CN107561261A - 一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents
一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107561261A CN107561261A CN201710716009.6A CN201710716009A CN107561261A CN 107561261 A CN107561261 A CN 107561261A CN 201710716009 A CN201710716009 A CN 201710716009A CN 107561261 A CN107561261 A CN 107561261A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid
- enhanced chemical
- chemical luminescence
- reagent box
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种增强型化学发光检测试剂盒，包括A液和B液，其中，包括A液和B液，其中，A液为包含0.1‑10mM鲁米诺、1‑10mM 3‑(10′‑吩噻嗪基)丙烷‑1‑磺酸盐、和0.5‑3mM 4‑吗啉基吡啶的10‑200mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为1‑10mM的过氧化脲溶液。本发明通过采用新型增强剂和电子传递中间体，并通过调整组分比例配合更有效的过氧化物，获得更灵敏的检测结果，皮克至低飞克级的目标蛋白检测；反应开始一小时内保持较高的光强度；37℃下热加速实验2周没有对产品效果没有明显影响，4℃下稳定保存1年。
Description
技术领域
本发明涉及生化实验试剂领域，更特别地，涉及一种增强型化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
ECL(Enhance chemluminesence)是一种在western blot中使用的发光试剂。在western blot实验中，复杂的蛋白混合物经SDS-PAGE分离，并转移到固相膜上(如NC、PVDF)等，用于免疫学检测，经HRP标记的抗体与膜上的蛋白直接(标记一抗)或间接(标记二抗)反应；当加入ECL试剂后，在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光，而试剂中含有增强剂使得发光显著增强。目前常规ECL 发光试剂检测灵敏度为纳克级，超敏型检测灵敏度为皮克级。
专利CN提供了一种增强型化学发光检测试剂盒，其包含A液和B液，所述A液为含有0.5mg/ml 4-morp(4-吗啉吡啶)、0.5mg/ml SPTZ(吩噻嗪-10-基- 丙基磺酸钠)和0.002mg/ml鲁米诺的pH 9.0的0.2M Tris-HCl溶液，所述B液为含有双氧水的缓冲液，其使用4-MORP和SPTZ做增强剂，提高了鲁米诺的发光强度，从而可提高化学发光反应的灵敏度和光强度，与普通的化学发光试剂和方法相比，灵敏度提高了20-40倍，由此可节约抗体，降低成本。但过氧化氢稳定性差，作为产品储存时间短，运输过程中降解情况严重，质量不稳定。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出一种增强型化学发光检测试剂盒及方法，通过采用新型增强剂和电子传递中间体，并通过调整组分比例配合更有效的过氧化物，获得更灵敏的检测结果。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明的增强型化学发光检测试剂盒包括 A液和B液，其中，A液为包含0.1-10mM鲁米诺、1-10mM 3-(10'-吩噻嗪基) 丙烷-1-磺酸盐、和0.5-3mM 4-吗啉基吡啶的10-200mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为1-10mM的过氧化脲溶液。
优选地，A液为包含1～2mM鲁米诺、2～5mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1- 磺酸盐和2～3mM 4-吗啉基吡啶的80mM～100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐；B 液为4～10mM过氧化脲溶液。
更优选地，包含1mM鲁米诺、4.2mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、和 3mM 4-吗啉基吡啶的80mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为4mM过氧化脲溶液。
优选地，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液的pH为7.5～9，通过用盐酸调节 pH。
更优选地，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液的pH为8.3。
其中，所述过氧化脲溶液通过先加入脲过氧化氢加合物，使用1X PBS pH7.4 缓冲液搅拌溶解，定容后0.22μm滤膜过滤得到。
具体在实施过程中，A液的配制方法为：加入配方量的鲁米诺、3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐和4-吗啉基吡啶，用盐酸调节 pH，超纯水定容；B液的制备方法为加入配方量的脲过氧化氢加合物，使用 1XPBS pH7.4缓冲液搅拌溶解，定容。
有益效果
本发明通过采用新型增强剂和电子传递中间体，并通过调整组分比例配合更有效的过氧化物，获得更灵敏的检测结果，可实现皮克至低飞克级的抗原检测；过氧化脲与过氧化氢相比稳定性更高，在高温下尤其明显，同时供氧能力更强，显色条带亮度更高，具有更高的稳定性；另外反应开始一小时内保持较高的光强度；更高的热稳定性：37℃下热加速实验2周没有对产品效果没有明显影响， 4℃下可稳定保存1年。
附图说明
图1为增强剂催化的辣根过氧化物酶鲁米诺发光反应原理，其中，HPR为辣根过氧化物酶；HPR-I1为氧化辣根过氧化物酶中间产物1；HPR-I2为氧化辣根过氧化物酶中间产物2；LH为鲁米诺阴离子；L-为鲁米诺自由基阴离子；L为 Diazaquinone；LO2 2-为鲁米诺过氧化物；E为增强剂；E-为增强剂自由基；AP2-为3-Amiinophthalic acid dianioin；AP2-*为3-Amiinophthalic acid dianioin激发态；
图2为ECL试剂显色A549细胞GADPH内参抗体结果图；
图3为不同浓度鲁米诺对ECL发光液光强度效果影响图；
图4为不同浓度SPTZ对ECL发光液光强度效果影响图
图5为不同浓度MORP对ECL发光液光强度效果影响图；
图6为不同浓度过氧化脲对ECL发光液光强度效果影响图；
图7为本发明试剂盒热稳定性实验结果图；其中，左侧栏为试剂盒存储于 4℃下14天光强度变化，右侧栏为试剂盒存储于37℃下14天光强度变化；
图8为两种不同ECL试剂盒在同样的反应条件下光强度随反应时间的变化，方块代表过氧化脲组，圆圈代表双氧水组；
图9为过氧化脲组和双氧水组试剂盒光强度的对比图，其中，上条带为双氧水组，下条带为过氧化脲组；
图10为过氧化脲组和双氧水组试剂盒热稳定性的对比图，其中，上条带为双氧水组，下条带为过氧化脲组。
具体实施方式
本发明提供了一种增强型化学发光检测试剂盒，包括A液和B液，其中A 液为包含0.1-10mM鲁米诺、1-10mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、和0.5-3 mM 4-吗啉基吡啶的10-200mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为1-10mM 的过氧化脲溶液。
其中，A液的配制方法为：加入配方量的鲁米诺、3-(10'-吩噻嗪基)丙烷 -1-磺酸盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐和4-吗啉基吡啶，用盐酸调节pH至7.5-9.0，超纯水定容；B液的制备方法为加入配方量的过氧化脲，使用1XPBS pH7.4缓冲液搅拌溶解，定容。
本发明增强剂催化的辣根过氧化物酶鲁米诺发光反应原理如图1所示。在常规ECL反应中鲁米诺作为辣根过氧化物酶的底物被过氧化氢氧化生成 3-Aminophthalic aciddianion，该产物处于激发态，发射光，光谱最大吸收位于 425nm。本专利中采用与辣根过氧化物酶结合能力远强过鲁米诺的增强剂作为底物，被过氧化氢氧化，在将电子传递给鲁米诺生成3-Aminophthalic acid dianion 并发光，该方法提高光强度达105倍。
如图2所示，其显示了ECL试剂显色A549细胞GADPH内参抗体结果图。条带1为Miliipore超敏试剂，条带2为本发明采用试剂；泳道1为分子量marker，泳道2-4分别为10ug细胞总蛋白，1ug细胞总蛋白，0.1ug细胞总蛋白；样本一抗稀释液浓度为1:5000，二抗稀释浓度为1:5000。
图3为不同浓度鲁米诺对ECL发光液光强度效果影响图。如图所示反应液中0.15mM鲁米诺条件下光强度最强，但是由于鲁米诺含量少，反应持续时间短；因此选择0.5mM作为反应液中最适鲁米诺浓度，此处浓度为A液和B液混合后的浓度。
图4不同浓度SPTZ对ECL发光液光强度效果影响图。结果表明反应液中 2.1mMSPTZ条件下光强度最强，此处浓度为A液和B液混合后的浓度。
图5为不同浓度MORP对ECL发光液光强度效果影响图。结果表明反应液中1.5mMMORP条件下光强度最强，此处浓度为A液和B液混合后的浓度。
图6为不同浓度过氧化脲对ECL发光液光强度效果影响图。如图所示反应液中2.0mM过氧化脲条件下光强度最强，此处浓度为A液和B液混合后的浓度。
本发明同时对制备的试剂盒的热稳定性以及光稳定性进行考察，结果如图7 和图8所示。其中，ECL试剂盒A与试剂盒B分别储存与4℃与37℃下14天光强度变化。左侧代表储存于37℃试剂盒，右侧代表储存于4℃试剂盒。结果表明，本发明试剂盒在37℃下热加速实验2周对产品效果没有明显影响，4℃下可以稳定保存1年。图8结果表明，本发明试剂盒具有更好的光稳定性。
本发明对采用氧化剂过氧化脲制备的试剂盒(过氧化脲组)和市面常用氧化剂双氧水制备试剂盒(双氧水组)做了光强度和热稳定性对比，结果如图9和图 10所示。其中，过氧化脲组A液组分为鲁米诺1mM、SPTZ 4.2mM、MORP 3mM， B液为过氧化脲4mM；双氧水组A液与过氧化脲组A液相同，B液为双氧水 4mM；条带1为双氧水组，条带2为过氧化脲组；泳道1为分子量marker，泳道2-4分别为10ug细胞总蛋白，1ug细胞总蛋白，0.1ug细胞总蛋白；样本一抗稀释液浓度为1:5000，二抗稀释浓度为1:5000，检测目标为K562细胞GADPH 内参抗体。结果表明本项目所采用氧化剂过氧化脲相比双氧水具备更强的氧化作用，染色蛋白条带更明亮；同时37℃下热加速实验2周后，采用双氧水的对照组组分基本失活，染色效果很差，而过氧化脲组依然保持稳定的蛋白染色能力。
本发明通过采用新型增强剂和电子传递中间体，并通过调整组分比例配合更有效的过氧化物，获得更灵敏的检测结果，可实现皮克至低飞克级的抗原检测；具有更高的稳定性；另外反应开始一小时内保持较高的光强度；更高的热稳定性：37℃下热加速实验2周没有对产品效果没有明显影响，4℃下可稳定保存1年。
Claims (7)
1.一种增强型化学发光试剂盒，其特征在于，包括A液和B液，其中，A液为包含0.1-10mM鲁米诺、1-10mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、和0.5-3mM 4-吗啉基吡啶的10-200mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为1-10mM的过氧化脲溶液。
2.根据权利要求1所述的增强型化学发光试剂盒，其特征在于，其中，A液为包含1～2mM鲁米诺、2～5mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐和2～3mM 4-吗啉基吡啶的80mM～100mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐；B液为4～10mM过氧化脲溶液。
3.根据权利要求1所述的增强型化学发光试剂盒，其特征在于，A液为包含1mM鲁米诺、4.2mM 3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、和3mM 4-吗啉基吡啶的80mM三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液；B液为4mM过氧化脲溶液。
4.根据权利要求1～3所述的增强型化学发光试剂盒，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液的pH为7.5～9，通过用盐酸调节pH。
5.根据权利要求1～3所述的增强型化学发光试剂盒，其特征在于，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液的pH为8.3。
6.根据权利要求1～3所述的增强型化学发光试剂盒，其特征在于，所述过氧化脲溶液通过先加入脲过氧化氢加合物，使用1X PBS pH7.4缓冲液搅拌溶解，定容后0.22μm滤膜过滤得到。
7.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，A液的配制方法为：加入配方量的鲁米诺、3-(10'-吩噻嗪基)丙烷-1-磺酸盐、三羟甲基氨基甲烷缓冲盐和4-吗啉基吡啶，用盐酸调节pH，超纯水定容；B液的制备方法为加入配方量的脲过氧化氢加合物，使用1XPBSpH7.4缓冲液搅拌溶解，定容。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710716009.6A CN107561261A (zh) | 2017-08-18 | 2017-08-18 | 一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710716009.6A CN107561261A (zh) | 2017-08-18 | 2017-08-18 | 一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107561261A true CN107561261A (zh) | 2018-01-09 |
Family
ID=60976400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710716009.6A Pending CN107561261A (zh) | 2017-08-18 | 2017-08-18 | 一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107561261A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110031615A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 |
| CN110554183A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-10 | 沈阳万类生物科技有限公司 | 一种超敏型ecl化学发光试剂 |
| CN111961636A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-11-20 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种外泌体的提取试剂及其应用 |
| CN113567679A (zh) * | 2021-06-19 | 2021-10-29 | 百美特(上海)生物科技有限公司 | 一种超敏ecl发光液试剂及其使用方法 |
| WO2023225776A1 (zh) * | 2022-05-23 | 2023-11-30 | 孙嘉怡 | 一种制备高灵敏性稳定化学发光底物液方法及其在免疫检测中应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110053200A1 (en) * | 2007-02-20 | 2011-03-03 | Cyanagen Srl | Method for increasing light emission from a chemiluminescent reaction |
| CN103901217A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-02 | 靖江市人民医院 | 大豆过氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏综合症产前筛查血清学标志物检测中的应用 |
| CN103901192A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-02 | 靖江市人民医院 | 一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用 |
| CN106198504A (zh) * | 2016-07-25 | 2016-12-07 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光检测试剂盒及方法 |
-
2017
- 2017-08-18 CN CN201710716009.6A patent/CN107561261A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110053200A1 (en) * | 2007-02-20 | 2011-03-03 | Cyanagen Srl | Method for increasing light emission from a chemiluminescent reaction |
| CN103901217A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-02 | 靖江市人民医院 | 大豆过氧化物酶免疫生物芯片及在唐氏综合症产前筛查血清学标志物检测中的应用 |
| CN103901192A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-07-02 | 靖江市人民医院 | 一种酶标免疫试剂盒及其在血清检测中的应用 |
| CN106198504A (zh) * | 2016-07-25 | 2016-12-07 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种增强型化学发光检测试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ETTORE MARZOCCHI ET AL: "Chemiluminescent detection systems of horseradish peroxidase employing nucleophilic acylation catalysts", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 * |
| MARINA M. VDOVENKO ET AL: "Optimization of horseradish peroxidase-catalyzed enhanced chemiluminescence reaction by full factorial design", 《TALANTA》 * |
| XIAOQI TAO ET AL: "Development of a highly sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay using enhanced luminol as substrate", 《LUMINESCENCE》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110031615A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-07-19 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 |
| CN110554183A (zh) * | 2019-09-17 | 2019-12-10 | 沈阳万类生物科技有限公司 | 一种超敏型ecl化学发光试剂 |
| CN111961636A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-11-20 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种外泌体的提取试剂及其应用 |
| CN111961636B (zh) * | 2020-07-06 | 2021-11-26 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种外泌体的提取试剂及其应用 |
| CN113567679A (zh) * | 2021-06-19 | 2021-10-29 | 百美特(上海)生物科技有限公司 | 一种超敏ecl发光液试剂及其使用方法 |
| WO2023225776A1 (zh) * | 2022-05-23 | 2023-11-30 | 孙嘉怡 | 一种制备高灵敏性稳定化学发光底物液方法及其在免疫检测中应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107561261A (zh) | 一种增强型化学发光试剂盒及其制备方法 | |
| CN111537748B (zh) | 一种检测人新型冠状病毒IgM抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| RU2352936C2 (ru) | Способ и набор для обнаружения взрывчатых веществ, содержащих окислители определенного вида | |
| CN111537747B (zh) | 一种检测人新型冠状病毒IgG抗体的试纸条、试剂盒及其制备方法 | |
| ES2670424T3 (es) | Procedimiento para aumentar y regular la emisión de luz de una reacción quimioluminiscente | |
| US6537745B2 (en) | Buffers for stabilizing antigens | |
| US7381797B2 (en) | Stabilization of H2O2 under alkaline conditions for use in luminescence, fluorescence and colorimetric assays for enhanced detection of peroxidase type assays | |
| CN109738626A (zh) | Ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 | |
| US20130084652A1 (en) | Homogeneous Chemiluminescence Assay Methods with Increased Sensitivity | |
| US8557147B2 (en) | Chemiluminescent compositions, enhancing reagents for chemiluminescence and methods for the preparation and use thereof | |
| CN107807244A (zh) | 一种尿液潜血检测试纸及其制备方法 | |
| CN105842441B (zh) | 一种针对赭曲霉毒素a的检测方法 | |
| US9139766B2 (en) | Chemiluminescent compositions and enhancing reagents for chemiluminescence | |
| CN102206270B (zh) | 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用 | |
| CN109293776A (zh) | 一种氟虫腈特异性结合蛋白及其应用 | |
| EP3855185B1 (en) | Chemiluminescent substrates for peroxidase with extended shelf-life | |
| US20120003753A1 (en) | Chemiluminescent compositions, enhancing reagents for chemiluminescence and methods for the preparation and use thereof | |
| CA1305700C (en) | Compounds and reagents for oxidase test | |
| US11112366B2 (en) | Reagent and kit for enhancing chemiluminescent reaction | |
| CN114280016A (zh) | 一种外泌体检测方法 | |
| Kadobayashi et al. | Spectrophotometric determination of DNA binding protein, histone, with 3, 4, 5, 6-tetrafluoro-2-carboxyphenylfluorone and manganese (II) | |
| WO2019104529A1 (zh) | 均相检测方法 | |
| WO2018012606A1 (ja) | 反応促進剤 | |
| CN107796793B (zh) | FXa的检测试剂及检测方法 | |
| JP2013055934A (ja) | 測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180109 |