CN108761082B - 一种定量检测血清lrpprc的抗体组合及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过定量检测血清LRPPRC进行癌症早期诊断的抗体组合及试剂盒。所述抗体组合，包括：(a)特异性结合LRPPRC第611‑907位氨基酸片段的多克隆抗体，和(b)特异性结合LRPPRC第964‑1273位氨基酸片段的单克隆抗体。通过使用两种针对不同免疫原性片段的抗体相互配合，对血清LRPPRC含量进行检测，建立了灵敏特异的癌症早期诊断法。

Description

一种定量检测血清LRPPRC的抗体组合及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种癌症或肿瘤标记物的血清学检测技术，特别涉及一种通过定量检测血清LRPPRC进行癌症早期诊断的抗体组合及试剂盒。
背景技术
癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。现阶段由于癌症早期诊断和筛查技术的不足，很大一部分癌症病人在初次就诊时就已经是处于肿瘤晚期，丧失了手术切除治愈的机会。因此筛选能够用于肿瘤早期诊断的分子标志物，开发相应的检测方法对提高肿瘤患者的生存具有至关重要的作用。相比于其他临床检测手段(如CT、核磁、穿刺活检等)，血液蛋白指标的检测在肿瘤的诊断中具有无可比拟的优势。其不但成本较低、对病人创伤小，同时由于对设备要求低、样本易得，使其成为肿瘤早期筛查及后期监控的重要手段。因此，发现并利用新的肿瘤血液标志物，开发相应的癌症早期检测手段是肿瘤研究的热点之一。
LRPPRC(富含亮氨酸的三角状五肽重复基序蛋白)是一种线粒体蛋白，它的突变与细胞色素c氧化酶缺陷(cytochrome c oxidase deficiency)及Leigh综合征(LeighSyndrome)的发生密切相关。本发明人前期大量的研究结果提示LRPPRC在肺癌患者的癌变组织中高表达，并且与患者的预后密切相关。然而，关于LRPPRC在血液中的丰度及其临床意义尚未有相关报道，
发明内容
为解决上述问题，发明人在大量实验的基础上，偶然发现血清中存在LRPPRC，进而设想在癌症患者血清和正常人血清中LRPPRC的含量可能存在差异。具体以早期检测肺癌、食管癌为例，针对血清LRPPRC含量的变化开发了一种定量检测血清LRPPRC的抗体组合及试剂盒。
一方面，本发明提供一种抗体组合，其包括：
(a)特异性结合LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体，和
(b)特异性结合LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体。
本发明所述的抗体组合，其特征在于所述(b)特异性结合LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体是经过生物素标记的。
第二方面，本发明提供所述抗体组合在制备检测血液中LRPPRC蛋白的试剂盒中的用途。
优选的，本发明所述制备检测血液中LRPPRC蛋白的试剂盒的用途，其中所述试剂盒是定量检测试剂盒。
优选的，本发明所述制备检测血液中LRPPRC蛋白的试剂盒的用途，其中所述(a)特异性结合LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体用作捕获抗体，所述(b)特异性结合LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体用作检测抗体。
第三方面，本发明提供所述抗体组合在制备癌症诊断试剂盒中的用途。
优选的，本发明所述抗体组合在制备癌症诊断试剂盒中的用途，其中所述癌症包括肺癌、食管癌、结直肠癌、肺腺癌、肝癌、乳腺癌。
优选的，本发明所述抗体组合在制备癌症诊断试剂盒中的用途，其中所述(a)特异性结合LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体用作捕获抗体，所述(b)特异性结合LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体用作检测抗体。
第四方面，本发明提供一种癌症早期诊断试剂盒，包括：所述的抗体组合、可选的HRP标记的链霉亲和素和标准曲线图。
本发明所述癌症早期诊断试剂盒，其特征在于通过定量检测血清样LRPPRC含量区分正常人和癌症患者。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
首先，本发明建立了通过检测血清LRPPRC含量，而不是组织LRPPRC含量，来诊断癌症的方法。以血清LRPPRC为检测靶标进行定量检测成本低、样本易得可以进行大规模的体外筛查，为癌症的早期诊断提供了新的检测手段。
其次，本发明基于LRPPRC的免疫原性表位分析，提供了相互配合的两种抗体。一方面，以针对LRPPRC的第611-907位氨基酸的多克隆抗体为捕获抗体，能够确保将血清中的LRPPRC特异性结合到酶标板上，避免因未能结合LRPPRC而导致的定量值偏低；另一方面，以针对LRPPRC的第964-1273位氨基酸的单克隆抗体为特异性检测抗体，确保检测结果的特异性和准确性。另外，多克隆捕获抗体与单克隆检测抗体针对的抗原肽段不同，二者之间不会形成内部竞争。
最后，本发明提供了精密的标准曲线图，对正常人血清、癌症患者血清、放疗后患者血清中LRPPRC进行定量检测的结果表明，本发明建立的诊断的方法具有良好的特异性和较高灵敏度。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1应用该试剂盒进行LRPPRC蛋白检测的浓度响应结果。
X轴为OD450，Y轴为LRPPRC浓度(pg/mL)。当LRPPRC浓度在约300pg/mL至2500pg/mL范围内，OD450的吸收值成线性正相关。
图2正常人血清及肺癌患者血清LRPPRC检测显色图。
正常人的血清中着色较浅，基本呈白色；肺癌患者血清中的显色较深，大部分呈黄色。
图3正常人、肺癌患者及食管癌患者血清中LRPPRC含量统计图。
A为正常人与非小细胞肺癌患者血清中LRPPRC含量对比；
B为正常人与食管癌患者血清中LRPPRC含量对比。
图4以血清中LRPPRC含量区分正常人、肺癌患者的ROC曲线。
ROC曲线下面积为0.884，高于0.75的临界值。
图5肺癌患者放疗前后血清中LRPPRC含量统计图。
肺癌患者接受放疗后，血清LRPPRC含量有所下降。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
根据本发明的实施方式，提出建立血清LRPPRC双抗夹心ELISA定量检测的方法。
实施例一、抗体的制备及ELISA孔板的包被
以LRPPRC第611-907位氨基酸片段为免疫原，免疫新西兰兔，首免后2周加强免疫，加强免疫后2周进行三免，三免后1周测血清抗体滴度，取血制备针对LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体。
以LRPPRC的第964-1273位氨基酸为免疫原，通过杂交瘤技术制备鼠抗LRPPRC单克隆抗体。
以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被用的LRPPRC多克隆抗体至1-10ng/ml，每孔75-200ul进行包被，4℃过夜。弃上清，添加0.05-0.5％牛血清白蛋白BSA每孔200ul进行封闭，37℃封闭2h-4h。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋，-20℃保存。
实施例二、LRPPRC的血清学检测
1、ELISA试剂盒用于LRPPRC检测可靠性
采用包被的LRPPRC特异性ELISA试剂盒对原核表达的LRPPRC重组蛋白进行定量检测。将重组蛋白进行梯度稀释，制备成2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312pg/ml、0pg/ml的待检测液。各取100μL加入96孔板37℃孵育2h。弃上清添加生物素化LRPPRC单克隆抗体，37℃孵育1h。洗涤液洗涤三次，添加亲和素-HRP复合物，37℃孵育1h。洗涤液洗涤5次后添加TMB显色液，15min，添加反应终止液，酶标仪进行450nm吸收峰测定。结果如图1所示，图1表明本发明建立的ELISA检测方法在测定溶液中LRPPRC时，具有较好的浓度相应性。
2、血液中LRPPRC含量的ELISA检测
采用包被的ELISA试剂盒检测人血清中LRPPRC的蛋白含量，将血清样本用PBS缓冲液进行5-10倍稀释，检测适用量100μL。结果如图2所示，LRPPRC蛋白在肺癌患者血清中的显色较深，而在正常人的血清中着色较浅，表明LRPPRC在正常人血清的含量明显低于在肺癌患者血清中的含量。
3、血液中LRPPRC在肺癌、食管癌及正常人血清中的统计差异
对正常人、肺癌及食管癌患者血清中的LRPPRC含量进行统计。结果如图3所示，正常人血清中LRPPRC含量较低中位值约为5.56ng/ml，肺癌及食管癌患者血清中LRPPRC含量较高中位值分别约15.3ng/ml及14.6ng/ml。
4、血液中LRPPRC在用作肺癌诊断的特异性和灵敏度
采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析方法对正常人及肺癌患者血清中LRPPRC含量进行分析，结果如图4所示，以LRPPRC丰度作为单一检测指标区分正常人及肺癌患者具有较好的灵敏度及特异性，ROC曲线下面积为0.884(大于临界值0.75).说明LRPPRC的血液丰度指标是一个有意义的肺癌检测标志物。
5、血液中LRPPRC在肿瘤治疗前后的丰度变化
检测同一肺癌病人在接受放疗前后血液中LRPPRC含量变化，结果如图5所示。在放疗处理后，肺癌患者血清中的LRPPRC丰度均有一个显著的下降，也证明其是一个具有临床意义的血液标志物。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种抗体组合，其包括：
(a)特异性结合人血清LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体，和
(b)特异性结合人血清LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述抗体组合，其特征在于所述(b)特异性结合人血清LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体是经过生物素标记的。
3.权利要求1或2所述抗体组合在制备检测血液中人血清LRPPRC蛋白的试剂盒中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述检测血液中人血清LRPPRC蛋白的试剂盒是定量检测试剂盒。
5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述(a)特异性结合人血清LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体用作捕获抗体，所述(b)特异性结合人血清LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体用作检测抗体。
6.权利要求1或2所述抗体组合在制备癌症诊断试剂盒中的用途，所述癌症包括肺癌、食管癌。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述(a)特异性结合人血清LRPPRC第611-907位氨基酸片段的多克隆抗体用作捕获抗体，所述(b)特异性结合人血清LRPPRC第964-1273位氨基酸片段的单克隆抗体用作检测抗体。
8.一种癌症早期诊断试剂盒，包括：权利要求1或2所述的抗体组合，HRP标记的链霉亲和素和标准曲线图。
9.如权利要求8所述癌症早期诊断试剂盒，其特征在于通过定量检测血清样人血清LRPPRC含量区分正常人和癌症患者。
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