CN108896760A - 一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种隐球菌检测卡，包括胶板，在胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，层析膜和胶板之间设有第二吸水垫，层析膜上设有检测区和质控区，金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。采用本发明的检测卡或检测盒能快速灵敏的检测隐球菌荚膜多糖抗原的存在，明确检测对象是否被隐球菌感染；本发明的检测卡或检测盒灵敏度高，特异性强，检测速度快，5分钟内即可得出检测结果，操作十分简单。

Description

一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及隐球菌检测技术领域，尤其是一种隐球菌的检测卡、检测盒及其制备方法。

背景技术

隐球菌广泛分布于自然界环境中，鸽粪是其主要传染源，新型和哥特型隐球菌能引起人类隐球菌病。隐球菌可以感染人体任何组织和脏器，依照临床表现可分为肺隐球菌病、中枢神经系统隐球菌病、皮肤黏膜隐球菌病、骨隐球菌病及内脏隐球菌病五型。隐球菌感染预后差，中枢神经系统隐球菌病致死率高。

正常人群的隐球菌感染可能表现为无症状。当机体免疫力低下或受抑制时，病原菌可直接侵入并引起血行传播，故长期使用免疫抑制剂或糖皮质激素的患者、艾滋病、白血病等病人易患本病。据统计，正常人群中隐球菌的感染率约为十万分之一；在免疫抑制患者中，隐球菌感染的发病率约为5-10％；AIDS患者中，感染率可以高达30％。由于世界范围HIV的泛滥，以及皮质激素、侵入性治疗、器官移植、免疫抑制治疗，大剂量使用激素治疗者增多，隐球菌感染的发病率急剧增高。

2006年，全世界约957,900例与HIV有关CM病例和624,725例死亡病例，平均死亡率高达6.5％。HIV有关CM病例主要发生于撒哈拉以南非洲地区，南亚和东南亚地区和拉丁美洲，这三个地区死亡率高达55-70％。

隐球菌病临床症状本身缺乏特异性，且起病多有隐匿型，及时准确的诊断一直是临床上的难题。目前，隐球菌临床诊断方法主要有影像学、病原学和血清学诊断。影像学检查能清楚的显示病变部位情况，但以墨汁染色涂片法和沙氏培养基培养法为主的病原学诊断，灵敏度低，墨汁法阳性检出率约为55％，且培养法耗时长，不利于早期快速诊断；另外，血液中真菌负荷低，核酸法不适用。隐球菌病患者免疫常受抑制，血清中可测到的抗体不多，诊断抗体阳性率不高，特异性不强，因此，多采用免疫抗原诊断。通常诊断采用新型隐球菌荚膜多糖体抗原，研究表明，使用血清或血浆样品诊断隐球菌抗原，具有优良的敏感性和特异性；尿液和唾液样本为次选。这说明隐球菌的抗原免疫诊断具有现实的临床价值。临床采用诊断方法包括乳胶凝集法、ELISA法和胶体金法。文献研究报道，ELISA法和胶体金法两种方法的检测结果高度一致，但乳胶凝集法灵敏度不及前两者；ELISA法操作时间较长，而且需要酶标仪等专业设备，不适用于现场快速检测，尤其不适用于在疑似感染和高危人群中开展筛查及早期诊断。

免疫胶体金技术是一种POCT诊断技术，以胶体金作为显色标志物。胶体金颗粒在弱碱环境下带负电，可与蛋白质分子等带正电基因静电结合，同时不影响其生物特性，从而可以与待检物(抗体、抗原、小分子等)进行特异性结合。从而实现相应待检分子的快速诊断。尤其是胶体金试剂生产成本和检测成本低，尤其适用于对疑似人群开展筛选，可大为降低筛查成本，降低临床死亡率；尤其适合在疑似感染和高危人群中开展筛查及早期诊断。

荚膜多糖存在于多种细菌，既是细菌重要的毒力因子，也是细菌重要的保护性抗原。隐球菌荚膜多糖(Glucuronoxylomannan，GXM)抗原可以在疾病早期即在感染患者的体液(如血清、脑脊液)中出现，是一种理想的早期诊断标志。

隐球菌早期适当治疗可降低病死率，防止中枢感染发生。因此本病的早期诊断对于预后及减少或避免后遗症的发生尤为重要，尤其是对于降低中枢神经系统隐球菌病的发生率和死亡率具有非常重要的意义。然而，隐球菌起病隐匿，无明显特征，特别是其早期，容易与其它疾病相混淆。因此，在疑似感染和高危人群中开展隐球菌感染筛查具有重要意义。相关研究表明，在CD4+≤100细胞/μL的艾滋病毒感染者中开展隐球菌筛查，能提高患者生存率并同时降低综合医疗成本。

目前，国内尚无成熟的隐球菌免疫胶体诊断产品。已有的临床注册批准的隐球菌产品仅有3种，且都为ELISA法。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速有效的隐球菌检测卡。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种隐球菌检测卡，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。其中，所述胶板优选为硬质的聚氯乙烯底板；所述层析膜优选为硝酸纤维素膜。

优选地，所述检测区包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。应当说明的是，所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体优选为鼠源性单克隆抗体，是针对荚膜多糖抗原的不同决定簇，因而可以同时与荚膜多糖抗原特异性结果；所述第一单克隆抗体和第二单克隆抗体与荚膜多糖抗原结合的部位是不同的。

优选地，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。

优选地，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体。

优选地，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

优选地，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。更优选地，所述预处理缓冲液的浓度为10-100mM。

优选地，所述预处理缓冲液中还含有表面活性剂；更优选地，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种；更优选地，所述表面活性剂的浓度为5-100g/L。

优选地，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种。

为了使检测卡具有更佳的灵敏度和效果，所述金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列具有增敏作用的组分：蔗糖、葡萄糖、氯化钠、氯化钾和甘氨酸中的任意一种或多种的组合；其中，表面活性剂的浓度优选为3-20g/L，预处理缓冲液的pH优选为7.0-7.6。

优选地，所述预处理缓冲液中各组分的浓度为葡萄糖1-4g/L、氯化钠0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L和甘氨酸1-4g/L。

优选地，所述金标垫的预处理方法为：将金标垫在预处理缓冲液中浸泡1-3h后取出，于25-38℃烘干。应当说明的是，所述预处理缓冲液的pH值可采用本领域各种常用的pH调节试剂进行调节。

在第二个方面，本发明提供了一种隐球菌的检测盒，包括盒体，所述盒体内设有上述的检测卡，所述盒体的表面设有加样孔和观察窗，所述加样孔下方为所述样品垫，所述观察窗的下方为所述层析膜。优选地，所述盒体内设有检测卡卡槽。应当说明的是，本发明的检测卡或检测盒可用于定性检测血液/脑脊液样品中的隐球菌荚膜多糖抗原。

在第三个方面，本发明提供了上述的检测盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体溶液喷涂金标垫，制备包含抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体的金标垫；

2)在检测线上喷涂抗隐球菌荚膜多糖的第二单克隆抗体，在质控线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的层析膜；

3)将样品垫、步骤1)所得金标垫、步骤2)制备的层析膜、吸水垫依次粘贴在胶板上，通过切裁制得检测卡，然后装入盒体制得所述检测盒。

综上所述，本发明的有益效果为：

采用本发明的检测卡或检测盒能快速灵敏的检测隐球菌荚膜多糖抗原的存在，明确检测对象是否被隐球菌感染；本发明的检测卡或检测盒灵敏度高，特异性强，检测速度快，5分钟内即可得出检测结果，操作十分简单。

附图说明

图1为本发明的检测卡的结构示意图；

图2为本发明的检测盒的结构示意图；

其中，1、胶板，2、样品垫，3、金标垫，4、层析膜，5、第一吸水垫，6、第二吸水垫，7、检测区，8、质控区，9、检测线，10、质控线，11、盒体，12、加样孔，13、观察窗，14、卡槽。

具体实施方式

本发明涉及临床医学免疫检测试剂及其制备方法，具体涉及一种早期快速检测隐球菌抗原的胶体金检测卡及其制备方法，具有及时、检测迅速、便携、无需仪器设备、便于现场使用等优点。

本发明的检测卡采用隐球菌荚膜多糖抗原作为早期诊断标志物，并采用活性剂和增敏剂以提高检测灵敏度，能够做到在临床症状出现前3周测出隐球菌感染，是一种理想的早期诊断的检测产品。

本发明的检测卡相对于ELISA产品的优势在于：1)本发明的检测卡生产成本和检测成本都比ELISA试剂更低，特别适宜于进行筛选；2)检测过程迅速，尤其合适急诊，可现场使用，无需仪器设备，操作简单；尤其对于条件不足的地区，忽然发病的病人，可以及时得出诊断结果；3)本发明的检测卡可以在临床症状出现前3周测出是否发生感染。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂、材料等均可从市场上购买获得。

实施例1

如图1所示，本发明的隐球菌检测卡的一种实施例，包括胶板1，在胶板1上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫2、金标垫3、层析膜4和第一吸水垫5，层析膜4和胶板1之间设有第二吸水垫6，层析膜4上设有检测区7和质控区8，检测区7设于样品垫2和质控区8之间，金标垫3上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体；检测区包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体，或者检测区7的靠近样品垫的一侧设有检测线9，检测线9上包被有隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体；质控区8包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，或者质控区8的靠近样品垫2的一侧设有质控线10，质控线10上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；胶板1为硬质的聚氯乙烯底板；层析膜4为硝酸纤维素膜；

其中，样品垫2和金标垫3采用预处理缓冲液处理，预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种，预处理缓冲液的浓度为10-100mM；预处理缓冲液还含有表面活性剂；表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种；金标垫的预处理方法为：将金标垫在预处理缓冲液中浸泡1-3h后取出，于25-38℃烘干。

为了使检测卡具有更佳的灵敏度和效果，金标垫3可采用以下预处理缓冲液处理，其包括下列具有增敏作用的组分：葡萄糖1-4g/L、氯化钠0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L和甘氨酸1-4g/L；其中，表面活性剂的浓度为3-20g/L，预处理缓冲液的pH为7.0-7.6。

实施例2

如图2所示，本发明的隐球菌检测盒的一种实施例，包括盒体11，盒体11内设有实施例1的检测卡，盒体11的表面设有加样孔12和观察窗13，加样孔12下方为样品垫(图中未示出)，观察窗13的下方为层析膜(图中未示出)，盒体11内设有检测卡卡槽14。

实施例3

本发明的隐球菌检测卡的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：

(1)胶体金标记抗CG(隐球菌)-GXM(荚膜多糖)单克隆抗体-1(即第一单克隆抗体)

采用经典的三氯金酸-柠檬酸三纳法制备胶体金，粒径为30nm，所测pH6.6；然后以抗CG-GXM单克隆抗体-1(即第一单克隆抗体，购自Aviva公司)包被胶体金，包被浓度为0.05mg/mL，离心分离出游离的胶体金粒子，然后以原体积1/5的磷酸盐缓冲液重新悬浮(含1mg/mL PEG6000，5％蔗糖，10mM pH7.2)。

(2)菌荚膜多糖抗原免疫胶体金检测卡的制备

1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，将金标垫浸于金标垫预处理缓冲2小时，取出置于37度烘干；金标垫预处理缓冲液为磷酸盐缓冲液，10mM pH7.2，含氯化钠0.2g/L、甘氨酸2.0g/L；

2)然后用步骤(1)制备的胶体金标记的抗CG-GXM单克隆抗体-1溶液喷涂经过预处理的金标垫，溶液浓度为100mg/mL，喷涂量为4μL/cm²，制得包被抗体的金标垫；

3)在硝酸纤维素膜(即层析膜)的检测线和质控线上分别喷涂0.5mg/mL的抗CG-GXM单克隆抗体-2(即第二单克隆抗体，购自ABGENT公司)和羊抗鼠IgG多克隆抗体溶液，喷涂量为1μL/cm²，制备得到包被抗体的硝酸纤维素膜；

4)将样品垫、步骤2)制得的金标垫、步骤3)制得的硝酸纤维素膜、和吸水垫依次粘贴在PVC底板(即胶板)上，切裁制得3-5mm宽的如图1所示的检测卡；亦可将检测卡装入盒体得到如图2所示的检测盒。

实施例4对比检测卡的制备

对比检测卡的制备：以抗CG-GXM小鼠多克隆抗体为捕获抗体，抗CG-GXM兔多克隆抗体为捕获抗体，制备对比的胶体金检测卡作为平行对照。

具体的制备方法如下：

(1)多克隆抗体的制备

①将平板上一个隐球菌菌落，接种至YNB培养基，30℃摇床振荡培养3－4天，收集菌体，高压灭菌，9000rpm离心，收集上清；加入3倍体积无水乙醇，摇匀后4℃过夜，9000rpm离心，收集沉淀。此沉淀即为CG-GXM粗提物。CTAB法进一步纯化CG-GXM。

②CG-GXM抗原免疫小鼠：采用弗氏完全佐剂，与CG-GXM抗原完全乳化后，免疫6周龄BALB/c小鼠，分别于首次免疫后第14、21、28天进行3次加强免疫；在第35天拉颈处死小鼠，取全血分离血清，制备得到抗CG-GXM小鼠兔多克隆抗体。

③CG-GXM抗原免疫新西兰兔：采用弗氏完全佐剂，与CG-GXM抗原完全乳化后，免疫2月龄新西兰兔，分别于首次免疫后第14、24、34天进行3次加强免疫；在末次免疫后第7天，取全血分离血清，制备得到抗CG-GXM兔多克隆抗体。

④抗CG-GXM小鼠多克隆抗体经兔血清蛋白吸附处理，降低与兔血清的交叉反应。

(2)制备以多克隆抗体为原料的胶体金试剂。

以隐球菌荚膜多糖多克隆抗体制备的胶体金试剂为平行对比试剂。以抗CG-GXM小鼠多克隆抗体为捕获抗体，抗CG-GXM兔多克隆抗体为捕获抗体。

具体制备方法如下：以抗CG-GXM小鼠多克隆抗体(即第一抗体)替换抗CG-GXM单克隆抗体-1，包被浓度0.03mg/mL；以抗CG-GXM兔多克隆抗体(即第二抗体)替换抗CG-GXM单克隆抗体-2，浓度0.03mg/mL；其余步骤同实施例3，制备对比检测卡。

实施例5本发明的检测卡的性能测试

(1)特异性试验(交叉试验)

取实施例3制备的检测卡和实施例4的对比检测卡，将两者同时平行检测。

待测样本：共采集临床血清样本25例，其中11份为经真菌培养阳性确诊样本，6份为正常阴性样本，干扰样本7份。7份干扰样本，包括：3份结核分枝杆菌感染阳性样本，2份念珠菌感染血清样本，1份曲霉菌感染血清样本，1份高浓度的类风湿因子血清样本(920IU/mL)。

分别在检测卡加样孔滴加2-3滴血清样本，滴加后在5分钟内判读结果，结果如下表1和2所示。

表1 本发明的检测卡的特异性的检测结果

表2 作为对比的检测卡的特异性的检测结果

由以上表1和表2可知，本发明检测卡的检测结果与真菌培养样本相比，完全相符；对于念珠菌、曲霉菌等常见真菌感染无交叉反应，对于易干扰的结核分枝杆菌无交叉反应，不受高浓度类风湿因子血清样本的干扰，特异性良好。

对比检测卡的检测结果，对于念珠菌、曲霉菌等常见真菌感染无交叉反应，结核分枝杆菌感染血清和高浓度类风湿因子血清样本有交叉反应，说明对比检测卡的特异性不及本发明的检测卡。

(2)本发明的检测卡的检测范围和灵敏度

测试方法：(1)将从培养的隐球菌中提纯的CG-GXM稀释成每毫升1、2、5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL的标准溶液；

(2)取稀释好的标准溶液，滴加在检测卡的样品垫上进行检测。5-15分钟内观察不同含量标准品出现阳性条带和质控条带情况，将出现阳性条带的最低浓度和最高浓度确定为检测卡的检测范围,其中最低浓度为该检测卡的灵敏度。

表3 本发明的检测卡的灵敏度的测试结果

测试结果：结果如上表3所示，本发明采用抗CG-GXM小鼠单克隆抗体作为捕获抗体，其检测特异性明显优于采用相应的多克隆抗体的试剂卡，其检测阈值下限也低于采用相应多克隆抗体的试剂卡。

本发明采用的单克隆抗体可以显著的提高本产品的检测特异性，同时保持了检测卡的高灵敏度。本发明采用抗CG-GXM小鼠单克隆抗体作为捕获抗体，其检测特异性明显优于采用相应的多克隆抗体的检测卡，其检测阈值下限也低于采用相应多克隆抗体的检测卡。

本发明所用的原材料都可以从市场上获得，本发明的新颖性和创造性在于：检测卡兼具高灵敏度和高特异性，能快速检测隐球菌荚膜多糖抗原。此外，本发明的检测试剂盒有快速、简便、结果准确、成本低等优点。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种隐球菌的检测卡，其特征在于，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述检测区包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。

4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有抗隐球菌的荚膜多糖的第二单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的检测卡，其特征在于，所述预处理缓冲液中还含有表面活性剂。

8.根据权利要求7所述的检测卡，其特征在于，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种。

9.一种隐球菌的检测盒，其特征在于，包括盒体，所述盒体内设有权利要求1～8任一项所述的检测卡，所述盒体的表面设有加样孔和观察窗，所述加样孔下方为所述样品垫，所述观察窗的下方为所述层析膜。

10.权利要求9所述的检测盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体溶液喷涂金标垫，制备包含抗隐球菌荚膜多糖的第一单克隆抗体的金标垫；

2)在检测线上喷涂抗隐球菌荚膜多糖的第二单克隆抗体，在质控线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的层析膜；

3)将样品垫、步骤1)所得金标垫、步骤2)制备的层析膜、吸水垫依次粘贴在胶板上，通过切裁制得检测卡，然后装入盒体制得所述检测盒。