CN118150821A - 一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条及其制备方法和应用。所述的试剂条包括金标垫、样本垫和层析膜，所述的样本垫经样本垫处理液处理；所述的金标垫经金标垫处理液处理。本发明制备的试剂条结合提供的乳铁蛋白抗体，在干眼病的检测中具有特异性强、准确度高，能够有效消除炎症带来的干扰。为干眼病快速准确的检测提供技术支持，避免误诊或漏诊，具有很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条及其制备方法和应用。
背景技术
乳铁蛋白是一个分子量为80 kDa的铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族。乳铁蛋白与铁离子的亲和力很高，是转铁蛋白的250-300倍。根据乳铁蛋白结合铁离子的差异，可以将其分为3种类型：缺铁型、铁半饱和型和铁饱和型。乳铁蛋白在初乳和牛奶中含量高，在眼泪、唾液、精液、鼻和支气管分泌物、胆汁和胃肠液等粘膜分泌物中的含量较低。此外，嗜中性粒细胞是含乳铁蛋白最多的细胞，当机体受感染时就可以将乳铁蛋白释放出来，夺取致病菌的铁离子致其死亡。乳铁蛋白不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能。泪液乳铁蛋白占全部泪液蛋白的25%，研究显示其在健康受试者的平均浓度为1.42mg/mL。它主要由泪腺分泌，上皮细胞和睑板腺都决定其最终水平。如果泪液中乳铁蛋白含量低于0.9g/L，则可诊断为干眼病。
目前，乳铁蛋白的检测方法包括酶联免疫法、高效毛细管电泳法、生物传感测定法、高效液相色谱法、高效液相-质谱联用法等。酶联免疫法虽然灵敏度高，但通常需要进行多重的孵化、洗涤和清洗，操作较为繁琐，且所用抗体及抗抗体制备不易，价格昂贵，不适合用于大批量的样品分析；高效毛细管电泳法大多数使用石英材质的毛细管为分离通道，用高压直流电场作为驱动达到液相分离的目的，具有操作简单、灵敏度较高等优点，但需要解决毛细管壁对目标物质乳铁蛋白的吸附导致的重复性差的问题，且检测结果受样品复杂基质的影响较大；基于表面等离子体共振技术的生物传感免疫测定法，无需进行标记便可实时，自动检测低含量乳铁蛋白，但实验温度及样品组成影响测定结果，仪器设备造价也较为昂贵；高效液相色谱法，优点是反应灵敏、结果准确可靠、重复性好，但缺点是对样品的纯度要求较高，往往需要经过复杂的前处理过程才能进样；液相质谱法结果灵敏可靠、重复性高、回收率高，但是需要将蛋白质大分子打碎成氨基酸小分子，通过特定的氨基酸片段来进行定性和定量，此时蛋白质已经变形，不利于待测样品中对于乳铁蛋白是否有活性的判断，且设备昂贵，对操作人员的专业性要求更高。
胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，胶体金是一种常见的免疫标记物。根据胶体金法制备乳铁蛋白检测试剂条从而应用于干眼症检测是一个很好的研究方向。
眼睛的分泌物是很复杂的，尤其干眼症还可能伴随炎症刺激，进一步增加眼睛分泌物，分泌物的复杂性进而会导致检测准确性降低。因此，在提高检测效率的同时还需要提高检测的准确性，避免造成误诊或漏诊。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条及其制备方法，该试剂条用于检测干眼症，具有抗干扰性强、准确度高等优点。
一方面，本发明提供了一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1、样本垫的制备：将样本垫浸入样本垫处理液中浸泡，烘干备用；
S2、金标垫的制备：将金标垫先浸入金标垫处理液中浸泡，烘干后，喷涂金标抗体溶液，再次烘干后备用；
S3、层析膜处理：在硝酸纤维素膜包被检测线和质控线；
S4、试剂条组装：按样本垫-金标垫-层析膜-吸水纸的顺序，依次组装；
具体地，S1所述的样本垫处理液的成分为：PBS缓冲液12-18mM，海藻糖5%-10%m/V，葡聚糖3%-5%m/V，酪蛋白3%-5%m/V，酒石酸钠1%-2%m/V，PEG-20000 1%-1.5%m/V，BSA 2%-3%m/V，壳聚糖0.1%-0.2%m/V，甘氨酸0.5%-1%m/V，pH 7.5-8.5。
优选地，在一些实施例中，所述的样本垫处理液的成分为：PBS缓冲液12mM，海藻糖5%m/V，葡聚糖5%m/V，酪蛋白3%m/V，酒石酸钠2%m/V，PEG-20000 1.5%m/V，BSA 2%m/V，壳聚糖0.2%m/V，甘氨酸0.5%/V，pH 7.5；
在另一些实施例中，所述的样本垫处理液的成分为：PBS缓冲液18mM，海藻糖10%m/V，葡聚糖3%m/V，酪蛋白5%m/V，酒石酸钠1%m/V，PEG-20000 1%m/V，BSA 3%m/V，壳聚糖0.1%%m/V，甘氨酸1%m/V，pH 8.5。
具体地，S2所述的金标垫处理液的成分为：Tris-HCl缓冲液15-20mM，海藻糖3%-5%m/V，葡聚糖2%-3%m/V，PEG-600 1.5%-2%m/V，BSA 1.5%-2%m/V，壳聚糖0.5%-1.2%m/V，甘氨酸0.8%-1.5%m/V，pH 6.5-7.5。
优选地，在一些实施例中，所述的金标垫处理液的成分为：Tris-HCl缓冲液20mM，海藻糖3%m/V，葡聚糖2%m/V，PEG-600 1.5%m/V，BSA 2%m/V，壳聚糖1.2%m/V，甘氨酸0.8%m/V，pH 6.5；
在另一些实施例中，所述的金标垫处理液的成分为：Tris-HCl缓冲液15mM，海藻糖5%m/V，葡聚糖3%m/V，PEG-600 2%m/V，BSA 1.5%m/V，壳聚糖0.5%m/V，甘氨酸1.5%m/V，pH7.5。
具体地，所述的样本垫和金标垫的材质可以是玻璃纤维素膜、聚酯膜或无纺布。
优选地，所述的样本垫和金标垫的材质可以是玻璃纤维素膜
具体地，S1所述的浸泡时间可以是12-18min。
优选地，S1所述的浸泡时间可以是15min。
具体地，S2所述的金标垫处理液中浸泡的时间可以是8-12min。
优选地，所述的金标垫处理液中浸泡的时间可以是10min。
具体地，S2所述的金标抗体溶液的制备方法为：
（1）向胶体金溶液中加入K2CO3溶液，混匀后备用；
（2）向（1）中加入乳铁蛋白抗体，搅匀后静置；
（3）向（2）中加入BSA和PEG-20000，搅拌、静置、离心，复溶液复溶后得金标抗体溶液。
进一步具体地，（1）中所述胶体金溶液与K2CO3溶液的体积比可以是100:1；所述的K2CO3溶液浓度可以是0.1-0.2M。
优选地，所述的K2CO3溶液浓度可以是0.1M
进一步具体地，（2）中所述静置的时间可以是40-80min。
优选地，（2）中所述静置的时间可以是60min。
进一步具体地，（3）中所述BSA和PEG-20000的终浓度可以均是0.5%-2%m/V；所述搅拌的时间可以是15-25min；所述静置时间可以是8-15min；所述复溶液可以包括40-50mMNaCl、0.1%-0.2% m/V BSA。
优选地，所述BSA和PEG-20000的终浓度可以均是1%m/V；所述搅拌的时间可以是20min；所述静置时间可以是10min；所述复溶液可以包括50mM NaCl、0.1% m/V BSA。
进一步具体地，（1）中所述的胶体金溶液的制备方法为：向沸腾的HAuCl4溶液中加入柠檬酸钠，继续加热搅拌，待液体变为红色停止加热，降温；所述的胶体金溶液胶体金颗粒粒径为10-20nm。
优选地，所述的HAuCl4溶液的浓度可以是0.01%-0.02%m/V；所述的柠檬酸钠的浓度可以是1%-2%m/V，加入体积可以是2-6mL。
进一步优选的，所述的HAuCl4溶液的浓度可以是0.01%m/V；所述的柠檬酸钠的浓度可以是1%m/V，加入体积可以是4mL。
具体地，S3所述的检测线可以包被乳铁蛋白。
具体地，S3所述的质控线可以包被IgG抗体。
优选地，所述的IgG抗体为羊抗鼠IgG抗体。
又一方面，本发明提供了一种试剂条，所述的试剂条利用前述的制备方法获得。
具体地，所述的试剂条用于眼部分泌物中乳铁蛋白检测。
具体地，所述的干眼症包括水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼或混合型干眼。
进一步具体地，所述的混合型干眼为水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼中的两种或两种以上病因导致的干眼。
又一方面，本发明提供了前述的试剂条在制备检测干眼症试剂盒中的应用。
具体地，所述的试剂盒用于眼部分泌物中乳铁蛋白检测。
具体地，所述的干眼症包括水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼或混合型干眼。
进一步具体地，所述的混合型干眼为水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼中的两种或两种以上病因导致的干眼。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括前述的试剂条。
具体地还包括样品采集液或样品保存试剂。
进一步具体地，所述的样品采集液或样品保存试剂包括但不限于：生理盐水。
具体地，所述的试剂盒用于眼部分泌物中乳铁蛋白检测。
具体地，所述的干眼症包括水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼或混合型干眼。
进一步具体地，所述的混合型干眼为水样液缺乏型干眼、黏蛋白缺乏型干眼、脂质缺乏型干眼、泪液动力学异常所致干眼中的两种或两种以上病因导致的干眼。
本发明所取得的技术效果：
（1）特异性强。
（2）准度高，对患者以及健康者的诊断准确率均能达到97%以上。
（3）抗干扰能力强，检测结果不受炎症的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的检测原理：本发明的试剂条基于竞争法进行检测，样品溶液加入样本垫（加样孔）后，待测溶液通过层析作用带动待测物及金标垫中的金标抗体一起沿纤维素膜向前流动。在移动过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合位点，阻止金标抗体与纤维素膜上检测线处的乳铁蛋白（抗原）结合，使检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品中乳铁蛋白的含量达到一定浓度；如果样品中没有待测样品或含量很低时，金标抗体在前移过程中，与检测线处的乳铁蛋白结合形成一条清晰红线即表示检测样品中乳铁蛋白的含量未达到一定浓度。当金标抗体移至检测卡质控线（C线）被质控抗体捕获，在C线上出现一条红线。质控线颜色的有或无分别表示此检测卡的有效或无效。
本发明主要试剂来源见表1：
表1
实施例1
1.1试剂条的制备
胶体金溶液：0.01%m/V HAuCl4水溶液加热至沸腾后，加入1%m/V柠檬酸钠4mL，继续加热搅拌10min，待液体变为红色停止加热并搅拌降温。制备得到的胶体金溶液中金颗粒直径约为15nm。
金标抗体溶液：用取10 mL胶体金溶液，加入100μL 0.1M的K2CO3溶液，混匀后备用。缓慢加入终浓度为20μg/mL的乳铁蛋白抗体（博康生物，7C5），搅拌均匀后静置1h。加入终浓度为1%m/V的BSA和终浓度为1%的PEG-20000，缓慢搅拌20min，静置10min。静置完成后，4℃10000 r/min离心20 min，取沉淀按1mg/mL终浓度使用复溶液（50mM NaCl+0.1%m/V BSA）重悬得金标抗体溶液。
金标垫处理：玻璃纤维素膜先浸入金标垫处理液10min，40℃烘干后，将金标抗体溶液喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，40℃烘干备用。
层析膜处理：在硝酸纤维素膜（NC膜上）包被检测线和质控线，其中检测线包被乳铁蛋白（博康生物，货号BLF302），质控线包被抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体（博康生物，货号BGQ108）。
样本垫处理：玻璃纤维素膜浸入样本垫处理液15min，40℃烘干备用。
试剂条组装：按样本垫-金标垫-层析膜-吸水纸的顺序，依次组装在底板上，即可。
金标垫处理液的成分见表2：
表2
样本垫处理液的成分见表3：
表3
1.2检测及结果判定
检测用样品液滴加2-3滴至试剂条样本垫，水平静置15min查看结果。结果判定：检测线和质控线均显示红色，样本判断阳性；检测线不显示红色而质控线显示红色，样本判断阴性；检测线和质控线均不显示红色，无效，需要重新检测。
1.3特异性检测
生理盐水稀释不同的抗原（乳铁蛋白、溶菌酶、IgA、纤维连接蛋白、EGF、ECP、HA、补体C3），稀释浓度均为2mg/mL，采用实施例1的试剂盒进行检测。
结果：实施例1中，仅乳铁蛋白为阴性，其他均为阳性。
1.4准确率检测
1.4.1样本采集
采集102例干眼症患者眼部分泌物样本和115例健康人群眼部分泌物样本，干眼症的诊断标准参照SchirmerⅠ试验：将试纸置入被测者眼下结膜囊的中外1/3交界处，瞩患者向下看或轻轻闭眼，5分钟后取出滤纸，测量湿长。不进行表面麻醉情况下，湿长≥10mm为正常，湿长＜10mm诊断为干眼症；进行表面麻醉条件下，湿长判定点值调整为5mm。本实验中采用的样本来源均为不进行表面麻醉诊断为干眼症的样本。
检测的样本类型为人眼表冲洗液。样本采集方法：
眼表冲洗液样本在4-30℃下常温保存，8小时内完成检测，超过8小时需要重新采集样本。
被检者保持脸部与水平方向平行体位，向被检者眼中滴入生理盐水；用手指拉开下眼睑，暴露出下眼睑穹窿部，提醒患者眼球向上眼睑方向转动，将100μL生理盐水缓慢滴入下眼睑穹窿部。注意滴入生理盐水后，为了避免滴眼液外溢或沿鼻泪管排出，应将下眼睑稍微向外提起，按压眼内角鼻泪管处。嘱咐被检者转动眼球，使生理盐水充分混合眼表液，5秒后头部向颞侧倾斜，同时用EP管紧贴被检者外眦处收集自然流出的液体。
测试前注意事项：被检者的眼部切勿有外伤；被检者采样前1小时不能使用滴眼液；采集前被检者应保持舒适体位：坐位后仰头部（头部有支撑）或被检者处于仰卧位。
1.4.2样本检测及结果
采用实施例1的试剂盒对102例干眼症患者的眼表冲洗液样本和115例健康人群的眼表冲洗液样本进行检测，并统计诊断准确率，患者诊断准确指检测结果为阳性（乳铁蛋白含量低于0.9g/L），健康人诊断准确指检测结果为阴性（乳铁蛋白含量高于0.9g/L）。准确率计算公式：诊断准确人数/总人数×100%。诊断结果见表4：
表4
以上结果表明，本发明实施例1的试剂盒对患者以及健康者的诊断准确率均能达到99%及以上。
实施例2
金标垫处理液的成分见表5：
表5
样本垫处理液的成分见表6：
表6
采用实施例2的试剂盒参照实施例1中1.3和1.4的实验方法进行特异性检测以及对上述102例干眼症患者的眼表冲洗液样本和115例健康人群的眼表冲洗液样本进行检测。
特异性结果：实施例2中，仅乳铁蛋白为阴性，其他均为阳性。
准确率检测结果见表7：
表7
以上结果表明，本发明实施例2的试剂盒对患者以及健康者的诊断准确率能达到97%以上。
对比例
参照实施例1的试剂条的制备以及检测方法设置对比例，对比例的设置见表8：
表8
采用对比例1-9的试剂盒对实施例1中的102例干眼症患者的眼表冲洗液样本和115例健康人群的眼表冲洗液样本进行检测，并统计诊断准确率。诊断结果见表9：
表9
由对比例1-6、9可知，患者的诊断准确率最高只有87.3%，健康人的诊断准确率确最高只有77.4%，说明了样本垫处理液成分以及含量的改变均能影响眼表冲洗液样本中的乳铁蛋白与乳铁蛋白抗体的结合，使得患者的诊断准确率高，而健康人的诊断准确率明显降低，进而对健康人群造成误诊。对比例7-8可知，患者的诊断准确率最高只有70.6，而健康人的诊断准确率均为90%以上。
对比例1-9对患者诊断结果不准确的原因可能在于：干眼症对应的特征包括乳铁蛋白分泌减少，其所对应的乳铁蛋白为生理性乳铁蛋白，生理性乳铁蛋白正常人体也可分泌。但是干眼症往往伴随炎症，炎症会导致中性粒细胞增加，中性粒细胞可能分泌与生理性分泌不同的乳铁蛋白，而影响检测结果，也就是说干眼症患者生理性乳铁蛋白分泌减少，但实际上炎症分泌的病理性乳铁蛋白可能会对生理性乳铁蛋白的诊断结果产生影响。而本发明实施例所使用的样本垫处理液以及抗体在检测中能有效消除其他因素带来的干扰，提高检测的准确性。
抗干扰验证例
为了进一步验证本发明实施例试剂盒的检测性能以及上述原因的猜想，采用实施例1的试剂盒以及对比例1-9的试剂盒对另外一批88例确认干眼症但无炎症患者（干眼症的诊断标准参照SchirmerⅠ试验；并对眼内液进行细菌培养确认无感染）以及90例确认干眼症且有炎症的患者（干眼症的诊断标准参照SchirmerⅠ试验；并对眼内液进行细菌培养确认存在感染）的眼表冲洗液样本进行检测。检测结果见表10：
表10
由以上结果可知，本发明实施例的试剂盒能有效准确地对干眼症进行检测，并能够有效消除炎症带来的干扰。对比例1-9的试剂盒会受到炎症带来的影响，降低检测的准确性，但与实施例1的结果比较说明，炎症是干扰检测的主要原因，并非唯一原因。结果也进一步说明了眼部分泌物是非常复杂的，会影响检测的准确度。综上，本发明的试剂盒对干眼症的检测性能更优。
Claims (10)
1.一种基于胶体金法检测眼部分泌物中乳铁蛋白的试剂条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样本垫的制备：将样本垫浸入样本垫处理液中浸泡，烘干备用；
S2、金标垫的制备：将金标垫先浸入金标垫处理液中浸泡，烘干后，喷涂金标抗体溶液，再次烘干后备用；
S3、层析膜处理：在硝酸纤维素膜包被检测线和质控线；
S4、试剂条组装：按样本垫-金标垫-层析膜-吸水纸的顺序，依次组装；
步骤S1所述的样本垫处理液的成分为：PBS缓冲液12-18mM，海藻糖5%-10%m/V，葡聚糖3%-5%m/V，酪蛋白3%-5%m/V，酒石酸钠1%-2%m/V，PEG-20000 1%-1.5%m/V，BSA 2%-3%m/V，壳聚糖0.1%-0.2%m/V，甘氨酸0.5%-1%m/V，pH 7.5-8.5；
步骤S2所述的金标垫处理液的成分为：Tris-HCl缓冲液15-20mM，海藻糖3%-5%m/V，葡聚糖2%-3%m/V，PEG-600 1.5%-2%m/V，BSA 1.5%-2%m/V，壳聚糖0.5%-1.2%m/V，甘氨酸0.8%-1.5%m/V，pH 6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的样本垫处理液中浸泡的时间为12-18min；步骤S2所述的金标垫处理液中浸泡的时间为8-12min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2所述的金标抗体溶液的制备方法为：
（1）向胶体金溶液中加入K2CO3溶液，混匀后备用；
（2）向（1）中加入乳铁蛋白抗体，搅匀后静置；
（3）向（2）中加入BSA和PEG-20000，搅拌、静置、离心，复溶液复溶后得金标抗体溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，（1）中所述胶体金溶液与K2CO3溶液的体积比为100:1，所述的K2CO3溶液浓度为0.1-0.2M；（2）中所述静置的时间为40-80min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，（3）中所述BSA和PEG-20000的终浓度均为0.5%-2%m/V；所述搅拌的时间为15-25min；所述静置时间为8-15min；所述复溶液包括40-50mM NaCl、0.1%-0.2% m/V BSA。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，（1）中所述的胶体金溶液的制备方法为：向沸腾的HAuCl4溶液中加入柠檬酸钠，继续加热搅拌，待液体变为红色停止加热，降温；所述的胶体金溶液胶体金颗粒粒径为10-20nm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述的检测线包被乳铁蛋白；所述的质控线包被IgG抗体。
8.一种试剂条，其特征在于，所述的试剂条利用权利要求1-7任一项所述的制备方法获得。
9.权利要求8所述的试剂条在制备检测干眼症试剂盒中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求8所述的试剂条。
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