CN116539872A - 定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物检测技术领域，具体公开了定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。本申请的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒包括检测卡和样本稀释液瓶；检测卡由胶板上依次粘结有硝酸纤维膜、吸水垫和结合垫而得；结合垫由玻璃纤维膜上喷涂结合垫处理液而得，且玻璃纤维膜经等离子体预处理；样本稀释液瓶内装有样本稀释液；结合垫处理液包括抗人IgG抗体荧光微球、血小板、海藻糖水溶液、稳定剂、PVP‑K30水溶液等，且稳定剂由柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得；上述方案，成本低，所得试剂盒能够定量检测血小板抗体，操作简易，灵敏度高，有效地缩短检测时间，能够更好地满足临床应用。

Description

定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，更具体地说，它涉及定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
血小板抗体检测具有积极的临床意义：第一、血小板抗体检测可以帮助医生衡量病人输入血小板后的效果，在为病人输入血小板之前，先进行血小板抗体检测，如果病人体内有血小板抗体，那么病人输入血小板的效果可能会比较差，因为有部分病人在反复输入血小板或者反复输血之后，人体对外界的血小板产生排斥，此时患者输入血小板的效果往往比医生预估的效果要差；第二、血小板抗体检测可以帮助诊断免疫性血小板减少症，如果患者体内有血小板抗体，病人就有患免疫性血小板减少症的可能性；第三、血小板抗体检测可以帮助医生进一步评估引起患者血小板减少的原因，患者的血小板抗体检测若呈阳性，说明血小板减少的原因是免疫介导的血小板破坏；若呈阴性，说明患者骨髓的聚合细胞存在产生血小板障碍，因此，血小板抗体检测技术至关重要。
目前血小板抗体检测的主要方法是固相凝集法，只能实现定性或者半定量检测血清中的血小板抗体，且需要用到一株血小板特异性抗体以及致敏红细胞，成本高，且保存期限短、稳定性差，导致检测效果差。因此，亟需提出定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，能够更好地满足临床的应用。
发明内容
为了解决现有的血小板抗体检测的检测效果差的问题，本申请提供了定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
第一方面，本申请提供了定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，采用如下的技术方案：
定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，包括检测卡和样本稀释液瓶；所述检测卡由胶板上依次粘结有硝酸纤维膜、吸水垫和结合垫而得；所述样本稀释液瓶内装有样本稀释液；所述结合垫由玻璃纤维膜上喷涂结合垫处理液而得；所述结合垫处理液包括抗人IgG抗体荧光微球和血小板；所述玻璃纤维膜经等离子体预处理。
通过采用上述技术方案，本申请的血小板抗体检测试剂盒，包括检测卡和样本稀释液瓶，检测卡由胶板上依次粘结有硝酸纤维膜、吸水垫和结合垫而得，结合垫上包括抗人IgG抗体荧光微球和血小板，且玻璃纤维膜经等离子体预处理，有利于玻璃纤维膜与结合垫处理液紧密结合。本申请的血小板抗体检测试剂盒采用荧光免疫层析原理，如果待测样本中包括血小板抗体，就会形成抗人IgG抗体荧光微球-血小板-血小板抗体的免疫复合凝聚物，从而在硝酸纤维膜与玻璃纤维膜的边缘被截留；如果待测样本中不含血小板抗体，则无法形成凝聚物，所有组分会通过玻璃纤维膜，在硝酸纤维膜上层析流动，无法在硝酸纤维膜与玻璃纤维膜的边缘被截留，且免疫复合凝聚物的量与待测样本中抗血小板抗体的量呈正比；因此，本申请的试剂盒可以定量检测待测样本中血小板抗体的浓度，操作简易，灵敏度高，可以有效地缩短检测时间，更好地为临床服务。
优选的，所述抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、400-600μLMES缓冲液、150-250μL纯水、80-110μL活化剂、800-1000μL HEPES水溶液、0.48-0.52mg抗人IgG抗体、150-250μL Tris-HCl缓冲液、8-12μL BSA水溶液。
优选的，所述MES缓冲液为0.1M pH5.6；所述HEPES水溶液为0.05M pH8.0；所述Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；所述BSA水溶液的质量分数为10％。
优选的，所述活化剂由EDC、NHS与水按质量比为4.5-5.5:4-6:1进行混合而得。
优选的，所述荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球。
优选的，所述抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散1-5min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速100-200r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化15-25min；随后在8-12℃以下11000-15000rpm离心10-20min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散1-5min后；在转速100-200r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌8-12h，完成标记；随后在10℃以下10000-15000rpm离心13-17min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散5-10min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于2-8℃待用。
通过采用上述技术方案，本申请先将羧基荧光微球表面的基团进行活化，再加入抗人IgG抗体，抗人IgG抗体的氨基能够与活化荧光微球表面的羧基进行结合，附着在活化荧光微球的表面，最后采用惰性蛋白BSA水溶液对荧光微球的表面空位进行封闭；并在制备过程中控制各工艺参数，能够有效增强荧光微球与抗人IgG抗体之间的结合，获得抗人IgG抗体荧光微球具有较高的检测灵敏度。
优选的，所述结合垫，由以下方法制得：
S21、向25-35mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶30-60min，得复溶血小板；
S22、取90-110μL复溶血小板，加入100-150μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、90-110μL20wt％海藻糖水溶液、90-110μL 10wt％PVP-K30水溶液、15-25μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以4.5-5.5μL/cm的浓度喷涂于玻璃纤维膜上，42-48℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用。
通过采用上述技术方案，本申请的结合垫是将结合垫处理液喷涂于玻璃纤维膜上而制得，且将血小板、海藻糖水溶液、PVP-K30水溶液、抗人IgG抗体荧光微球混合均匀，获得结合垫处理液；并控制原料的添加量，使得血小板与抗人IgG抗体荧光微球紧密结合，获得性能稳定的结合垫。
优选的，所述结合垫处理液中还添加了稳定剂；所述稳定剂的体积为海藻糖水溶液的0.7-1.2倍。
优选的，所述稳定剂由质量比为3:1-5:7-9:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
通过采用上述技术方案，本申请的结合垫处理液中还添加了稳定剂，且稳定剂由柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得，柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖三者协同，辅助海藻糖，不仅有利于提高血小板的稳定性，而且能够加强血小板和抗人IgG抗体荧光微球的结合，使得均匀稳定的结合垫处理液，均匀地覆盖在玻璃纤维膜的表面，有助于提高检测的准确性。
优选的，所述样本稀释液由95-100mL pH7.4 1xPBS溶液、180-200μL吐温-20、60-100μL槐糖脂与80-100μL防腐剂混合而得。
优选的，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸甲酯、庆大霉素中的至少一种。
通过采用上述技术方案，本申请的样本稀释液包括PBS溶液、吐温-20、槐糖脂与防腐剂混合而得，吐温-20与槐糖脂能够协同增效，使得样本能够分散均匀，且防腐剂能够抗菌，有效保证样本稀释液性能的稳定性，能够长期储存。
第二方面，本申请提供定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，采用如下技术方案：
定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、先取胶板依次粘贴硝酸纤维膜、吸水垫和所述结合垫，组成大板；再将大板放于高速斩切机上，切成4mm宽的小条；最后将小条与卡壳底盖进行组装，得检测卡；
S2、将样本稀释液分装在10mL滴瓶中，每瓶6mL，得样本稀释液瓶；
S3、将步骤S1所得检测卡与步骤S2所得样本稀释液瓶进行封装组合，得血小板抗体检测试剂盒。
通过采用上述技术方案，本申请的血小板抗体检测试剂盒的制备方法，步骤简单，成本低，所得试剂盒检测样本中血小板抗体的含量具有良好的专属性、灵敏度、线性与范围、精密度、准确度和耐用性，且本申请的试剂盒轻量化且便于携带，易于保存。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，包括检测卡和样本稀释液瓶；检测卡由胶板上依次粘结有硝酸纤维膜、吸水垫和结合垫而得；结合垫由经等离子体预处理的玻璃纤维膜上喷涂结合垫处理液而得；样本稀释液瓶内装有样本稀释液；结合垫处理液包括抗人IgG抗体荧光微球和血小板，所得试剂盒的灵敏度、精密度、准确度都较高，且稳定性好，可以长期储存，能在医学领域得到广泛应用。
2、本申请的血小板抗体检测试剂盒的操作步骤简单，只需将样品加到检测卡的加样孔中即可检测，检测速度快，结果可以定量测定，大大降低检测成本，减少工作量。
附图说明
图1显示了本申请的试剂盒的线性验证实验结果。
具体实施方式
以下结合制备例和实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1-5提供了抗人IgG抗体荧光微球及其制备方法。
制备例1
抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、400μL MES缓冲液、150μL纯水、80μL活化剂、800μL HEPES水溶液、0.48mg抗人IgG抗体、150μL Tris-HCl缓冲液、8μLBSA水溶液。
其中，荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球；MES缓冲液为0.1M pH5.6；HEPES水溶液为0.05M pH8.0；Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；BSA水溶液的质量分数为10％；活化剂由EDC、NHS与水按质量比为4.5:4:1进行混合而得。
抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散1min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速100r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化15min；随后在8℃以下11000rpm离心10min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散1min后；在转速100r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌8h，完成标记；随后在10℃以下10000rpm离心13min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散5min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于2℃待用。
制备例2
抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、450μL MES缓冲液、180μL纯水、90μL活化剂、850μL HEPES水溶液、0.48mg抗人IgG抗体、180μL Tris-HCl缓冲液、9μLBSA水溶液。
其中，荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球；MES缓冲液为0.1M pH5.6；HEPES水溶液为0.05M pH8.0；Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；BSA水溶液的质量分数为10％；活化剂由EDC、NHS与水按质量比为4.8:4.5:1进行混合而得。
抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散2min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速120r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化18min；随后在9℃以下12000rpm离心12min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散2min后；在转速100-200r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌9h，完成标记；随后在10℃以下11000rpm离心14min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散6min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于4℃待用。
制备例3
抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、500μL MES缓冲液、200μL纯水、100μL活化剂、900μL HEPES水溶液、0.5mg抗人IgG抗体、200μL Tris-HCl缓冲液、10μLBSA水溶液。
其中，荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球；MES缓冲液为0.1M pH5.6；HEPES水溶液为0.05M pH8.0；Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；BSA水溶液的质量分数为10％；活化剂由EDC、NHS与水按质量比为5:5:1进行混合而得。
抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散2min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速150r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化20min；随后在10℃以下12000rpm离心15min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散2min后；在转速150r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌10h，完成标记；随后在10℃以下12000rpm离心15min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散2min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于6℃待用。
制备例4
抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、550μL MES缓冲液、230μL纯水、105μL活化剂、950μL HEPES水溶液、0.51mg抗人IgG抗体、220μL Tris-HCl缓冲液、11μL BSA水溶液。
其中，荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球；MES缓冲液为0.1M pH5.6；HEPES水溶液为0.05M pH8.0；Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；BSA水溶液的质量分数为10％；活化剂由EDC、NHS与水按质量比为5.2:5.5:1进行混合而得。
抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散4min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速180r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化22min；随后在11℃以下14000rpm离心18min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散4min后；在转速180r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌11h，完成标记；随后在10℃以下14000rpm离心16min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散9min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于7℃待用。
制备例5
抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、600μL MES缓冲液、250μL纯水、110μL活化剂、1000μL HEPES水溶液、0.52mg抗人IgG抗体、250μL Tris-HCl缓冲液、12μL BSA水溶液。
其中，荧光微球为粒径200nm的羧基荧光微球；MES缓冲液为0.1M pH5.6；HEPES水溶液为0.05M pH8.0；Tris-HCl缓冲液为0.05M pH8.0；BSA水溶液的质量分数为10％；活化剂由EDC、NHS与水按质量比为5.5:6:1进行混合而得。
抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散5min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速200r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化25min；随后在12℃以下15000rpm离心20min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散5min后；在转速200r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌12h，完成标记；随后在10℃以下15000rpm离心17min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于Tris-HCl缓冲液中，超声分散10min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于8℃待用。
制备例6-10以及对比制备例1-6提供了结合垫的制备方法。
制备例6
结合垫，由以下方法制得：
S20、采用等离子体处理玻璃纤维膜，等离子体为氧气，功率为100W，处理时间为240s，得预处理的玻璃纤维膜；
S21、向25mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶30min，得复溶血小板；
S22、取90μL复溶血小板，加入100μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、90μL 20wt％海藻糖水溶液、90μL 10wt％PVP-K30水溶液、63μL稳定剂、15μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以4.5μL/cm的浓度喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，42℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用；
其中，抗人IgG抗体荧光微球由制备例1制得；稳定剂由质量比为3:1:7:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
制备例7
结合垫，由以下方法制得：
S20、采用等离子体处理玻璃纤维膜，等离子体为氧气，功率为110W，处理时间为200s，得预处理的玻璃纤维膜；
S21、向28mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶35min，得复溶血小板；
S22、取95μL复溶血小板，加入110μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、95μL 20wt％海藻糖水溶液、95μL 10wt％PVP-K30水溶液、76μL稳定剂、18μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以4.8μL/cm的浓度喷涂于预处理的玻璃纤维膜，44℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用；
其中，抗人IgG抗体荧光微球由制备例2制得；稳定剂由质量比为3:2:7.5:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
制备例8
结合垫，由以下方法制得：
S20、采用等离子体处理玻璃纤维膜，等离子体为氧气，功率为120W，处理时间为180s，得预处理的玻璃纤维膜；
S21、向30mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶40min，得复溶血小板；
S22、取100μL复溶血小板，加入125μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、100μL20wt％海藻糖水溶液、100μL 10wt％PVP-K30水溶液、100μL稳定剂、20μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以5μL/cm的浓度喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，45℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用；
其中，抗人IgG抗体荧光微球由制备例3制得；稳定剂由质量比为3:3:8:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
制备例9
结合垫，由以下方法制得：
S20、采用等离子体处理玻璃纤维膜，等离子体为氧气，功率为130W，处理时间为150s，得预处理的玻璃纤维膜；
S21、向32mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶45min，得复溶血小板；
S22、取105μL复溶血小板，加入140μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、105μL20wt％海藻糖水溶液、105μL 10wt％PVP-K30水溶液、115.5μL稳定剂、22μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以5.2μL/cm的浓度喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，47℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用；
其中，抗人IgG抗体荧光微球由制备例4制得；稳定剂由质量比为3:4:8.5:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
制备例10
结合垫，由以下方法制得：
S20、采用等离子体处理玻璃纤维膜，等离子体为氧气，功率为140W，处理时间为120s，得预处理的玻璃纤维膜；
S21、向35mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶50min，得复溶血小板；
S22、取110μL复溶血小板，加入150μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、110μL20wt％海藻糖水溶液、110μL 10wt％PVP-K30水溶液、132μL稳定剂、25μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以5.5μL/cm的浓度喷涂于预处理的玻璃纤维膜上，48℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用。
其中，抗人IgG抗体荧光微球由制备例5制得；稳定剂由质量比为3:5:9:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
对比制备例1
对比制备例1，同制备例6，不同之处仅在于：不添加海藻糖水溶液。
对比制备例2
对比制备例2，同制备例6，不同之处仅在于：不添加稳定剂。
对比制备例3
对比制备例3，同制备例6，不同之处仅在于：稳定剂由质量比为1:7:100的硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
对比制备例4
对比制备例4，同制备例6，不同之处仅在于：稳定剂由质量比为3:7:100的柠檬酸钠、壳聚糖和水混合而得。
对比制备例5
对比制备例5，同制备例6，不同之处仅在于：稳定剂由质量比为3:1:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖和水混合而得。
对比制备例6
对比制备例6，同制备例6，不同之处仅在于：玻璃纤维膜不进行预处理。
制备例11-15以及对比制备例7、8提供了样本稀释液的制备方法。
制备例11
样本稀释液由95mL pH7.4 1xPBS溶液、180μL吐温-20、60μL槐糖脂与80μL防腐剂混合而得；
其中，1xPBS溶液由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠与0.24g磷酸二氢钾混合而得；防腐剂为叠氮钠。
制备例12
样本稀释液由96mL pH7.4 1xPBS溶液、185μL吐温-20、70μL槐糖脂与85μL防腐剂混合而得；
其中，1xPBS溶液由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠与0.24g磷酸二氢钾混合而得；防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯。
制备例13
样本稀释液由98mL pH7.4 1xPBS溶液、190μL吐温-20、80μL槐糖脂与90μL防腐剂混合而得；
其中，1xPBS溶液由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠与0.24g磷酸二氢钾混合而得；防腐剂为庆大霉素。
制备例14
样本稀释液由99mL pH7.4 1xPBS溶液、180-200μL吐温-20、60-100μL槐糖脂与95μL防腐剂混合而得；
其中，1xPBS溶液由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠与0.24g磷酸二氢钾混合而得；防腐剂由质量比为1:1的叠氮钠与对羟基苯甲酸甲酯混合而得。
制备例15
样本稀释液由100mL pH7.4 1xPBS溶液、200μL吐温-20、100μL槐糖脂与100μL防腐剂混合而得；
其中，1xPBS溶液由8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠与0.24g磷酸二氢钾混合而得；防腐剂由质量比为1:1:1的叠氮钠、对羟基苯甲酸甲酯和庆大霉素混合而得。
对比制备例7
对比制备例7，同制备例11，不同之处仅在于：不添加吐温-20。
对比制备例8
对比制备例8，同制备例11，不同之处仅在于：不添加槐糖脂。
实施例1-5提供了定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法。
实施例1
定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、先取胶板依次粘贴硝酸纤维膜、吸水垫和所述结合垫，组成大板；再将大板放于高速斩切机上，切成4mm宽的小条；最后将小条与卡壳底盖进行组装，得检测卡；
S2、将样本稀释液分装在10mL滴瓶中，每瓶6mL，得样本稀释液瓶；
S3、将步骤S1所得检测卡与步骤S2所得样本稀释液瓶进行封装组合，得血小板抗体检测试剂盒；
其中，结合垫由制备例6制得；样本稀释液由制备例11制得。
实施例2
实施例2，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由制备例7制得；样本稀释液由制备例12制得。
实施例3
实施例3，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由制备例8制得；样本稀释液由制备例13制得。
实施例4
实施例4，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由制备例9制得；样本稀释液由制备例14制得。
实施例5
实施例5，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由制备例10制得；样本稀释液由制备例15制得。
为了验证本申请提供的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的性质，申请人设置了对比例1-8，其中：
对比例1
对比例1，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例1制得。
对比例2
对比例2，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例2制得。
对比例3
对比例3，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例3制得。
对比例4
对比例4，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例4制得。
对比例5
对比例5，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例5制得。
对比例6
对比例6，同实施例1，不同之处仅在于：结合垫由对比制备例6制得。
对比例7
对比例7，同实施例1，不同之处仅在于：样本稀释液由对比制备例6制得。
对比例8
对比例8，同实施例1，不同之处仅在于：样本稀释液由对比制备例7制得。
为了检测本申请实施例1-5、对比例1-8中制得的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的性质，进行了如下实验：
(1)相关性：
取出试剂盒(实施例1)中的检测卡，向加样孔中滴加10μL血小板抗体标准品样本，浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL，并等待2min；在检测卡的缓冲液孔中滴加4滴样本稀释液瓶，等待10min；10min后用荧光仪读取荧光峰值，平均测三次，取平均值，检测结果如表1所示。
表1：
血小板抗体/(ng/mL) 荧光强度/RLU
0 2827
50 5015
100 8201
200 14062
400 22193
800 36015
1600 61921
以荧光强度和对应的血小板抗体标准品样本的浓度建立标准曲线，如图1所示，线性函数关系为y＝36.612X+4986.6，R2值>0.99，说明本申请的试剂盒在0-1600ng/mL范围内线性良好。
(2)精密度采用实施例1-5、对比例1-8所得试剂盒，分别对100ng/mL和1000ng/mL血小板抗体标准品样本，各重复测定10次，分别计算两个水平测定值的均值(M)和标准差(SD)；按公式CV＝SD/M×100％，CV—变异系数；SD—10次测定结果的标准差；M—10次测定结果的平均值；计算变异系数(CV)，结果如表2所示。
(3)准确度
采用同一批的实施例1-5、对比例1-8所得试剂盒，分别对100ng/mL和1000ng/mL血小板抗体标准品样本，各重复测定3次，测定结果记为(X)，按公式B＝(Xi-T)/T×100％；式中：B—相对偏差；Xi—测定值；T—样本浓度；计算出相对偏差B，结果如表2所示。
(4)最低检出限
用零浓度校准品作为样本，重复测定20次，计算20次测定结果的T/C相对发光单位(Relative L免疫球蛋白ht Unit,RLU)的平均值(M)和标准差(SD)，按公式RLU＝M+2SD，计算得到最低检测限的RLU值，结果如表2所示。
表2：
由上述表2显示数据可知：实施例1-5所得定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的测试结果优于对比例1-8；充分说明本申请的血小板抗体检测试剂盒不仅能够定量检测血小板抗体的含量，而且检测的精密度和准确度都较高，检测范围广。
由实施例1以及对比例1、2可知：实施例1中的结合垫处理液中包括海藻糖水溶液和稳定剂，较对比例1、2，实施例1所得血小板抗体检测试剂盒的检测效果更加优异。
由实施例1以及对比例3-5可知：实施例1中的结合垫处理液中稳定剂由柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得，较对比例3-5，实施例1所得血小板抗体检测试剂盒的精密度和准确度更高。
由实施例1以及对比例6可知：实施例1中的玻璃纤维膜经等离子体处理，较对比例6，实施例1所得试剂盒能够更好地进行血小板抗体定量检测。
由实施例1以及对比例7、8可知：实施例1中的样本稀释液由制备例11制得，制备例11的样本稀释液中包括吐温-20与槐糖脂，较对比例7、8，实施例1所得定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的检测性能得到了极大提升。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡和样本稀释液瓶；所述检测卡由胶板上依次粘结有硝酸纤维膜、吸水垫和结合垫而得；所述样本稀释液瓶内装有样本稀释液；
所述结合垫由玻璃纤维膜上喷涂结合垫处理液而得；所述结合垫处理液包括抗人IgG抗体荧光微球和血小板；所述玻璃纤维膜经等离子体预处理。
2.根据权利要求1所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体荧光微球，包括以下原料：100μL荧光微球、400-600μL MES缓冲液、150-250μL纯水、80-110μL活化剂、800-1000μL HEPES水溶液、0.48-0.52mg抗人IgG抗体、150-250μLTris-HCl缓冲液、8-12μL BSA水溶液。
3.根据权利要求2所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述活化剂由EDC、NHS与水按质量比为4.5-5.5:4-6:1进行混合而得。
4.根据权利要求3所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体荧光微球，由以下方法制得：
S11、取荧光微球，加入MES缓冲液中，再加入纯水，混匀，超声分散1-5min，得荧光微球悬浊液；
S12、在转速100-200r/min下，向荧光微球悬浊液中滴加活化剂，并保持相同转速，在室温下活化15-25min；随后在8-12℃以下11000-15000rpm离心10-20min，得活化荧光微球；
S13、将活化荧光微球加入HEPES水溶液中，超声分散1-5min后；在转速100-200r/min下滴加抗人IgG抗体，保持相同转速，搅拌8-12h，完成标记；随后在10℃以下10000-15000rpm离心13-17min，得抗人IgG抗体荧光微球；
S14、将抗人IgG抗体荧光微球分散于 Tris-HCl缓冲液中，超声分散5-10min后；加入BSA水溶液封闭2h后，置于2-8℃待用。
5.根据权利要求1所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫，由以下方法制得：
S21、向25-35mg血小板冻干品中加入1mL纯水复溶30-60min，得复溶血小板；
S22、取90-110μL复溶血小板，加入100-150μL 0.4M pH8.0 Tris-HCl缓冲液、90-110μL20wt%海藻糖水溶液、90-110μL 10wt% PVP-K30水溶液、15-25μL抗人IgG抗体荧光微球，并补充纯水至950μL，混合均匀，得结合垫处理液；
S23、将结合垫处理液以4.5-5.5μL/cm的浓度喷涂于玻璃纤维膜上，42-48℃烘干2h，放置于带有干燥剂的铝箔袋中，待用。
6.根据权利要求5所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述结合垫处理液中还添加了稳定剂；所述稳定剂的体积为海藻糖水溶液的0.7-1.2倍。
7.根据权利要求5所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂由质量比为3:1-5:7-9:100的柠檬酸钠、硫酸葡聚糖、壳聚糖和水混合而得。
8.根据权利要求1所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液由95-100mL pH7.4 1xPBS溶液、180-200μL吐温-20、60-100μL槐糖脂与80-100μL防腐剂混合而得。
9.根据权利要求8所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸甲酯、庆大霉素中的至少一种。
10.一种权利要求1-9任一项所述的定量血小板抗体荧光免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、先取胶板依次粘贴硝酸纤维膜、吸水垫和所述结合垫，组成大板；再将大板放于高速斩切机上，切成4mm宽的小条；最后将小条与卡壳底盖进行组装，得检测卡；
S2、将样本稀释液分装在10mL滴瓶中，每瓶6mL，得样本稀释液瓶；
S3、将步骤S1所得检测卡与步骤S2所得样本稀释液瓶进行封装组合，得血小板抗体检测试剂盒。
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