CN107782721A - 一种基于膜的生物样品化学发光检测方法和相关检测试剂盒 - Google Patents

一种基于膜的生物样品化学发光检测方法和相关检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，包括：(1)将第一检测物包被在膜上；(2)使待检测生物样品与膜接触，第一检测物与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体；(3)使第二检测物与膜接触，第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，第二检测物与第一复合体中的被检测物结合形成第二复合体；(4)加入启动发光剂，如果第二检测物标记有酶，则还需加入化学发光底物，启动发光剂用于使化学发光剂或化学发光底物发光，然后进行化学发光测量。还提供了相关检测试剂盒。本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法设计巧妙，操作简便，不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，适于大规模推广应用。

Description

一种基于膜的生物样品化学发光检测方法和相关检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物样品检测技术领域，特别涉及生物样品化学发光检测技术领域，具体是指一种基于膜的生物样品化学发光检测方法和相关检测试剂盒。
背景技术
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。化学发光免疫分析是将高灵敏度的化学发光技术和高特异性的免疫反应结合起来的先进免疫诊断技术，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽等特点，主要应用在医院的检验科，进行传染病诊断、肿瘤诊断、内分泌功能诊断、心血管疾病诊断和优生优育诊断等。
免疫诊断技术先后经历了放射性免疫、胶体金、酶联免疫、时间分辨荧光法和化学发光免疫阶段。化学发光免疫技术相比其他技术，具有定量检测、灵敏度高、宽的线性范围、自动化程度高等优势，已经成为免疫诊断技术的主流。
目前临床检测使用的免疫化学发光主要包括：
基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定，该方法优点在于成本较低，缺点在于反应速度慢，稳定性较差；
基于磁微粒的化学发光酶免疫测定，该方法优点在于反应速度较快，缺点在于稳定性较差，成本较高；
基于磁微粒的化学发光免疫测定，由于直接标记化学发光剂，并结合磁微粒技术，该方法优点在于反应速度较快，稳定，缺点在于成本较高；
电化学发光免疫测定，该方法优点在于准确性及稳定性很好，缺点在对于仪器及试剂均有很高的要求，成本高。
因此，需要提供一种生物样品化学发光检测方法，其不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，其不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，其设计巧妙，操作简便，既具有基于磁微粒的化学发光检测方法的优点，又具有基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定的优点，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒，其不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒，设计巧妙，结构简洁，操作简便，既具有基于磁微粒的化学发光检测方法的优点，又具有基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定的优点，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)将第一检测物包被在膜上；
(2)使待检测生物样品与所述膜接触，所述第一检测物与所述待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体；
(3)使第二检测物与所述膜接触，所述第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，所述第二检测物与所述第一复合体中的所述被检测物结合形成第二复合体；
(4)加入启动发光剂，如果所述第二检测物标记有所述酶，则还需加入所述化学发光底物，所述启动发光剂用于使所述化学发光剂或所述化学发光底物发光，然后进行化学发光测量。
所述膜可以是任何合适的膜，例如塑料膜或纤维素膜，所述塑料膜例如是聚乙烯膜、聚氯乙烯、尼龙膜等，较佳地，所述膜是聚偏氟乙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或DEAE纤维素膜。
将第一检测物包被在膜上可以采用合适的结构，较佳地，采用亲和素将所述膜亲和素化，采用生物素标记所述第一检测物，所述第一检测物通过所述生物素和所述亲和素反应包被在所述膜上。
所述被检测物、所述第一检测物和所述第二检测物可以是任何合适的物质，较佳地，所述被检测物是生物标志物，所述第一检测物是用于检测所述生物标志物的第一抗原、第一抗体或第一核酸，所述第二检测物是用于检测所述生物标志物的第二抗原、第二抗体或第二核酸。
所谓生物标志物(Biomarker)是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。
所述生物标志物、所述第一检测物和所述第二检测物可以是任何合适的物质，更佳地，所述生物标志物是C反应蛋白，所述第一检测物是第一C反应蛋白抗体，所述第二检测物是第二C反应蛋白抗体；所述生物标志物是人绒毛膜促性腺激素，所述第一检测物是第一人绒毛膜促性腺激素抗体，所述第二检测物是第二人绒毛膜促性腺激素抗体；或者，所述生物标志物是乙肝核心抗体，所述第一检测物和所述第二检测物均为乙肝核心抗原。
所述化学发光剂和所述启动发光剂可以是任何合适的试剂，较佳地，所述化学发光剂是吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌，所述启动发光剂是氢氧化钠和过氧化氢。
所述酶、所述化学发光底物和所述启动发光剂可以是任何合适的酶和试剂，较佳地，所述酶是辣根过氧化物酶，所述化学发光底物是鲁米诺或鲁米诺衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢；或者，所述酶是碱性磷酸酶，所述化学发光底物是金刚烷～1,2～二氧乙烷衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢。
所述金刚烷～1,2～二氧乙烷衍生物可以是，例如AMPPD(3～(2～螺旋金刚烷)～4～甲氧基～4～(3～磷氧酰)～苯基～1,2～二氧环乙烷二钠盐)、CSPD、ADP～star或CDP～star(3～(2～螺旋金刚烷)～4～甲氧基～4～(3～磷氧酰)～苯基～1,2～二氧环乙烷)。
所述待检测生物样品可以是任何合适的样品，较佳地，所述待检测生物样品是血清、血浆、全血、唾液、尿液或粪便。
较佳地，所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法还包括以下步骤：采用标准品替换所述待检测生物样品进行所述步骤(1)至所述步骤(4)，所述标准品中含有定量的所述被检测物，从而绘制所述被检测物的标准曲线，以定量所述待检测生物样品中的所述被检测物的含量。
在本发明的第二方面，提供了一种基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒，其特点是，包括膜、第一检测物、第二检测物和启动发光剂，所述第一检测物包被在所述膜上，所述第一检测物用于与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体，所述第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，所述第二检测物用于与所述第一复合体中的所述被检测物结合形成第二复合体，如果所述第二检测物标记有所述酶，则所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括所述化学发光底物，所述启动发光剂用于使所述化学发光剂或所述化学发光底物发光。
较佳地，所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括标准品，所述标准品中含有定量的所述被检测物。
所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还可以具有以上提及的各种特征。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法包括以下步骤：(1)将第一检测物包被在膜上；(2)使待检测生物样品与膜接触，第一检测物与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体；(3)使第二检测物与膜接触，第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，第二检测物与第一复合体中的被检测物结合形成第二复合体；(4)加入启动发光剂，如果第二检测物标记有酶，则还需加入化学发光底物，启动发光剂用于使化学发光剂或化学发光底物发光，然后进行化学发光测量，因此，不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，适于大规模推广应用。
2、本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法包括以下步骤：(1)将第一检测物包被在膜上；(2)使待检测生物样品与膜接触，第一检测物与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体；(3)使第二检测物与膜接触，第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，第二检测物与第一复合体中的被检测物结合形成第二复合体；(4)加入启动发光剂，如果第二检测物标记有酶，则还需加入化学发光底物，启动发光剂用于使化学发光剂或化学发光底物发光，然后进行化学发光测量，因此，设计巧妙，操作简便，既具有基于磁微粒的化学发光检测方法的优点，又具有基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定的优点，适于大规模推广应用。
3、本发明的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒包括膜、第一检测物、第二检测物和启动发光剂，第一检测物包被在膜上，第一检测物用于与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体，第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，第二检测物用于与第一复合体中的被检测物结合形成第二复合体，如果第二检测物标记有酶，则基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括化学发光底物，启动发光剂用于使化学发光剂或化学发光底物发光，因此，不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，适于大规模推广应用。
4、本发明的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒包括膜、第一检测物、第二检测物和启动发光剂，第一检测物包被在膜上，第一检测物用于与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体，第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，第二检测物用于与第一复合体中的被检测物结合形成第二复合体，如果第二检测物标记有酶，则基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括化学发光底物，启动发光剂用于使化学发光剂或化学发光底物发光，因此，设计巧妙，结构简洁，操作简便，既具有基于磁微粒的化学发光检测方法的优点，又具有基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定的优点，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明，附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测C反应蛋白的标准曲线图谱。
图2是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测C反应蛋白与西门子IMMULITE2000High Sensitivity CRP检测C反应蛋白的相关性分析图谱。
图3是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测人绒毛膜促性腺激素的标准曲线图谱。
图4是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测人绒毛膜促性腺激素与罗氏诊断的绒毛膜促性腺激素检测试剂盒检测人绒毛膜促性腺激素的相关性分析图谱。
图5是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测C反应蛋白的产品的加速稳定性图谱。
图6是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测人绒毛膜促性腺激素的产品的加速稳定性图谱。
图7是采用本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法检测乙肝核心抗体的产品的加速稳定性图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，具体步骤如下：
1)亲和素化的膜的制备：
a、表面活化：取膜，放入等离子处理机进行真空等离子处理，功率为10～300w，时间为0.5～30min；
b、化学接枝：将活化后的膜置入质量分数为0.1～20‰的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中处理0.5～30min，用纯水清洗1～10次，然后在质量分数为0.1～10‰的聚丙烯酸(PAA)溶液中处理0.5～30min，用纯水清洗1～10次；
c、亲和素化：配制1～1000μg/mL的亲和素溶液；将步骤b所得膜处理面向下放置于溶液中，0～43℃孵育0.5～24h；加入0.01～1mol/L氯化铵溶液，0～43℃反应1～60min；洗膜1～10次，晾干备用；
2)生物素标记第一检测物例如第一抗原/第一抗体；用二甲基亚砜(DMSO)配制1～100mg/mL生物素-N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液；配制浓度为0.1～100mg/mL的第一抗原/第一抗体溶液；将0.1～1000μg的生物素酯加入1mg待标记的第一抗原/第一抗体中，混合均匀并在室温下孵育0.5～10h；再加入2μL 10mol/L的氯化铵，室温孵育1～60min；透析以除去未结合的生物素；
3)反应槽的制备：将膜裁剪成合适大小，亲和素化的一面向上置于反应槽，卡紧反应槽以免渗漏，这里的反应槽为上下镂空两个部分，膜在中间，为保证液体只从膜经过，所以需卡紧反应槽；
4)包被：将步骤2)生物素标记的第一抗原/第一抗体稀释至2～10μg/mL，加入反应槽中30～500μL，4～43℃下反应5～60min，用PBST溶液洗涤；然后加入100～500μL含1％BSA的PBS溶液0.01mol/L，pH7.2，4～43℃下反应5～60min，待用；
5)标记第二检测物例如第二抗原/第二抗体：用化学发光剂或底物为化学发光底物的酶标记第二抗原/第二抗体；
6)检测：
a、标准曲线的绘制：将50uL标准品加入反应槽，37～43℃反应1～15min，用PBST溶液(0.01mol/L PBS，pH 7.2，0.05％Tween 20溶液)洗涤三次，每次150uL；加入50uL稀释至合适浓度的标记第二抗原/第二抗体，37～43℃反应1～15min，用PBST溶液洗涤三次，每次150uL；最后加入化学发光底物(如果标记的是酶的话)和启动发光剂进行检测，绘制标准曲线；
b、样品检测：将50uL生物样品加入反应槽，反应过程同上，通过对标准曲线进行读取从而进行化学发光定量测定。
其中，所述化学发光剂和所述启动发光剂可以是任何合适的试剂，较佳地，所述化学发光剂是吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌，所述启动发光剂是氢氧化钠和过氧化氢。例如，所述化学发光剂是2mg/mL吖啶酯溶液或2mg/mL的ABEI溶液，所述启动发光剂是10～200mmol/L的过氧化氢溶液和0.01～1mol/L的氢氧化钠溶液。
所述酶、所述化学发光底物和所述启动发光剂可以是任何合适的酶和试剂，较佳地，所述酶是辣根过氧化物酶，所述化学发光底物是鲁米诺或鲁米诺衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢；或者，所述酶是碱性磷酸酶，所述化学发光底物是金刚烷～1,2～二氧乙烷衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢。例如，所述启动发光剂是10～200mmol/L的过氧化氢溶液，所述酶是辣根过氧化物酶，所述化学发光底物是0.01～1mol/L的鲁米诺溶液；或者，所述启动发光剂是10～200mmol/L的过氧化氢溶液，所述酶是碱性磷酸酶，所述化学发光底物是0.01～1mol/L的AMPPD溶液。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
实施例1基于膜的生物标志物的化学发光检测方法在测定C反应蛋白(CRP)中的应用
1)亲和素化的膜的制备：步骤如下：
a、表面活化：设置等离子处理机参数：功率100W，时间2min，保护气体高纯氮气，工作气体高纯氧气200mL/min；将聚偏氟乙烯膜(PVDF)裁剪成10cm×10cm大小，放入等离子处理机，启动设备，进行真空等离子处理；
b、化学接枝：将处理完的PVDF膜置于质量分数为5‰的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中处理5min，用纯水清洗1次；转入质量分数为10‰的聚丙烯酸(PAA)溶液中处理30min，用纯水清洗10次；
c、亲和素化：用二甲基亚砜(DMSO)配制10mg/ml亲和素N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)稀释至10ug/ml，将PVDF膜处理面向下放置于溶液中，43℃孵育0.5h；加入0.01mol/L氯化铵溶液，43℃反应1min；用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)洗膜10次，晾干备用。
2)生物素标记CRP(C反应蛋白)抗体(C1)(购自HyTest，货号4C28，克隆号C2)，步骤如下：
①用二甲基亚砜(DMSO)配制1mg/mL生物素-N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
②用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)配制浓度为100mg/mL的CRP抗体(C1))溶液；
③将25μg生物素酯加入1mg抗体中，混合均匀并在室温下孵育0.5h；
④加入2μL l0mol/L的氯化铵，室温孵育10min；
⑤将抗体溶液用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)4℃透析过夜，以除去未结合的生物素。
3)反应槽的制备，步骤如下：将膜裁剪成1cm×1cm大小，亲和素化的一面向上置于反应槽，卡紧反应槽以免渗漏。
4)CRP抗体(C1)包被，步骤如下：用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)将生物素标记的CRP抗体(C1)稀释至5μg/mL，加入反应槽中(500μL)，37℃下反应30min，用PBST(0.01mol/LPBS pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；然后加入150μL含1％BSA的PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2)，43℃封闭5min，待用。
5)吖啶酯标记检测CRP抗体(C2)(购自HyTest，货号4C28cc，克隆号C6cc)，步骤如下：
①将吖啶酯粉末用二甲基甲酰胺溶解至2mg/mL，～20℃保存；
②待标记CRP抗体(C2)用标记缓冲液(0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CB)，pH8.0)稀释至1mg/mL；
③将吖啶酯与待标记抗体以分子数比5:1混合，充分搅拌，室温反应30min；
④用10μL含10％赖氨酸的标记缓冲液(0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CB)，pH 8.0)终止反应，室温反应20min；
⑤用15×80mm Sephadex G-50脱盐柱对反应终产物进行纯化。
(6)化学发光检测，步骤如下：
a、
①将不同浓度(0mg/L、0.5mg/L、2mg/L、5mg/L、15mg/L、30mg/L)CRP标准品50μL分别加入反应槽，37℃反应5min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150ul；
②加入50μL 1:5000稀释的吖啶酯标记的检测CRP抗体，43℃反应1min，用PBST(0.01mol/L PBS pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；
③加入启动发光剂1mol/L氢氧化钠和80mmol/L过氧化氢溶液，进行检测，绘制标准曲线，见图1。
b、将30份待检测血清加入反应槽，按照步骤a进行检测，通过标准曲线读取定量样品中CRP的含量，并与西门子诊断的IMMULITE2000High Sensitivity CRP(国食药监械(进)字2014第2403210号)进行比较，结果如下。
检测结果线性回归分析(r＝0978，P>0.05)，结果表明，两者检测结果无显著性差异，具有很好的可比性。
c、将3份CRP标准品(0.5mg/L、5mg/L、15mg/L)按照步骤a对同批次的产品和3个不同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，通过标准曲线读取定量样品中CRP的含量，计算批内和批间重复性，结果如下。
结果表明，批内差及批间差分别在4％～6.28％和7.03％～10.52％，优于市面上同类产品标准(<10％和<15％)，有很好的可重复性。
d、将3份CRP标准品(0.5mg/L、5mg/L、15mg/L)按照步骤a对放置于37℃1～7天的同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，通过标准曲线读取定量样品中CRP的含量，取均值，观察值的变化，结果如下。
结果表明，产品于37℃放置7天(相当于4℃放置12月)后，产品性能无明显影响，产品稳定可靠。
实施例2基于膜的生物标志物的化学发光检测方法在测定人绒毛膜促性腺激素(hCG)中的应用
1)亲和素化膜的制备，步骤如下：
a、表面活化：设置等离子处理机参数：功率10W，时间30min，保护气体高纯氮气，工作气体高纯氧气200mL/min；将硝酸纤维素膜(NC)裁剪成10cm×10cm大小，放入等离子处理机，启动设备，进行真空等离子处理；
b、化学接枝：将处理完的NC膜置于质量分数为20‰的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中处理0.5min，用纯水清洗3次；转入质量分数为0.1‰的聚丙烯酸(PAA)溶液中处理5min，用纯水清洗3次；
c、亲和素化：用二甲基亚砜(DMSO)配制10mg/mL亲和素N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)稀释至1000μg/mL，将NC膜处理面向下放置于溶液中，室温孵育5h；加入0.1mol/L氯化铵溶液，0℃反应60min；用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)洗膜1次，晾干备用。
2)生物素标记hCG抗体(H01)(购自HyTest，货号2H8，克隆号77F12)，步骤如下：
①用二甲基亚砜(DMSO)配制10mg/mL生物素-N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
②用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)配制浓度为0.1mg/mL的hCG抗体(H01)溶液；
③将1000μg生物素酯加入1mg抗体中，混合均匀并在室温下孵育10h；
④加入2μL l0mol/L的氯化铵，室温孵育1min；
⑤将抗体溶液用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)4℃透析过夜，以除去未结合的生物素。
3)反应槽的制备，步骤如下：将膜裁剪成1cm×1cm大小，亲和素化的一面向上置于反应槽，卡紧反应槽以免渗漏。
4)hCG抗体(H01)包被，步骤如下：用Tris缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)将生物素标记的hCG抗体(H01)稀释至2μg/mL，加入反应槽中(30μL)，43℃下反应5min，用PBST(0.01mol/LPBS pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次100μL；然后加入100μL含1％BSA的PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2)，4℃封闭50min，待用。
5)ABEI(N～(4～氨丁基)～N～乙基异鲁米诺)标记检测hCG抗体(H02)(购自HyTest，货号2H8，克隆号28A4)，步骤如下：
①将ABEI粉末用0.1M HCl溶解，用纯水稀释至2mg/mL；
②待标记hCG抗体(H02)用标记缓冲液(0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CB)，pH9.0)稀释至1mg/mL；
③将ABEI与待标记抗体以分子数比8:1混合，充分搅拌，室温反应30min；
④用0.1M HCl调整pH至7.2，终止反应；
⑤用0.01M PBS缓冲液(pH 7.2)4℃透析过夜，除去过量的ABEI。
(6)化学发光检测，步骤如下：
a、①将不同浓度(0mIU/mL、25mIU/mL、100mIU/mL、500mIU/mL、2500mIU/mL、10000mIU/mL)hCG标准品50μL分别加入反应槽，40℃反应15min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；
②加入50μL稀释至合适浓度的ABEI标记的检测hCG抗体，37℃反应15min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；
③加入启动发光剂0.2mol/L氢氧化钠和100mmol/L过氧化氢溶液，进行检测，绘制标准曲线，见图3。
b、将40份待检测血清50μL加入反应槽，按照步骤a进行检测，通过标准曲线读取定量样品中hCG的含量，并与罗氏诊断的绒毛膜促性腺激素检测试剂盒(电化学发光法)(国食药监械(进)字2013第2404823号)进行比较，结果如下。
c、将3份hCG标准品(25mIU/mL、100mIU/mL、500mIU/mL)按照步骤a对同批次的产品和3个不同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，通过标准曲线读取定量样品中hCG的含量，计算批内和批间重复性，结果如下。
结果表明，批内差及批间差分别在2.98％～6.19％和6.67％～9.67％，优于市面上同类产品标准(<10％和<15％)，有很好的可重复性。
d、将3份hCG标准品(25mIU/mL、100mIU/mL、500mIU/mL)按照步骤a对放置于37℃1～7天的同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，通过标准曲线读取定量样品中hCG的含量，取均值，观察值的变化，结果如下。
结果表明，产品于37℃放置7天(相当于4℃放置12月)后，产品性能无明显影响，产品稳定可靠。
实施例3基于膜的生物标志物的化学发光检测方法在测定乙肝核心抗体(HBc)中的应用
1)亲和素化膜的制备，步骤如下：
a、表面活化：设置等离子处理机参数：功率300W，时间0.5min，保护气体高纯氮气，工作气体高纯氧气200mL/min；将聚偏氟乙烯膜(PVDF)裁剪成10cm×10cm大小，放入等离子处理机，启动设备，进行真空等离子处理；
b、化学接枝：将处理完的PVDF膜置于质量分数为0.1‰的聚乙烯亚胺(PEI)溶液中处理30min，用纯水清洗10次；转入质量分数为2.5‰的聚丙烯酸(PAA)溶液中处理0.5min，用纯水清洗1次；
c、亲和素化：用无水二甲基亚砜(DMSO)配制10mg/mL亲和素N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.8)稀释至1μg/mL，将PVDF膜处理面向下放置于溶液中，0℃孵育24h；加入1mol/L氯化铵溶液，室温反应20min；用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)洗膜3次，晾干备用。
(2)生物素标记HBc抗原(HBc Ag购自Abcam，Product code：ab49013)，步骤如下：
①用二甲基亚砜(DMSO)配制100mg/mL生物素N～羟基琥珀酰亚胺酯溶液；
②用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)配制浓度为1mg/mL的HBc抗原溶液；
③将0.1μg生物素酯加入1mg抗原中，混合均匀并在室温下孵育4h；
④加入2uL l0mol/L的氯化铵，室温孵育60min；
⑤将抗原溶液用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.2)4℃透析过夜，以除去未结合的生物素。
3)反应槽的制备，步骤如下：将膜裁剪成1cm×1cm大小，亲和素化的一面向上置于反应槽，卡紧反应槽以免渗漏。
4)HBc抗原包被，步骤如下：用Tris缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)将生物素标记的HBc抗原稀释至10μg/mL，加入反应槽中(50μL)，4℃下反应60min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次100μL；然后加入500μL含1％BSA的PBS溶液(0.01mol/L，pH7.2)，37℃封闭60min，待用。
5)HRP标记检测HBc抗原(HBc Ag购自Abcam，Product code：ab49013)，步骤如下：
①蛋白透析：目标蛋白即检测HBc抗原透析到碳酸盐缓冲液(CB)(pH9.6，50mM)中，换液2次以上；
②酶的氧化：称取4mg HRP干粉溶于0.2mL ddH2O中；称取NaIO4 5mg，溶于0.25mL的ddH2O中，吸取0.2mLNaIO4溶液与0.2mL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min；(注意：此后的操作均在避光条件下进行)吸取4μL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min；
③标记：将氧化好的HRP直接加入到已透析充分的检测HBc抗原；继续透析到碳酸盐缓冲液(CB)(pH9.6，50mM)中，换液2次以上；加入0.8mg NaBH4到其中，4℃静置2小时(不能再透析)，每30min摇动1次；PBS(10mM，pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比50％的甘油，混匀后备用。
(6)化学发光检测，步骤如下：
a、
①将HBc阴性对照品及阳性对照品50μL分别加入反应槽，43℃反应1min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；
②加入50μL稀释至合适浓度的HRP标记的检测HBc抗原，40℃反应10min，用PBST(0.01mol/L PBS，pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤三次，每次150μL；
③加入化学发光底物0.1mol/L鲁米诺溶液和启动发光剂10mmol/L过氧化氢溶液，进行检测，通过阴性对照品或阳性对照品的读数计算得到cutoff值。
b、将20份待检测血清50μL加入反应槽，按照步骤a进行检测，通过计算S/CO(待检血清发光值/cutoff值)判定样品中是否存在HBc抗体(S/CO≥1则为阳性，反之则为阴性)，并与罗氏诊断乙型肝炎病毒核心抗体检测试剂盒(电化学发光法)(国械注进20143405196)结果进行比较，结果如下。
样本编号 S/CO 结果 罗氏结果
Hc01 0.65 - -
Hc02 1.89 + +
Hc03 5.98 + +
Hc04 0.22 - -
Hc05 10.67 + +
Hc06 1.03 + -
Hc07 0.81 - -
Hc08 0.11 - -
Hc09 10.98 + +
Hc10 6.21 + +
Hc11 2.09 + +
Hc12 0.12 - -
Hc13 0.87 - -
Hc14 0.35 - -
Hc15 15.21 + +
Hc16 2.11 + +
Hc17 0.23 - -
Hc18 6.76 + +
Hc19 0.23 - -
Hc20 2.89 + -
“+”表示阳性，“-”表示阴性。
c、将3份HBc抗体阳性样本(高、中、低浓度)按照步骤a对同批次的产品和3个不同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，计算批内和批间重复性(以S/CO计)，结果如下。
结果表明，批内差及批间差分别在4.25％～5.19％和6.37％～9.12％，优于市面上同类产品标准(<10％和<15％)，有很好的可重复性。
d、将3份HBc抗体阳性样本(高、中、低浓度)按照步骤a对放置于37℃1～7天的同批次的产品分别进行检测，每个浓度测10次，取均值，观察值(以S/CO计)的变化，结果如下。
样本编号 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d
HBc01低浓度 1.23 1.22 1.19 1.23 1.09 1.10 1.08 1.05
HBc02中浓度 3.87 3.76 3.65 3.60 3.45 3.34 3.39 3.01
HBc03高浓度 8.53 8.43 8.44 8.12 8.11 8.09 7.90 7.89
结果表明，产品于37℃放置7天(相当于4℃放置12月)后，产品性能无明显影响，产品稳定可靠。
本发明克服了现有检测技术检测速度慢、试剂仪器复杂、诊断费用高等的不足，提供了一种快速、准确、稳定及低成本的基于膜的生物样品化学发光检测方法。
按照本发明提供的技术方案，使用成本低廉的膜代替成本较高的磁微粒，将特异性识别的蛋白(例如抗体、抗原)、核酸等包被于膜表面，与相应被检测物(例如生物标志物)结合后，再与针对该被检测物的酶或化学发光剂标记的检测蛋白(例如抗体、抗原)、核酸等，形成复合物，加入化学发光底物(若采用酶标记)和启动发光剂后，进行化学发光定量测定。
因此，本发明拥有基于磁微粒化学发光的速度快、准确稳定等优点，同时又降低了成本，该方法既适应半自动操作，又可以适应全自动检测的要求，适合中小医院及基层医疗机构对化学发光产品的需求。
综上，本发明的基于膜的生物样品化学发光检测方法不仅检测快速、准确、稳定，而且成本低，设计巧妙，操作简便，既具有基于磁微粒的化学发光检测方法的优点，又具有基于96孔微孔板的化学发光酶免疫测定的优点，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (10)

1.一种基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一检测物包被在膜上；
(2)使待检测生物样品与所述膜接触，所述第一检测物与所述待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体；
(3)使第二检测物与所述膜接触，所述第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，所述第二检测物与所述第一复合体中的所述被检测物结合形成第二复合体；
(4)加入启动发光剂，如果所述第二检测物标记有所述酶，则还需加入所述化学发光底物，所述启动发光剂用于使所述化学发光剂或所述化学发光底物发光，然后进行化学发光测量。
2.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述膜是聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或DEAE纤维素膜。
3.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，采用亲和素将所述膜亲和素化，采用生物素标记所述第一检测物，所述第一检测物通过所述生物素和所述亲和素反应包被在所述膜上。
4.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述被检测物是生物标志物，所述第一检测物是用于检测所述生物标志物的第一抗原、第一抗体或第一核酸，所述第二检测物是用于检测所述生物标志物的第二抗原、第二抗体或第二核酸。
5.如权利要求4所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述生物标志物是C反应蛋白，所述第一检测物是第一C反应蛋白抗体，所述第二检测物是第二C反应蛋白抗体；所述生物标志物是人绒毛膜促性腺激素，所述第一检测物是第一人绒毛膜促性腺激素抗体，所述第二检测物是第二人绒毛膜促性腺激素抗体；或者，所述生物标志物是乙肝核心抗体，所述第一检测物和所述第二检测物均为乙肝核心抗原。
6.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述化学发光剂是吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌，所述启动发光剂是氢氧化钠和过氧化氢。
7.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述酶是辣根过氧化物酶，所述化学发光底物是鲁米诺或鲁米诺衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢；或者，所述酶是碱性磷酸酶，所述化学发光底物是金刚烷～1,2～二氧乙烷衍生物，所述启动发光剂是过氧化氢。
8.如权利要求1所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法，其特征在于，所述的基于膜的生物样品化学发光检测方法还包括以下步骤：采用标准品替换所述待检测生物样品进行所述步骤(1)至所述步骤(4)，所述标准品中含有定量的所述被检测物，从而绘制所述被检测物的标准曲线，以定量所述待检测生物样品中的所述被检测物的含量。
9.一种基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括膜、第一检测物、第二检测物和启动发光剂，所述第一检测物包被在所述膜上，所述第一检测物用于与待检测生物样品中的被检测物结合形成第一复合体，所述第二检测物标记有化学发光剂或底物为化学发光底物的酶，所述第二检测物用于与所述第一复合体中的所述被检测物结合形成第二复合体，如果所述第二检测物标记有所述酶，则所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括所述化学发光底物，所述启动发光剂用于使所述化学发光剂或所述化学发光底物发光。
10.如权利要求9所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的基于膜的生物样品化学发光检测试剂盒还包括标准品，所述标准品中含有定量的所述被检测物。
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