CN108896761A - 一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡、检测盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡，包括胶板，在胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，层析膜上设有检测区和质控区，金标垫上吸附有胶体金标记的抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的小鼠多抗，在检测线上吸附有抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的兔多抗。采用本发明的检测卡或检测盒能快速灵敏的检测马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白抗原的存在，明确检测对象是否被马尔尼菲蓝状菌感染；本发明的检测卡或检测盒灵敏度高，特异性强，检测速度快，5分钟内即可得出检测结果，操作十分简单。

Description

一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡、检测盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及马尔尼菲蓝状菌检测技术领域，尤其是一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡、检测盒及其制备方法。

背景技术

马尔尼菲青霉菌(PM)又名马尔尼菲蓝状菌，本种是双相真菌，可引起马尔尼菲蓝状菌病(PSM)，是一种少见的深部真菌感染的全身性疾病。马尔尼菲蓝状菌感染者尤以中国南部和东南亚地区居多。马尔尼菲蓝状菌病可发生于健康者，但更多见于免疫缺陷或免疫功能抑制者。越南研究结果显示PSM在AIDS患者的机会性感染中居第3位。随着HIV感染者日见增多，马尔尼菲青霉菌病报道也逐年增加。

PM多侵犯免疫功能低下的患者，主要是侵犯单核吞噬细胞系统，即肺、肝、肠淋巴组织、淋巴结、脾、骨髓、肾和扁桃体等，以肺及肝最为严重。PM能侵入机体，在营养丰富的深部组织器官生长繁殖，造成致命损伤，主要累及单核-巨噬细胞系统，常播散全身，病死率高，是一种严重的深部真菌病。

对马尔尼菲蓝状菌病进行早期干预治疗是完全可以治愈的，可应用两性霉素B、氟胞嘧啶、唑类药物进行系统治疗，但由于发病隐匿，早期不为患者重视，极易误诊而延误治疗，致使病情危重而威胁生命。

甘露聚糖蛋白(Mp1p)是马尔尼菲蓝状菌细胞壁特异性多糖抗原，应用于PSM感染检测方面具有良好前景。有研究结果表明血清Mp1p抗原检测具有高度特异性和敏感性，可用于快速检测PSM病。免疫胶体金技术是一种POCT检测技术，以胶体金作为显色标志物。胶体金颗粒在弱碱环境下带负电，可与蛋白质分子等带正电基因静电结合，同时不影响其生物特性，从而可以与待检物(抗体、抗原、小分子等)进行特异性结合，从而实现相应待检分子的快速检测。

目前市场上尚无临床注册批准的马尔尼菲蓝状菌诊断产品，因此，在马尔尼菲蓝状菌临床诊断领域，迫切需要一种诊断试剂产品。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种快速有效的马尔尼菲蓝状菌的检测卡。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的小鼠多克隆抗体。其中，所述胶板优选为硬质的聚氯乙烯底板；所述层析膜优选为硝酸纤维素膜。

优选地，所述检测区包被有抗马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。应当说明的是，本申请的发明人经过多次试验发现，在检测马尔尼菲蓝状菌时，采用甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体作为捕获抗体，其检测灵敏度明显优于采用相应的鼠多克隆抗体。优选地，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。

优选地，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体。

优选地，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

优选地，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。更优选地，所述预处理缓冲液的浓度为10-100mM。由此，检测卡的准确率更高。

优选地，所述预处理缓冲液中还含有表面活性剂；更优选地，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种；更优选地，所述表面活性剂的浓度为5-100g/L。

优选地，所述预处理缓冲液中还含有反应增强剂，所述反应增强剂选自蔗糖、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为5-100g/L。

为了使检测卡具有更佳的灵敏度和效果，所述金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：蔗糖、葡萄糖、氯化钠、氯化钾和甘氨酸中的任意一种或多种的组合；其中，表面活性剂的浓度优选为3-20g/L，预处理缓冲液的pH优选为7.0-7.6。更优选地，所述预处理缓冲液中各组分的浓度为葡萄糖1-4g/L、氯化钠0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L和甘氨酸1-4g/L。

优选地，所述金标垫的预处理方法为：将金标垫在预处理缓冲液中浸泡1-3h后取出，于25-38℃烘干。应当说明的是，所述预处理缓冲液的pH值可采用本领域各种常用的pH调节试剂进行调节。

在第二个方面，本发明提供了一种马尔尼菲蓝状菌的检测盒，包括盒体，所述盒体内设有上述的检测卡，所述盒体的表面设有加样孔和观察窗，所述加样孔下方为所述样品垫，所述观察窗的下方为所述层析膜。优选地，所述盒体内设有检测卡卡槽。应当说明的是，本发明的检测卡或检测盒可用于定性检测血液/脑脊液样品中的马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白。

在第三个方面，本发明提供了上述检测盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用胶体金标记抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的鼠多克隆抗体溶液喷涂金标垫，制备包含抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的鼠多克隆抗体的金标垫；

2)在检测线上喷涂抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的兔多克隆抗体，在质控线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的层析膜；

3)将样品垫、步骤1)所得金标垫、步骤2)制备的层析膜、吸水垫依次粘贴在胶板上，通过切裁制得检测试纸卡，然后装入盒体制得所述检测盒。

综上所述，本发明的有益效果为：

采用本发明的检测卡或检测盒能快速灵敏的检测马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白抗原的存在，明确检测对象是否被马尔尼菲蓝状菌感染；本发明的检测卡或检测盒灵敏度高，特异性强，检测速度快，5分钟内即可得出检测结果，操作十分简单。

附图说明

图1为本发明的检测卡的结构示意图；

图2为本发明的检测盒的结构示意图；

其中，1、胶板，2、样品垫，3、金标垫，4、层析膜，5、第一吸水垫，6、第二吸水垫，7、检测区，8、质控区，9、检测线，10、质控线，11、盒体，12、加样孔，13、观察窗，14、卡槽。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂或材料均可以从市场上或其它公众渠道获得。

实施例1

如图1所示，本发明的马尔尼菲蓝状菌检测卡的一种实施例，包括胶板1，在胶板1上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫2、金标垫3、层析膜4和第一吸水垫5，层析膜4和胶板1之间设有第二吸水垫6，层析膜4上设有检测区7和质控区8，检测区7设于样品垫2和质控区8之间，金标垫3上吸附有胶体金标记的抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的鼠多克隆抗体；检测区包被有抗马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体，或者检测区7的靠近样品垫的一侧设有检测线9，检测线9上包被有马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体；质控区8包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，或者质控区8的靠近样品垫2的一侧设有质控线10，质控线10上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；胶板1为硬质的聚氯乙烯底板；层析膜4为硝酸纤维素膜；

其中，样品垫2采用第一预处理缓冲液处理，预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种，第一预处理缓冲液的浓度为10-100mM；第一预处理缓冲液还含有表面活性剂；表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种；

金标垫3采用第二预处理缓冲液处理，预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种，第二预处理缓冲液的浓度为10-100mM；第二预处理缓冲液中还含有表面活性剂；表面活性剂含有TritonX-100、Tween-20、和Tween-80中的至少一种；表面活性剂的浓度为5-50g/L；第二预处理缓冲液中还含有反应增强剂，反应增强剂选自蔗糖、PEG8000和PEG20000中的任意一种，反应增强剂的浓度为5-100g/L；金标垫的预处理方法为：将金标垫在预处理缓冲液中浸泡1-3h后取出，于25-38℃烘干。

为了使检测卡具有更佳的灵敏度和效果，金标垫3可采用以下预处理缓冲液处理，其包括下列组分：葡萄糖1-4g/L、氯化钠0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L和甘氨酸1-4g/L；其中，表面活性剂的浓度为3-20g/L，预处理缓冲液的pH为7.0-7.6。

实施例2

如图2所示，本发明马尔尼菲蓝状菌检测盒的一种实施例，包括盒体11，盒体11内设有实施例1的检测卡，盒体11的表面设有加样孔12和观察窗13，加样孔12下方为样品垫(图中未示出)，观察窗13的下方为层析膜(图中未示出)，盒体11内设有检测卡卡槽14。

实施例3

本发明的马尔尼菲蓝状菌检测卡的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：

(1)多克隆抗体的制备

1)培养马尔尼菲青霉菌，收集菌体，反复冻融3次，然后再用超声法破碎菌体，酚/氯仿法提取总DNA。

2)Mp1p片段的克隆表达及蛋白片段纯化：设计一对引物PCR扩增，上游引物5’-ACTGGATCCTTATCCTCCCTCGTCGTCC-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物5’-GCAAGCTTCTCCTGTTGCCTAAGATTGTTCT-3’(SEQ ID NO.2)，55度退火，PCR扩增Mp1p基因片段。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定并纯化。HindIII/BamHI双酶切，连接质粒pET-30a。转化到感受态大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达，表达产物为GST-Mp1p融合蛋白(Mp1p抗原)，亲和层析法纯化。

3)免疫小鼠。采用弗氏完全佐剂，与Mp1p抗原完全乳化后，免疫6周龄BALB/c小鼠，分别于首次免疫后第14、21、28天进行3次加强免疫。在第35天拉颈处死小鼠，取全血分离血清，制备得到抗PM-Mp1p小鼠兔多克隆抗体。

4)免疫新西兰兔。采用弗氏完全佐剂，与Mp1p抗原完全乳化后，免疫2月龄新西兰兔，分别于首次免疫后第14、28、52天进行3次加强免疫。在末次免疫后第7天，取全血分离血清，制备得到抗PM-Mp1p兔多克隆抗体。

5)抗PM-Mp1p小鼠多克隆抗体经兔血清蛋白吸附处理，降低与兔血清的交叉反应。

(2)胶体金标记抗PM-Mp1p小鼠多克隆抗体

采用经典的三氯金酸-柠檬酸三纳法制备胶体金，粒径为35nm，pH为6.6；

然后以抗PM-Mp1p(马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白)小鼠多克隆抗体包被胶体金，包被浓度为0.1mg/mL，离心分离出游离的胶体金粒子，之后以原体积1/5的磷酸缓冲液重新悬浮(含1mg/mL PEG6000,5％蔗糖，10mM pH7.2)。

(3)马尔尼菲蓝状菌Mp1p抗原免疫胶体金检测卡的制备

1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，将金标垫浸于金标垫预处理缓冲2小时，取出置于37度烘干，金标垫预处理缓冲液为磷酸盐缓冲液，10mMpH7.4，含氯化钠0.2g/L、甘氨酸2.5g/L。

2)然后用步骤(1)制备的胶体金标记的抗PM-Mp1p小鼠多克隆抗体溶液喷涂经过预处理的金标垫，喷涂量为3μL/cm²，制备得到金标垫。

3)在硝酸纤维素膜(即层析膜)的检测线和质控线上分别喷涂0.3mg/mL的抗PM-Mp1p兔多克隆抗体和1.2mg/mL羊抗鼠IgG抗体溶液，喷涂量为1μL/cm²，制备得到硝酸纤维素膜。

4)将样品垫、制备的金标垫、硝酸纤维素膜、和吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切裁制得3-5mm宽的如图1所示的检测卡；将所得检测卡装入盒体得到如图2所示的检测盒。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种马尔尼菲蓝状菌的检测卡，其特征在于，包括胶板，在所述胶板上按照样品流动方向，依次设有首尾相接的样品垫、金标垫、层析膜和第一吸水垫，所述层析膜和所述胶板之间设有第二吸水垫，所述层析膜上设有检测区和质控区，所述金标垫上吸附有胶体金标记的抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的小鼠多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述检测区包被有抗马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体，所述质控区包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的检测卡，其特征在于，所述检测区设于所述样品垫和质控区之间。

4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述检测区的靠近所述样品垫的一侧设有检测线，所述检测线上包被有马尔尼菲蓝状菌的甘露聚糖蛋白兔多克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述质控区的靠近所述样品垫的一侧设有质控线，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述样品垫或/和金标垫采用预处理缓冲液处理，所述预处理缓冲液含有甘氨酸液、Tris-Cl缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的检测卡，其特征在于，所述预处理缓冲液中还含有表面活性剂。

8.根据权利要求7所述的检测卡，其特征在于，所述表面活性剂含有PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG20000、Triton X-100、Triton X-305、Tween-20、Tween-60、Tween-80和SPAN-20中的至少一种。

9.一种马尔尼菲蓝状菌的检测盒，其特征在于，包括盒体，所述盒体内设有权利要求1～8任一项所述的检测卡，所述盒体的表面设有加样孔和观察窗，所述加样孔下方为所述样品垫，所述观察窗的下方为所述层析膜。

10.权利要求9所述的检测盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用胶体金标记抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的小鼠多克隆抗体溶液喷涂金标垫，制备包含抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的小鼠多克隆抗体的金标垫；

2)在检测线上喷涂抗马尔尼菲蓝状菌甘露聚糖蛋白的兔多克隆抗体，在质控线上喷涂羊抗鼠IgG多克隆抗体，制得包被后的层析膜；

3)将样品垫、步骤1)所得金标垫、步骤2)制备的层析膜、吸水垫依次粘贴在胶板上，通过切裁制得检测试纸卡，然后装入盒体制得所述检测盒。