TWI627184B - Novel peptides, antibodies thereof and methods for assessing oral cancer risk - Google Patents

Abstract

本發明係揭露一種THLW胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。該THLW胜肽係能作為與HPV病毒感染相關疾病之生物標幟物，如口腔癌、子宮頸癌等，因此，藉由將該THLW胜肽作為抗原或製備出一抗THLW胜肽之抗體，可用以檢測樣本提供者之罹癌風險。

Description

新穎胜肽、其抗體及以其評估口腔癌風險之方法

本發明係與一種胜肽及其用途有關，特別係指一種新穎胜肽、其抗體及以其評估口腔癌風險之方法。

按，依據臺灣衛生福利部之資料顯示，男性罹患口腔癌之人數逐年增加，並且，口腔癌為2013年之台灣十大癌症死因中之第五位。而根據世界衛生組織2008之統計資料顯示，全球約有26萬多人離換口腔癌，至少12萬人之死亡原因與口腔癌相關。以臺灣來說，口腔癌發生率之所以高居不下，推斷其與嚼食檳榔、抽煙、酗酒等習慣及飲食中含有致癌物相關，其中又以檳榔與抽煙為誘發口腔癌之主因。具體來說，檳榔中之檳榔素、檳榔鹼及其所添加之荖花係為致癌性物質。

口腔癌初期發生之症狀不明顯，如白斑、潰瘍等初期症狀常會被患者忽略，因而大多患者係延誤初期進行治療之時機。隨著口腔病變持續進展，開始出現較為明顯之症狀，如疼痛、腫塊、吞嚥困難、流血等，患者始會進行就醫，惟，大多患者就醫時多為口腔癌晚期，導致治療上之困難度增加。一般來說，口腔癌患者於第1～2期發現並接受治療，三年存活率為72％，五年存活率為60％，而若發現時已是口腔癌第3～4期時，三年存活率係降為61％，五年存活率則為30％。而目前臨床初期檢查口腔癌除須仰賴醫生之目視及觸診外，尚須配合病理切片及X光檢查才能確診。雖然目前對於罹患口腔癌之高危險族群積極推動口腔癌篩檢，但是由於篩檢過程為侵入式，且篩檢需要專科醫生協助進行，導致民眾無法主動積極參與篩檢，更遑論高危險族群會定期進行篩檢，以致於口腔癌預防或早期治療至今成效仍不佳。

據此，目前市面上極度缺乏一種高靈敏度且操作簡便之體外預測口腔癌風險之套組或方法。

本發明之主要目的係在於提供一種THLW胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。該胜肽係能作為與HPV病毒感染相關疾病之生物標幟物，如口腔癌、子宮頸癌等。

更進一步來說，藉由本發明所揭THLW胜肽作為抗原，利用本發明所屬技術領域之通常知識係能夠製備出能夠專一性結合HPV病毒之E6致癌蛋白之THLW抗體。

本發明之次一目的係在於提供一種檢測罹患口腔癌風險之方法，其係藉由THLW胜肽或/及抗THLW胜肽之抗體作為檢測分子，以非侵入式之方式進行檢測，而能夠達到有效且快速地檢測出檢體提供者是否為罹患口腔癌高風險族群之功效。

於本發明之一實施例中係揭露一種檢測罹患口腔癌風險之方法，其係以THLW胜肽與一檢體進行反應，當該檢體與該胜肽間有反應時，表示該檢體中含有抗HPV病毒之E6致癌蛋白之物質。

於本發明之另一實施例中係一種檢測罹患口腔癌風險之方法，其包含下列步驟：(a)製備抗THLW胜肽之抗體；(b)以步驟a之抗體與一檢體進行反應，當該檢體與該抗體間之作為力變化量高於一第一預定數值時，顯示該檢體內含有HPV病毒，並且，該檢體提供具有罹患口腔癌之高風險；而當該檢體與該抗體間之作為力變化量高於一第二預定數值時，顯示該檢體提供具有罹患口腔癌之低風險。

藉此本發明實施例所揭檢測方法得到之結果，能夠用以判斷該檢體提供者是否為罹患口腔癌之高風險族群，亦能作為定期追蹤口腔癌罹患風險或檢測口腔癌前期之用。

而由於HPV陽性之口腔癌患者具癌化範圍較為侷限、對化學治療較為敏感等特性，因此於臨床上認為HPV陽性之口腔癌患者較HPV陰性之口腔癌患者來說，治療效果及預後較佳。因此，本發明之另一目的係在於提供一種檢測評估口腔癌預後或治療方針之方法，其係藉由THLW胜肽或/及抗THLW胜肽之抗體作為檢測分子，用以提供臨床上對於口腔癌患者擬定治療方針或是評估預後之輔助工作，以達到減少醫療成本及增加治癒率之功效。

更進一步來說，步驟b中之該第一預定數值係為100RU，該第二數值係為40RU。

本發明之一實施例係揭露一種評估口腔癌預後或治療方針之方法，其係以THLW胜肽與一檢體進行反應，當該檢體與該胜肽間有反應時，表示該檢體中含有抗HPV病毒之物質。

於本發明之另一實施例中係一種評估口腔癌預後或治療方針之方法，其包含下列步驟：(a)製備抗THLW胜肽之抗體；(b)以步驟a之抗體與一檢體進行反應，當該檢體與該抗體間之作為力變化量高於一第一預定數值時，顯示該檢體內含有HPV病毒，並且，該檢體提供者預後較差或是所使用之治療方針為無效；而當該檢體與該抗體間之作為力變化量高於一第二預定數值時，顯示該檢體提供者預後較佳或是所使用之治療方針為有效。

根據上述檢測結果，臨床上可簡單且快速地判斷患者是否為HPV陽性，並且進而擬定適合之治療方案；亦或可將上述評估方法用於評估治療中或完成治療之患者，藉以評估其預後或治療手段之有效性。

其中，步驟b中之該第一預定數值係為100RU，該第二數值係為40RU。

此外，本發明所揭THLW胜肽及/或抗THLW胜肽之抗體係能夠結合檢測工具或基材，例如將該胜肽或抗體鍵結於生物晶片、生物感測器上，用以達到更快速判讀檢測結果之功效。

又，較佳地，本發明各實施例中所揭方法之檢體係能為唾液、口腔組織、血液。

除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。

本發明係設計一新穎胜肽片段：THLW胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1所示（EVYDFAFRDLCIVYRDGNP-amide），其分子量約為2290～2295Da。透過將SEQ ID No.1所示胜肽作為抗原，藉由免疫操作之技術，可製備出抗體，以作為檢測口腔癌之用。THLW胜肽係可透過人工合成或是重組生物體產製平台被製備而成。

所謂「人工合成方式」乙詞係為以本發明所屬技術領域且具通常知識者之周知技術，透過人工方式將胺基酸依序連接而成為一多胜肽，其中，人工合成方式包含化學合成法以及胜肽合成儀。而人工合成法通常具有以下優點：可方便地於合成過程中改變多胜肽之一級結構、加入特殊的胺基酸、以及對多胜肽之末端進行修飾等。一般來說，化學合成法可分為固相胜肽合成法及液相胜肽合成法，其中，液相合成法必須於完成每ㄧ胺基酸之連接後，進行萃取操作。惟，由於萃取所得之多胜肽中間物通常為混合物，因此，尚須進行層析純化步驟，因此，以液相合成法進行多胜肽之合成，必須涉及繁瑣之萃取及層析純化步驟，才能得到高純度之產物。固相合成法係於溶劑中，在固體聚合物顆粒（或聚合支撐物）上進行胜肽之鍵結反應。於此方法中，係先將所欲多胜肽之N端胺基酸共價鍵結至聚合物顆粒上，其後再透過專一性鍵結之方式將後續胺基酸依序連接上，最後合成該多胜肽。由於該聚合物顆粒並不溶於溶劑中，故僅需於反應終了透過清洗及過濾操作，即可將該聚合物顆粒（以及連接在該聚合物顆粒上之所欲之多胜肽）與反應試劑及副產物分開。因此，固相胜肽合成法因為不需要純化中間產物，不僅具有較佳產率，且可大幅縮短反應時間，於長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢，為目前較為廣為人所使用之胜肽合成方法。

所謂「重組生物體產製平台」乙詞係指透過生物技術將用以表現特定蛋白質之核酸構築於一表現載體上，再將該重組表現載體轉形至一宿主細胞中，如大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌等，使該重組表現載體能於該宿主細胞內表現該核酸，而得獲得該特定蛋白質。

所謂「免疫操作之技術」乙詞係指透過抗原誘發免疫反應而獲得抗體，其中，抗體係得為多株抗體或單株抗體。目前周知用以製備抗體之技術眾多，舉例來說，藉由將抗原打入個體，如老鼠，誘使免疫反應發生而能生產出抗體，確認已經產生抗體後，再取其脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合後，獲得已分離之抗體；亦有利用抗原感染家禽，使其蛋黃中含有抗體，再藉由純化技術獲得抗體。

所謂「生物感測器」係指使用固定化之生物辨識分子，如抗體、抗原、醣類、蛋白質等，結合訊號轉換元件，待該生物辨識分子與分析物反應後，產生如質量、光學、熱量、電荷等物理量之變化，使訊號轉換元件接收生物辨識分子變化之訊號後產生得以偵測之訊號。生物感測器係依據其轉換能量技術及設備而有不同，例如電化學生物感測器係以特定電極作為訊號轉換元件。而本發明實例中所使用CM5晶片之生物感測器係以表面電漿共振技術為基礎，藉由將生物辨識分子與待測物反應後之折射係數變化轉換成共振角度之變化量，以達到偵測兩者間反應之功效。

以下，將茲舉若干實例來說明本發明之功效。

先以說明者，由於目前已知HPV 16型及18型病毒為與口咽癌與子宮頸癌相關，其中，HPV 16型感染宿主後會使宿主細胞產生蛋白E6，其胺基酸序列係如SEQ ID No.2所示。E6蛋白關閉抑制腫瘤蛋白p53之功能，導致細胞不正常增生而形成癌症，因此，以下實例中係以與HPV 16型病毒相關之E6蛋白及其抗體作為對照組。

實例一：製備THLW胜肽

以固相胜肽合成法製備THLW胜肽，步驟如下：

加入 Fomc-AM樹脂（0.125 mmole、0.169 mg）於PD-10管內。 加入5 mL之二氯甲烷使樹脂膨大，反應5分鐘，重複兩次；加入5 mL 之二甲基甲醯胺使樹脂濕潤，反應5分鐘，重複兩次。

加入5 mL、30 % 哌啶/二甲基甲醯胺溶液混合反應15分鐘，以除去樹脂上之Nα-Fmoc保護基。加入5 mL二甲基甲醯胺混合反應5分鐘，以洗去殘存在 PD-10管內之哌啶/二甲基甲醯胺溶液。取胺基酸0.25 mmole 並且與耦合（HOBT：0.25 mmole，33.775 mg；HBTU：0.25 mmole，82.325 mg；DIEA：87 μL）反應5分鐘後，與反應管內之AM樹脂混合反應2小時。待反應結束後，加入 5 mL二甲基甲醯胺反應 5 分鐘，並且，每次耦合反應結束後以Ninhydrin test 鑑定是否耦合成功。藉由重複上述步驟至THLW胜肽之胺基酸都接上樹脂。

待THLW胜肽序列完成後，加入 30 %哌啶/二甲基甲醯胺溶液5 mL反應後，再加入二甲基甲醯胺溶液5 mL，以去除掉序列最後一個胺基酸上 N 端的 Fmoc保護基。最後，以化學裂解法將胜肽從樹脂上切下，利用裂解試劑（95 % TFA in DDW）將胜肽與 AM樹脂裂解並將胜肽側鏈保護基切除。進行減壓過濾及離心後，獲得胜肽粗產物。

預定之基質與胜肽粗產物與等體積混合，待產生共結晶後，以MALDI-TOF質譜儀分析其分子量，結果如第一圖所示。THLW該胜肽粗產物中含有目標產物：THLW胜肽（分子量2293.9Da），其胺基酸序列係如SEQ ID No.1所示。

實例二：純化胜肽粗產物

以逆相高效能液相層析儀分析實例一中所獲得胜肽粗產物，其中，所使用之層析管柱之孔徑為10μm之C18 管柱，偵測波長為225nm，固定流速為4mL/min，移動相溶劑組成如下：溶劑A：4 L D.D.water + 0.05 % trifluoroacetic acid (TFA)，而溶劑B：4 L Acetonitrile + 0.05 % trifluoroacetic acid (TFA)，並加入微量TFA；溶劑A/溶劑B之含量比例：於30分鐘內以90：10～10：90之方式沖提，接著7分鐘維持10：90比例，再轉換成90：10之比例10分鐘。經電腦偵測之結果係如第二圖所示。

由第二圖可知THLW胜肽之滯留時間約為14.02分。收集此吸收峰之溶液經過冷凍乾燥處理後，再以MALDI-TOF質譜儀鑑定其分子量，其中，操作流程係如實例一所述，故於此不加以贅述。分子量之鑑定結果係如第三圖所示，顯示經過純化之THLW胜肽的純度並且確認其身份。請參閱第四圖，將純化後之THLW胜肽進行冷凍乾燥，再溶解並以逆相高效能液相層析儀分析可知僅有出現THLW胜肽之訊號。

由上述結果可知本發明所揭THLW胜肽係能夠被成功合成且純化。

實例三：製備多株抗體

先以敘明者，本實例係依據實驗動物照護及使用委員會之規範所進行者。

取足齡之來亨雞，將已純化之THLW 胜肽作為抗原，第一次注射使用150 μg抗原與150 μL完全佐劑以1：1 之比例混合，大力震盪使其呈現乳化狀態。將這混合液分散注射於雞腿不同處，14 天後進行第二次注射，共注射4 次後收取雞蛋。

取雞蛋內之蛋黃，加入同體積的去離子水，予以混合。再加入15 mL之氯仿，予以混合後，以 4000 rpm離心5分鐘取出上清液，其內含有THLW抗體，得將之保存於 -20 ℃下，或得將之以冷凍抽乾機抽成粉末狀予以乾燥保存，以供後續實例使用。

實例四：檢測THLW胜肽及其多株抗體之抗體反應效價

將純化之THLW胜肽（0.2mg/mL）固定於孔盤上，洗去未鍵結之THLW胜肽。將實例三中所製備之THLW抗體以最高濃度0.2mg/mL，分別稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL後，以間接型ELASA進行偵測THLW胜肽與抗體間之反應，結果如第五圖所示。由第五圖中可知THLW抗體於濃度0.0625mg/mL～0.25mg/mL與THLW胜肽之免疫反應有劑量關聯性，故進一步將THLW抗體從0.25mg/mL進行序列稀釋為：125、62.5、31.2515.625、738125、3.90625及1.953125μg/mL等濃度，再以ELISA進行抗體抗原反應偵測，結果如第六圖所示。

由第六圖之結果明確顯示於THLW抗體於上述濃度範圍內，係與THLW胜肽具有良好之線性關係。

實例五：收集唾液檢體

分別自健康受試者及口腔癌患者收集唾液檢體，其中，唾液檢體收取前一小時內應禁止任何飲食。收集後之唾液樣本內加入酵素抑制劑，並且於4℃、3000 rpm 下進行離心，取其上清液以供後續實例之用。

實例六：蛋白質濃度測定

本實例係以BCA分析法來測定唾液檢體中之蛋白質濃度。

首先，以最終濃度為2、1.5、1、0.5、0.25 mg/mL之BSA標準品建立蛋白質濃度之標準曲線，如第七圖所示。

將確診罹患口腔癌患者所提供之唾液檢體以1/2稀釋後，分別以BCA分析法定量出各檢體內總蛋白質濃度，如第八圖所示。

實例七：生物感測器

取市售CM5感測晶片，先以EDC/NHS活化晶片表面，再將生物辨識物以一預定濃度共價鍵結於晶片表面，待完成生物辨識物之接附後，以EA遮蔽剩餘活化部位。藉此獲得感測晶片。

於本實例中，取THLW胜肽、THLW抗體、E6蛋白、抗E6蛋白抗體作為生物辨識物製備出感測晶片。而於製備感測晶片前，先以PH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5之醋酸鈉溶液測試鍵結條件，確定能獲得最大鍵結量者為PH值為3.5，即於該條件下進行生物辨識物之鍵結。此外，於本實例中，THLW胜肽之濃度係為3.3μM、THLW抗體之濃度係為0.2μg/mL；E6蛋白之濃度為0.03μg/mL；抗E6蛋白抗體之濃度為10 μg/mL。

實例八：以感測晶片進行檢測（一）

取來自12位口腔癌受試者及10位健康受試者之唾液檢體。將各唾液檢體分別進行2倍及8倍稀釋後，再分別與E6蛋白感測晶片進行反應，結果如第九圖及第十圖所示。

由第九圖結果顯示，口腔癌唾液檢體中之物質會與E6蛋白產生較大之交互作用力，約2300RU（Response unit），亦即口腔癌受試者之唾液檢體中係存在會與E6蛋白交互作用之蛋白質。由此可推知口腔癌患者應被HPV 16型病毒感染，其體內已產生抗E6蛋白之抗體。

再者，由第十圖之結果顯示，雖然健康受試者及口腔癌受試者之唾液檢體之感測曲線皆會隨著時間上升，惟，基於口腔癌受試者之唾液檢體中具有與E6蛋白產生交互作用之物質，因此，其上升幅度係明顯高於健康受試者。

由上可知，當受試者感染HPV 16型病毒且由其唾液檢體中檢測出E6蛋白時，該受試者係為罹患口腔癌之高風險族群。換言之，透過偵測唾液檢體之反應得推測檢體提供者是否具有罹患口腔癌之風險。

實例九：以感測晶片進行檢測（二）

將來自24位罹患口腔癌第四期患者之唾液檢體，稀釋2倍後，分別與THLW胜肽感測晶片及E6蛋白感測晶片進行反應，並且分別偵測其感應圖，結果如第十一圖及第十二圖所示。

請參第十一圖，由於部份唾液檢體中之物質與E6蛋白具有較大交互作用力，顯示該等檢體內係具有對應E6蛋白之抗體。據此可推知，提供該等檢體之口腔癌患者係具有感染HPV 16型病毒之高度可能性，使E6蛋白於體內產生免疫反應，始會於檢體內檢測出E6蛋白相對應之抗體之存在。

比對第十一圖及第十二圖，於第十二圖中大部分唾液樣本中之物質與THLW胜肽間之交互作用力係與第十一圖相似，顯示本發明所揭THLW胜肽應能取代E6蛋白，成為預測罹患口腔癌風險之生物標幟物。

實例十：以感測晶片進行檢測（三）

先利用THLW與稀釋3倍之各該唾液樣本預先混合1小時後，再分別與THLW胜肽感測晶片反應，結果如第十三圖所示，顯示含有本發明所揭THLW胜肽之感測晶片的訊號穩定。

由此可知，本發明所揭THLW胜肽係能有效地作為檢測口腔癌罹患風險之生物標幟物。

實例十一：以感測晶片進行檢測（四）

將來自24位患者之唾液檢體，稀釋1/2後，分別與THLW抗體感測晶片進行反應，偵測結果如第十四圖所示。

由第十四圖之結果可知，受HPV 16型病毒感染之患者所提供唾液中係具有能與THLW抗體反應之物質，因而會與THLW抗體間產生較大之交互作用力而被偵測到。

換言之，藉由本案所揭THLW抗原所製備之THLW抗體係能用於預測樣品提供者是否為罹患口腔癌之高風險族群。

實例十二：競爭型ELISA

將純化之THLW胜肽（0.2mg/mL）固定於孔盤上，並以序列稀釋之THLW胜肽作為抗原，並且與濃度為125μg/mL之THLW抗體預先混合競爭，建立出標準競爭曲線圖，如第十五圖所示。

由第十五圖之結果可知，15.625～62.5μg/mL之濃度區間中具有明顯之濃度相關性，顯示未來本標準曲線應可應用於定量此濃度區間之目標蛋白質，換言之，可用於換算樣本中正確抗原之含量。

實例十三：THLW抗體親和力分析

分別使用序列濃度稀釋之 THLW抗體及抗E6單株抗體作為分析物，最高濃度為 10.00μg/mL，分別序列稀釋成 5.00 μg/mL、3.33 mg/mL、2.50 mg/mL、2.00 mg/mL及1.66μg/mL等濃度後，與固定於晶片之 E6 蛋白作用，並進行偵測，結果如第十七圖及第十六圖所示。而後，使用「一對一結合模式（1:1 binding）」進行動力學分析，結果如下表一及二所示。

表一：固定有 E6 蛋白之感應晶片與不同濃度抗E6單株抗體之動力學分析 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 結合速率k_a (1/Ms) </td><td> 解離速率常數 k_d (1/s) </td><td> 平衡解離常數 K_D (M) </td><td> Rmax (RU) </td><td> tc </td><td> Chi² (RU²) </td></tr><tr><td> 1.103 × 10⁴</td><td> 0.03205 </td><td> 2.905 × 10^-4</td><td> 1.152 × 10⁴</td><td> 7.328 × 10⁵</td><td> 3.90 </td></tr></TBODY></TABLE>

表二：固定有 E6 蛋白之感應晶片與不同濃度THLW抗體之動力學分析 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 結合速率k_a (1/Ms) </td><td> 解離速率常數k_d (1/s) </td><td> 平衡解離常數K_D (M) </td><td> Rmax (RU) </td><td> tc </td><td> Chi² (RU²) </td></tr><tr><td> 340.6 </td><td> 1.191 × 10^-4</td><td> 3.497 × 10^-7</td><td> 1385 </td><td> 8.020 × 10⁶</td><td> 0.524 </td></tr></TBODY></TABLE>

由第十六圖及第十七圖之結果可知抗E6單株抗體及THLW抗體皆會使RU 變化，並且，隨著抗體之濃度越高，ΔRU 也有上升的趨勢。

更進一步地，將晶片流經各濃度之抗E6單株抗體或THLW抗體時所達到之最高 ΔRU 與其濃度進行分析，結果如第十八圖及第十九圖所示，並且，親和力分析結果如表三所示。

表三：固定有 E6 蛋白之感應晶片與不同濃度之抗體間之親和力分析 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 抗體 </td><td> 抗E6單株抗體 </td><td> THLW抗體 </td></tr><tr><td> K_D (M) </td><td> 1.091 × 10^-6</td><td> 1.753 × 10^-7</td></tr><tr><td> Rmax (RU) </td><td> 621.7 </td><td> 52.94 </td></tr><tr><td> offset (RU) </td><td> -11.11 </td><td> -6.557 </td></tr><tr><td> Chi² (RU²) </td><td> 1.40 </td><td> 0.288 </td></tr></TBODY></TABLE>

由上述結果可知，本發明所揭THLW胜肽之抗體係與HPV病毒間具有良好之親和力，並且，效果係與抗E6單株抗體相近，因此，本發明所揭THLW抗體係能作為檢測口腔癌風險之工具。

實例十四：THLW抗體結和力分析

蒐集非口腔癌患者（11位）之檢體與口腔癌患者（5位）之檢體，並且依據下列條件進行分組：第一組係為空白組，僅有磷酸鹽緩衝液；第二組係將非口腔癌患者之檢體以磷酸鹽緩衝液進行1/2稀釋；第三組係為將口腔癌患者之檢體以磷酸鹽緩衝液進行1/2稀釋；第四組係將口腔癌患者之檢體加入等體積之0.01μg/mLE6蛋白；第五組係將口腔癌患者之檢體加入等體積之0.16μg/mLE6蛋白；第六組係將口腔癌患者之檢體加入等體積之0.5μg/mLE6蛋白。

分別將THLW抗體及抗E6單株抗體固定於晶片上，用以測試各組檢體之RU 值變化及感應結果，結果如第二十圖至第二十三圖所示。

由第二十圖至第二十三圖之結果可知，不論以抗E6單株抗體或THLW抗體進行檢測時，第二組之RU變化值係明顯低於第三組之RU變化值，亦即本發明所揭THLW抗體確實能夠透過RU值之變化達到判斷檢體提供者之口腔癌風險。再者，由上述結果中之第四組至第六組之結果可知，當晶片上設計抗E6蛋白抗體時，對於檢體內HPV病毒含量之變化較無法檢測出來，並且，所偵測到之RU值變化值係相近於第二組，因而容易造成罹患口腔癌風險評估之誤判，相對來說，本發明所揭THLW抗體對於檢體中細微病毒量之變化仍具有檢測效果，亦即本發明所揭THLW抗體相較於抗E6單株抗體係具有更高之靈敏度及專一性。

又，由上述結果可知，當所檢測到之RU變化值低於40時，樣本提供者罹患口腔癌之風險為低，而當檢測到之RU變化值高於100時，樣本提供者被HPV病毒感染之機會為高，因此具有罹患口腔癌高風險。

由上述實例之結果係可知本發明所揭SEQ ID No.1所示THLW胜肽係能作為檢測與HPV病毒感染相關疾病之生物標幟物，更進一步來說，THLW胜肽及抗THLW胜肽之抗體係得用以作為體外檢測口腔癌罹患風險之工具。此外，透過將本發明所揭THLW胜肽或/及THLW抗體結合如生物感測器、生物晶片等檢測工具，或是如免疫酵素分析之技術，可以達到於臨床上簡便且快速判斷口腔癌離癌風險之功效。

無

第一圖係為THLW胜肽粗產物之質譜圖。 第二圖係為THLW胜肽粗產物之RP-HPLC層析圖。 第三圖係為純化之THLW胜肽之質譜圖。 第四圖係為純化之THLW胜肽之RP-HPLC層析圖。 第五圖係為檢測THLW胜肽與THLW抗體間反應之結果。 第六圖係為分析THLW胜肽與THLW抗體間反應之結果。 第七圖係為以BSA標準品所建立蛋白質濃度之標準曲線。 第八圖係為檢測各唾液檢體中總蛋白質濃度之結果。 第九圖係為各唾液檢體2倍稀釋後以E6蛋白感測晶片檢測其反應後之結果。 第十圖係為各唾液檢體8倍稀釋後以E6蛋白感測晶片檢測其反應後之結果。 第十一圖係為各唾液檢體2倍稀釋後與E6蛋白感測晶片反應之結果。 第十二圖係為各唾液檢體2倍稀釋後與THLW胜肽感測晶片反應之結果。 第十三圖係為各唾液檢體經處理後，進行2倍稀釋後與THLW胜肽感測晶片反應之結果。 第十四圖係為各唾液檢體2倍稀釋後與THLW抗體感測晶片反應之結果。 第十五圖係以THLW胜肽作為抗原，所建立之標準競爭曲線圖。 第十六圖係為固定 E6 蛋白之晶片與不同濃度之抗E6單株抗體之SPR感應譜。 第十七圖係為固定 E6 蛋白之晶片與不同濃度之THLW抗體之SPR感應譜。 第十八圖係以固定 E6 蛋白之晶片與不同濃度之抗E6單株抗體反應之結果。 第十九圖係以固定 E6 蛋白之晶片與不同濃度之THLW抗體反應之結果。 第二十圖係為抗E6單株抗體與唾液檢體間之結合力分析。 第二十一圖係為抗E6單株抗體與不同唾液檢體間反應後之RU值變化結果。 第二十二圖係為THLW抗體與唾液檢體間之結合力分析。 第二十三圖係為THLW抗體與不同唾液檢體間反應後之RU值變化結果。

＜110＞ 東海大學 臺中榮民總醫院 ＜120＞ 新穎胜肽、其抗體及以其評估口腔癌風險之方法 ＜130＞ 1 ＜160＞ 1 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ 人工設計 ＜400＞ 1 Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp 1 5 10 15 Gly Asn Pro

Claims (12)

1. 一種THLW胜肽，其胺基酸編碼係為SEQ ID No.1。
2. 依據申請專利範圍第1項所述THLW胜肽，其係為與HPV病毒相關疾病之生物標幟物。
3. 依據申請專利範圍第2項所述THLW胜肽，其中，與HPV病毒相關疾病係為口腔癌。
4. 一種檢測罹患口腔癌風險之方法，其係以申請專利範圍第1項所述THLW胜肽與一唾液檢體進行反應，當該檢體與該胜肽間有反應時，表示該唾液檢體中含有能與THLW胜肽交互作用之物質。
5. 依據申請專利範圍第4項所述方法，其中，該THLW胜肽係鍵結於一生物晶片上。
6. 一種檢測罹患口腔癌風險之方法，其包含下列步驟：步驟a：製備抗如申請專利範圍第1項所述THLW胜肽之抗體；步驟b：以步驟a之抗體與一唾液檢體進行反應，當該唾液檢體與該抗體間之作用力變化量高於一第一預定數值時，顯示該唾液檢體內含有HPV病毒，並且，該唾液檢體提供具有罹患口腔癌之高風險；而當該唾液檢體與該抗體間之作用力變化量低於一第二預定數值時，顯示該唾液檢體提供具有罹患口腔癌之低風險，其中，之該第一預定數值係為100RU，該第二預定數值係為40RU。
7. 依據申請專利範圍第6項所述方法，其中，該抗體係鍵結於一生物晶片上。
8. 一種評估口腔癌預後或治療方針之方法，其係以申請專利範圍第1項所述THLW胜肽與一唾液檢體進行反應，當該唾液檢體與該胜肽間有反應時，表示該檢體中仍含有能與THLW胜肽交互作用之物質，而能得知該唾液檢體提供者預後較差或是所使用之治療方針為無效。
9. 依據申請專利範圍第8項所述方法，其中，該THLW胜肽係鍵結於一生物晶片上。
10. 一種評估口腔癌預後或治療方針之方法，其包含下列步驟：步驟a：製備抗如申請專利範圍第1項所述THLW胜肽之抗體；步驟b：以步驟a之抗體與一唾液檢體進行反應，當該唾液檢體與該抗體間之作用力變化量高於一第一預定數值時，顯示該唾液檢體內含有HPV病毒，並且，該唾液檢體提供者預後較差或是所使用之治療方針為無效；而當該唾液檢體與該抗體間之作用力變化量低於一第二預定數值時，顯示該唾液檢體提供者預後較佳或是所使用之治療方針為有效，其中，該第一預定數值係為100RU，該第二預定數值係為40RU。
11. 依據申請專利範圍第10項所述方法，其中，該抗體係鍵結於一生物晶片上。
12. 依據申請專利範圍第10項所述方法，其中，步驟b係以免疫酵素分析法分析該抗體與該唾液檢體間之反應。