化反应效果，既消除本底信号同时反应线性范围宽度不受影响。
有鉴于此，本发明提出了一种TMB二合一底物，包含如下组分：一水合柠檬酸3-6g/L，二水合柠檬酸钠1-3g/L，0.5-1g/L的TMB-HCl，0.1-0.5g/L EDTA-2Na，5-10g/Lβ环糊精，0.1-0.5g/L过氧化脲，0.2-0.5ml/L P300，0.005-0.01g/L荧光桃红B和还原剂，其余为水。
进一步的，包含如下组分：一水合柠檬酸5g/L，二水合柠檬酸钠2.8g/L，0.6g/L的TMB-HCl，0.28g/L EDTA-2Na，9g/Lβ环糊精，0.2g/L过氧化脲，0.5ml/L P300，0.009g/L荧光桃红B和还原剂，其余为水。
进一步的，还原剂包括β巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。
进一步的，β巯基乙醇浓度为5-10ul/L。
优选的，β巯基乙醇浓度为8ul/L。
进一步的，二硫苏糖醇浓度为0.02-0.05g/L。
优选的，二硫苏糖醇浓度为0.028g/L。
进一步的，三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐浓度为0.02-0.05g/L。
优选的，三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐浓度为0.028g/L。
通过以上技术方案，本发明提出了一种TMB二合一底物，具有如下技术效果：
(1)本发明提供的TMB二合一底物可以降低0.01-0.02的空白本底，降低至肉眼不可见本底反应，解决了双组分底物加样的操作复杂性和漏加风险。
(2)本发明提供的TMB二合一底物利于该平台下各种试剂盒的灵敏度指标提升。
(3)本发明提供的TMB二合一底物有效期限延长，保存条件放宽，利于产品使用的实际操作便捷，节省生产企业冷库存放空间。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明实施例中，酶联免疫试剂包为促甲状腺激素定量检测试剂盒(酶联免疫法)(达诺生物制造)，辣根过氧化物酶(上海雪满)，空白酶标板(厦门云鹏)。
实施例1
质检物评估
本实施例中，终止液为2M硫酸；
双组分底物组为A组，其组分为表格1和表格2；其中表格1为A-A组分；其中表格2为A-B组分，其中双组分底物组为A-A和A-B各50ul。
表1双组分底物组A-A
品名 每升标准量
纯化水 1000ml
一水合柠檬酸 5.00g
二水合柠檬酸钠 2.80g
过氧化脲 0.50g
Proclin-300 0.50ml
表2双组分底物组A-B
品名 每升标准量
纯化水 1000ml
一水合柠檬酸 5.00g
二水合柠檬酸钠 2.80g
TMB-HCl 0.60g
EDTA-2Na 0.28g
Proclin-300 0.50ml
不添加还原剂的二合一底物为B组，在二合一底物配方中，TMB-HCl和过氧化脲作为反应基础试剂，保证其在PH小于4.0以下就可以进行酶促显色反应，所以基础缓冲液选择PH在2.0-3.5的柠檬酸盐缓冲系统。而保证在辣根过氧化物酶加入之前抑制反应性的试剂为β环糊精，但是单纯加入β环糊精还会有约0.02-0.04的本底信号无法消除，无法满足灵敏度要求较高的项目使用。本方法引入新的还原剂，可以更全效的抑制二合一底物在加入辣根过氧化物酶之前的反应，并且控制本底。加入量过低无显著效果，加入量过高又会影响辣根酶催化的主流反应。其中B组组成见表格3。
表3B组成分表
二合一底物为B组中各物质浓度确认过程如下：其中加入β巯基乙醇(βME)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ul/L为I组，分别编号I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9、I10；加入二硫苏糖醇(DTT)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10g/L为标号为II组，分别编号II1、II2、II3、II4、II5、II6、II7、II8、II9、II10；加入三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10g/L为III组，分别编号III1、III2、III3、III4、III5、III6、III7、III8、III9、III10。
本实施例中，终止液为2M硫酸；
质检物：用PB(PH6.5)配制辣根过氧化物酶标准溶液0.001ug/ml；其中质检物01-11配比见表格4。
表4质检物配比
编号 稀释液 标准溶液
01 10 0
02 9 1
03 8 2
04 7 3
05 6 4
06 5 5
07 4 6
08 3 7
09 2 8
10 1 9
11 0 10
在空白微孔板中分别加入上述I组、II组、III组底物和未添加的对照底物，在每孔中依次加入10ul辣根过氧化物酶标准溶液质检物，室温(18-23℃)条件下避光显色20分钟。相同布局同时考察室温条件非避光20分钟后本底。布局如表5。
表5空白微孔板中底物布局
未添加
I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10
II1 II2 II3 II4 II5 II6 II7 II8 II9 II10
III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8 III9 III10
各考察孔与未添加OD值比值如表6。
表6空白微孔板中OD值比值
1.080 1.115 1.081 1.081 1.054 0.959 0.937 0.918 0.882 0.878
0.974 0.968 0.917 0.885 0.861 0.832 0.766 0.743 0.700 0.702
1.045 1.070 0.928 0.902 0.868 0.837 0.775 0.787 0.739 0.707
各考察孔本底如下表7。
表7空白微孔板中本底OD值
0.0340
0.0310 0.0280 0.0220 0.0200 0.0180 0.0190 0.0160 0.0140 0.0110 0.0080
0.0330 0.0260 0.0160 0.0130 0.0134 0.0104 0.0124 0.0092 0.0082 0.0076
0.0310 0.0291 0.0274 0.0253 0.0195 0.0220 0.0150 0.0177 0.0106 0.0073
综合上述本底结果(≤0.02)和添加还原剂后OD值高度(≥0.85)的要求，各还原剂推荐使用浓度为β巯基乙醇浓度为5-10ul/L、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐浓度为0.02-0.05g/L、二硫苏糖醇浓度为0.02-0.05g/L。
其中B组+β巯基乙醇(βME)8ul/L为C1组；B+二硫苏糖醇(DTT)0.028g/L为标号为C2组；B+三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)0.028g/L为C3组。
在空白微孔板中分别加入11孔上述A(A-A、A-B各50ul)、B-100ul、C1-100ul、C2-100ul、C3-100ul底物，在依次加入10ul质检物01-11号各一孔，室温(18-23℃)条件下避光显色20分钟，布局如表8。
表8空白微孔板中组分布局
A-01 A-02 A-03 A-04 A-05 A-06 A-07 A-08 A-09 A-10 A-11
B-01 B-02 B-03 B-04 B-05 B-06 B-07 B-08 B-09 B-10 B-11
C1-01 C1-02 C1-03 C1-04 C1-05 C1-06 C1-07 C1-08 C1-09 C1-10 C1-11
C2-01 C2-02 C2-03 C2-04 C2-05 C2-06 C2-07 C2-08 C2-09 C2-10 C2-11
C3-01 C3-02 C3-03 C3-04 C3-05 C3-06 C3-07 C3-08 C3-09 C3-10 C3-11
显色20分钟后，各加入50ul终止液，测量波长450nm，参考波长630nm，检测OD值如表9。
表9各组OD值检测结果
0.021 0.113 0.247 0.594 0.983 1.373 1.667 2.030 2.441 2.853 3.337
0.032 0.122 0.263 0.580 1.086 1.416 1.653 2.065 2.407 2.825 3.415
0.010 0.113 0.245 0.575 0.945 1.393 1.585 1.987 2.390 2.811 3.393
0.008 0.119 0.252 0.583 1.005 1.406 1.634 2.022 2.415 2.834 3.417
0.011 0.125 0.254 0.596 1.044 1.403 1.613 2.057 2.404 2.823 3.404
由表9可知，二合一底物在添加还原剂后，与双组分底物和现有二合一配方底物比较，可以降低0.01-0.02的空白本底，降低至肉眼不可见本底反应。
实施例2
TSH酶联免疫试剂测试
使用TSH检测试剂包，按照使用说明书的操作，重复操作5组检测实验。
依次加入校准品(6个S1-S6)、质控品(3个Q1-Q3)各50ul，每孔再加入酶结合物50ul，37℃反应60分钟后洗板，5组平行实验分别加入上述A(A-A、A-B各50ul)、B-100ul、C1-100ul、C2-100ul、C3-100ul底物，室温(18-23℃)条件下避光显色20分钟，布局如表10。
表10空白微孔板中组分布局
A-S1 A-S2 A-S3 A-S4 A-S A-S6 A-Q1 A-Q2 A-Q3
B-S1 B-S2 B-S3 B-S4 B-S5 B-S6 B-Q1 B-Q2 B-Q3
C1-S1 C1-S C1-S3 C1-S4 C1-S5 C1-S6 C1-Q1 C1-Q2 C1-Q3
C2-S1 C2-S2 C2-S3 C2-S4 C2-S5 C2-S6 C2-Q1 C2-Q2 C2-Q3
C3-S1 C3-S2 C3-S3 C3-S4 C3-S5 C3-S6 C3-Q1 C3-Q2 C3-Q3
显色20分钟后，各加入50ul终止液，测量波长450nm，参考波长630nm，检测OD值如下表11，其中S1＝0uIU/ml,S2＝0.5uIU/ml,S3＝2uIU/ml,S4＝5uIU/ml,S5＝10uIU/ml,S6＝25uIU/ml。
表11各组OD值检测结果
0.018 0.158 0.628 1.338 2.132 3.241 0.143 1.506 3.586
0.031 0.163 0.618 1.467 2.327 3.374 0.151 1.589 3.671
0.011 0.155 0.589 1.433 2.224 3.268 0.139 1.561 3.465
0.008 0.162 0.607 1.502 2.381 3.414 0.148 1.633 3.653
0.009 0.169 0.611 1.488 2.369 3.342 0.155 1.586 3.588
由表8-11可知，二合一底物在添加还原剂后，与双组分底物和现有二合一配方底物比较，可以降低0.01-0.02的空白本底，降低至肉眼不可见本底反应。
实施例3
稳定性观察
将上述配制好的底物分装至棕色不透光HDPE材质瓶中，分别放置在2-8℃与室温(18-25℃)条件下，在放置3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月后，与刚配制的底物进行同步比较。使用质检物01-11号，对A、B、C1、C2、C3同时进行该实验比较。实验布局如表格12。
表12组分布局表格
12个月检测结果
A现配本底OD值为0.025，低温本底OD值为0.021，室温本底OD值为0.022；其中A组稳定性观察统计结果如表13。
表13 A组稳定性观察
B现配本底OD值为0.034，低温本底OD值为0.036，室温本底OD值为0.032；其中B组稳定性观察统计结果如表14。
表14 B组稳定性观察
C1现配本底OD值为0.008，低温本底OD值为0.009，室温本底OD值为0.010，其中C1组稳定性观察统计结果如表15。
表15 C1组稳定性观察
C2现配本底OD值为0.009，低温本底OD值为0.009，室温本底OD值为0.008；其中C2组稳定性观察统计结果如表16。
表16 C2组稳定性观察
C3现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.011，室温本底OD值为0.009；其中C3组稳定性观察统计结果如表17。
表17 C3组稳定性观察
24个月检测结果
A现配本底OD值为0.022，低温本底OD值为0.025，室温本底OD值为0.026；其中A组稳定性观察统计结果如表18。
表18 A组稳定性观察
B现配本底OD值为0.032，低温本底OD值为0.036，室温本底OD值为0.037；其中B组稳定性观察统计结果如表19。
表19 B组稳定性观察
C1现配本底OD值为0.009，低温本底OD值为0.010，室温本底OD值为0.008；其中C1组稳定性观察统计结果如表20。
表20 C1组稳定性观察
C2现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.011，室温本底OD值为0.012，其中C2组稳定性观察统计结果如表21。
表21 C2组稳定性观察
C3现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.011，室温本底OD值为0.009；其中C3组稳定性观察统计结果如表22。
表22 C3组稳定性观察
由表格13-22可知，双组分底物与现有二合一底物配方可以保持低温条件下24个月内的稳定使用，室温存放12个月内可以稳定使用，与新鲜配制的偏差在0.85-1.15范围内。现有二合一底物配方随着时间的推移，本底显著上升。
36个月检测结果
A现配本底OD值为0.020，低温本底OD值为0.022，室温本底OD值为0.027；其中A组稳定性观察统计结果如表23。
表23 A组稳定性观察
B现配本底OD值为0.032，低温本底OD值为0.045，室温本底OD值为0.051；其中B组稳定性观察统计结果如表24。
表24 B组稳定性观察
C1现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.012，室温本底OD值为0.010；其中C1组稳定性观察统计结果如表25。
表25 C1组稳定性观察
C2现配本底OD值为0.009，低温本底OD值为0.010，室温本底OD值为0.010；其中C2组稳定性观察统计结果如表26。
表26 C2组稳定性观察
C3现配本底OD值为0.011，低温本底OD值为0.010，室温本底OD值为0.012；其中C3组稳定性观察统计结果如表27。
表27 C3组稳定性观察
48个月检测结果
A现配本底OD值为0.020，低温本底OD值为0.022，室温本底OD值为0.027；其中A组稳定性观察统计结果如表28。
表28 A组稳定性观察
B现配本底OD值为0.032，低温本底OD值为0.048，室温本底OD值为0.058；其中B组稳定性观察统计结果如表29。
表29 B组稳定性观察
C1现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.012，室温本底OD值为0.010；其中C1组稳定性观察统计结果如表30。
表30 C1组稳定性观察
C2现配本底OD值为0.009，低温本底OD值为0.010，室温本底OD值为0.010；其中C2组稳定性观察统计结果如表31。
表31 C2组稳定性观察
C3现配本底OD值为0.010，低温本底OD值为0.010，室温本底OD值为0.012；其中C3组稳定性观察统计结果如表32。
表32 C3组稳定性观察
由表格28-32可知，二合一底物在添加还原剂后，可以保持低温条件下至少48个月的稳定使用，室温避光条件下48个月的稳定使用，与新鲜配制的偏差在0.85-1.15范围内。
本发明实施例4-25提供的仿古蓝釉钧瓷坯料的配方见表33。
表33
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种TMB二合一底物，其特征在于，包含如下组分：一水合柠檬酸3-6g/L，二水合柠檬酸钠1-3g/L，0.5-1g/L TMB-HCl，0.1-0.5g/L EDTA-2Na，5-10g/L β环糊精，0.1-0.5g/L过氧化脲，0.2-0.5ml/L P300，0.005-0.01g/L荧光桃红B和还原剂，其余为水。
2.根据权利要求1所述的一种TMB二合一底物，其特征在于，包含如下组分：一水合柠檬酸5g/L，二水合柠檬酸钠2.8g/L，0.6g/L的TMB-HCl，0.28g/L EDTA-2Na，9g/L β环糊精，0.2g/L过氧化脲，0.5ml/L P300，0.009g/L荧光桃红B和还原剂，其余为水。
3.根据权利要求1或2所述的一种TMB二合一底物，其特征在于，所述还原剂包括β巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。
4.根据权利要求3所述的一种TMB二合一底物，其特征在于，所述β巯基乙醇浓度为5-10ul/L。
5.根据权利要求3所述的一种TMB二合一底物，其特征在于，所述二硫苏糖醇浓度为0.02-0.05g/L。
6.根据权利要求3所述的一种TMB二合一底物，其特征在于，所述三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐浓度为0.02-0.05g/L。
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