DE60107284T2

DE60107284T2 - Diagnostisches verfahren zur erkennung von bakterieller vaginose auf basis der bestimmung von anti-gardnerella-vaginalis-gvh-toxin antikörpern

Info

Publication number: DE60107284T2
Application number: DE60107284T
Authority: DE
Inventors: Sabina Cauci
Original assignee: UNIBIO Srl
Current assignee: UNIBIO Srl
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2021-02-16
Also published as: EP1336106A1; ATE282829T1; DE60107284D1; EP1336106B1; WO2002065130A1; US20040101918A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Pathologien in Zusammenhang mit der Besiedelung mit Bakterium Gardnerella vaginalis bei Frauen.
Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des Risikos von Pathologien bei Frauen, die eine Besiedelung mit Bakterium Gardnerella vaginalis aufweisen, wie zum Beispiel geringes Geburtsgewicht (LBW, low birth weight), Frühgeburt (PTD, preterm delivery), vorzeitiger Blasensprung (Membransprung), Amnioninfektionen, Spontanabort, Endometritis, Infektionen post partum oder nach gynäkologischen Eingriffen, Infektionen des oberen Genitaltrakts (PID), die zur Unfruchtbarkeit führen, Cervicitis, Anfälligkeit für sexuell übertragbare Krankheiten wie Virusinfektionen durch den Papillomavirus (HPV) oder den Immundefektvirus des Menschen (HIV, human immunodeficiency virus).
Diese Erfindung beruht auf einem Verfahren umfassend die Isolierung des von G. vaginalis produzierten hämolytischen Toxins Gvh in einem Kulturmedium und seine Verwendung zur Bestimmung des Vorhandenseins entsprechender Antikörper in einer Körperflüssigkeit.
Ein geringes Geburtsgewicht (LBW), das primär durch Frühgeburt (PTD) bedingt ist, ist der Hauptrisikofaktor für neonatale Morbidität, Sterblichkeit und neurologische Langzeitstörungen beim Kind.
Die meisten Fälle von geringem Geburtsgewicht weisen keine erkannten Ursachen auf, was derzeitige Vorbeugestrategien uneffektiv macht. Verschiedene Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass bakterielle Vaginose (BV) mit Frühgeburt (PTD) in Verbindung steht, wobei im Vergleich zu Fällen ohne BV ein um 1,4-fach bis 6,9-fach relativ erhöhtes Risiko für Frühgeburt untergewichtiger Kinder, frühe und späte Fehlgeburten und allgemein mit Komplikationen bei der Mutter besteht.
Außerdem wurde unlängst demonstriert, dass bakterielle Vaginose mit einem erhöhten Risiko für sexuelle Übertragung von Virusinfektionen durch HIV und vertikale Übertragung von HIV über die Mutter auf ihr Kind in Zusammenhang steht. Das Vorkommen bakterieller Vaginose beträgt ungefähr 10 % bei nicht schwangeren Frauen und ungefähr 15 bei Schwangeren in Westeuropa, 10 bis 30 % bei Schwangeren in den USA und über 30 % bei aus Afrika stammenden farbigen Frauen, über 60 % bei Frauen, die Kliniken für sexuell übertragbare Krankheiten aufsuchen. Jedenfalls ist anzumerken, dass unter den Personen mit erhöhtem Risiko einer HIV-Virusexposition nur ein geringer Prozentsatz der Frauen mit BV negative Schwangerschaftskomplikationen aufweisen oder eine HIV-Infektion aufgreifen, so dass selektive Marker zur Erkennung von Patienten mit erhöhtem Risiko und die therapeutisch behandelt werden müssen, erforderlich sind.
Bakterielle Vaginose wird durch verschiedene Bakterienarten ausgelöst umfassend G. vaginalis, Bacteroides spp., Prevotella spp. und Mobiluncus spp., Ureaplasma urealyticum und Mycoplasma hominis. Die Pathogenese bakterieller Vaginose ist noch unklar und nicht immer ist das Vorliegen eines pathologischen Zustands leicht diagnostizierbar. Insbesondere ist nicht bekannt, was die Verschiebung von der normalen Lactobazillenbesiedelung zur veränderten Vaginalflora auslöst, noch in welchem Grad die Veränderung der mikrobiologischen Vaginalflora einen echten pathologischen Zustand anzeigt.
Ein kritischer Punkt bei der bakteriellen Vaginose ist die Synergie zwischen G. vaginalis und anaeroben Bakterien.
Bei mehr als 95 % der Fälle von bakterieller Vaginose wird G. vaginalis in hohen Konzentrationen gefunden, während niedrige G. vaginalis Besiedlungskonzentrationen auch bei Frauen ohne bakterielle Vaginose gefunden werden.
Es wurde jedoch eine strenge Korrelation zwischen der Besiedlung mit G. vaginalis und dem Zustand bakterieller Vaginose demonstriert.
Der einzige vollständig charakterisierte Virulenzfaktor, der von G. vaginalis freigesetzt wird, ist ein β-hämolytisches Toxin (Gvh), das ein Molekulargewicht von ungefähr 59.000 Dalton aufweist.
Es wurde gezeigt, dass ungefähr die Hälfte der nicht schwangeren Frauen eine Immunantwort gegen Gvh entwickeln, was IgA-Antikörper in der Vaginalschleimhaut hervorruft. Das Fehlen von anti-Gvh IgA-Antikörpern bei nicht schwangeren Frauen mit BV ist hauptsächlich durch die Inaktivierung von IgA bedingt und dieses Phänomen steht mit dem Vorhandensein hoher Werte an Vaginalsialidaseaktivität in Zusammenhang. Solche Inaktivierung ist aus der strukturellen Beeinträchtigung von IgA abgeleitet, die wahrscheinlich durch hydrolytische Wirkung einer Anzahl von Faktoren bedingt ist, die von anaeroben Bakterien freigesetzt werden.
Derzeit ist nicht bekannt, welche Faktoren der antimikrobiellen Verteidigung beeinträchtigt werden oder welcher) mikrobiellen Virulenzfaktor(en) die IgA-Spaltung in einer Untergruppe von Frauen mit bakterieller Vaginose hervorrufen.
Es ist noch nicht bestätigt, ob dieser Zustand mit einem erhöhten Risiko für BV-Komplikationen in Verbindung steht.
Das AMERICAN JOURNAL OF OBSTETRIC AND GYNECOLOGY, Band 178, Nr. 3, März 1998 (1998–03), Seiten 511–515 beschreibt die Korrelation zwischen der IgA-Immunantwort auf Garnerella vaginalis Hämolysin- und Sialidaseaktivität in Vaginalflüssigkeiten. Es wurden durch ELISA mit von gereinigtem Toxin von Garnerella vaginalis bedeckten Mulden Antihämolysin-IgA-Werte erfasst. Außerdem kann die Sialidaseaktivität ein wertvoller diagnostischer Marker zur Vorhersage der Schwere der Erkrankung sein. Es sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig, um aufzuzeigen, ob die Sialidaseaktivität ein diagnostischer Marker sein kann.
Das JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASE, Band 178, Nr. 6, Dezember 1998 (1998–12), Seiten 1698–1706 offenbart eine Korrelation zwischen dem IgA-Abbau und dem Fehlen einer Immunantwort auf Cytolysin von Garnerella vaginalis. Das Ausmaß des IgA-Abbaus korreliert auch mit dem Sialidaseaktivitätswert. Patientinnen mit bakterieller Vaginose mit hoher Sialidaseaktivität und starkem IgA-Abbau in ihren Sekreten könnten gefährlichere Infektionen entwickeln und negative Schwangerschaftsfolgen. Bei allen Frauen wurde IgG als intakt gefunden. Ebenso wurde die Prolidaseaktivität gemessen. Außerdem wurde der pH von Vaginalsekreten gemessen. Es sind jedoch wiederum weitere Untersuchungen notwendig, um zu bestätigen, ob Patientinnen ein Risiko für Komplikationen aufweisen und so Frauen identifizieren, die tatsächlich Behandlung benötigen.
Eine solch unsichere Definition stellt Kliniker vor das Problem, ob sie bei Frauen mit bakterieller Vaginose eine pharmakologische Therapie verabreichen sollen. Es ist bekannt, dass zwei verschiedene Arzneistoffe zur Behandlung von bakterieller Vaginose verwendet werden, Metronidazol und Clindamycin. Diese beiden Arzneistoffe zeigen einen Nachteil, der in negativen Nebenwirkungen besteht, insbesondere kann Metronidazol gastrointestinale Symptome ergeben und wird als teratogener Stoff be trachtet, so dass er nicht während der Schwangerschaft empfohlen wird, andererseits kann Clindamycin Diarrhoe verursachen und Pseudomembrankolitis, die tödlich sein kann. Außerdem können solche Antibiotika Hefepilzvaginitis verursachen.
Aus den oben beschriebenen Gründen ist es in hohem Maße wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, um das Risiko pathologischer Komplikationen bei Frauen mit einer Besiedelung durch Bakterium G. vaginalis zu bestimmen, wie zum Beispiel geringes Geburtsgewicht oder Frühgeburt, Spontanabort, Endometritis, Ansteckung mit HIV-Infektion, Ansteckung mit HPV-Infektion (was cervikale Intraepithelneoplasien verursacht), Infektionen des oberen Genitaltrakts (PID), Infektionen post partum oder nach gynäkologischen Eingriffen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein zuverlässiges Verfahren zur Lösung des Problems der Risikobestimmung der oben beschriebenen Komplikationen zur Verfügung, auf eine Weise, die den Arzt mit einem wertvollen Werkzeug zur Entscheidung ausstattet, ob eine pharmakologische Therapie gegeben werden soll oder nicht.
Ein solches Problem wird durch ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Pathologien gelöst, wie es im beigefügten Hauptanspruch dargestellt ist.
Weitere Merkmale und Vorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen herausgestellt, die zur Erläuterung und nicht als Einschränkung angegeben sind.
Zur Erstellung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurden klinische Fälle untersucht und mit Kontrollen verglichen.
Insbesondere wurden 116 Frauen, die Babies mit geringem Geburtsgewicht (LBW) hatten, 86 Frauen, die eine Frühgeburt (PTD) hatten, und 417 Frauen, die Babies mit normalem Geburtsgewicht am Geburtstermin (NTD) hatten, untersucht.
Das Vorhandensein von G. vaginalis und die Werte von Anti-Gvh-IgA wurden in den Vaginalflüssigkeiten aller dieser Frauen bestimmt.
Insbesondere wurden die Vaginalflüssigkeitsproben von Frauen im ersten oder zweiten Trimester der Schwangerschaft genommen, bevorzugt im Zeitraum zwischen der 7. bis 24. Schwangerschaftswoche.
Die Gruppen von Frauen wurden ferner auf Grundlage des Vorhandenseins von G. vaginalis allein, G. vaginalis und einem pH-Wert gleich oder höher als 4,7, G. vaginalis und dem pathologischen Zustand bakterieller Vaginose (BV), G. vaginalis in Verbindung mit anaeroben Bakterien, G. vaginalis in Verbindung mit der „Bacteroides-Gruppe" und G. vaginalis in Verbindung mit anderen anaeroben Bakterien als Bacteroides, die „unspezifisch" genannt wurden, in den Vaginalflüssigkeitsproben unterteilt.
Bei der vorliegenden Beschreibung wird mit dem Ausdruck „Bacteroides-Gruppe" eine Untergruppe anaerober Bakterien angegeben, die die Isolate von Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp. und Stämmen der Gruppe Bacteroides fragilis umfassen. Mit dem Ausdruck „unspezifische" anaerobe Bakterien wird indessen eine Untergruppe von anaeroben Bakterien benannt, die alle anderen Anaeroben umfasst, wie zum Beispiel Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium und Veillonella.
In der folgenden Tabelle 1 wird der Zusammenhang zwischen der Anti-Gvh IgA-Antwort und geringem Geburtsgewicht (LBW) oder Frühgeburt (PTD) gezeigt.
Tabelle 1
In der oben gezeigten Tabelle 1 zeigen die Zahlen in Normaldruck die Prozentsätze an Frauen in jeder der zuvor definierten Gruppen an. Außerdem werden für jede der Gruppen die Prozentsätze an Frauen ohne oder mit geringen Werten an IgA und hohen Werten an IgA gegen das Toxin Gvh angegeben.
Indessen ist in Fettdruck das Verhältnis (Odds Ratio, OR) zwischen dem Prozentsatz an Frauen, die LBW oder PTD hatten, und dem Prozentsatz von Frauen mit NTD angegeben. Dieser Wert wurde mit einem Standardfaktor mittels des Computerstatistikprogramms SPSS berechnet und korrigiert.
Aus der Analyse der in Tabelle 1 angegebenen klinischen Daten ist es möglich, das relative Risiko für LBW oder PTD mit dem Wert an IgA und, in einem weiteren Schritt, mit der in der Körperflüssigkeit der Patientin vorhandenen Bakterienflora in Beziehung zu setzen.
In der Tat wird das relative Risiko für geringes Geburtsgewicht (LBW) oder einer Frühgeburt (PTD) durch das OR-Verhältnis bewertet.
Wenn dieses Verhältnis kleiner als 1 ist, bedeutet das, dass die Frau kein Risiko oder ein geringes Risiko für Komplikationen aufweist. Ein Verhältnis im Bereich von 1 bis 2 steht mit einem mittleren Risiko für Komplikationen in Verbindung. Wenn dieses Verhältnis zwischen 2 und 4 liegt, bedeutet das, dass die Frau ein hohes Risiko für Komplikationen aufweist. Wenn dieses Verhältnis höher ist als 4, bedeutet dies, dass die Frau ein sehr hohes Risiko für geringes Geburtsgewicht oder Frühgeburt aufweist.
Insbesondere und zum Beispiel bedeutet ein mittleres Risiko entsprechend einem OR-Wert gleich 2, dass die Patientin im Vergleich zu einer normalen Frau ein doppeltes Risiko für Komplikationen aufweist, das heißt mit anderen Worten ein 100 % höheres Risiko.
Bevorzugt kann dieses Ergebnis eine Wertung aufzeigen, worin: – ein geringes oder kein Risiko bedeutet, + ein mittleres Risiko bedeutet, ++ ein hohes Risiko bedeutet und +++ ein sehr hohes Risiko bedeutet.
Die oben gezeigte Tabelle 1 stellt heraus, dass das Risiko für ein geringes Geburtsgewicht oder eine Frühgeburt, unabhängig vom Vorhandensein anderer Bakterien als G. vaginalis und unabhängig vom Vorhandensein von BV pathologischen Zuständen, bei Frauen mit sehr hohen Werten an anti-Gvh IgA in der Vaginalfluidprobe im Wesentlichen fehlt oder sehr gering ist.
Als Folge davon ist das Vorhandensein hoher Werte an Anti-Gvh IgA ein Hinweis auf eine Schutzwirkung gegen diese Risiken. Dies erlaubt Patientinnen mit veränderter Bakterienflora zu isolieren, die keine therapeutische Behandlung benötigen. Ein solcher Befund ist von großer Bedeutung im Falle von Schwangeren und bei Patientinnen, die gegen Antibiotika allergisch sind.
Auf Basis dieser Untersuchungen und dieser Ergebnisse, wurde ein Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Pathologien bei Frauen mit einer Besiedelung durch das Bakterium G. vaginalis ausgearbeitet.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Pathologien bei Frauen, die eine Besiedelung mit Bakterium G. vaginalis aufweisen (und/oder mit bakterieller Vaginose, BV), die folgenden Schritte in der Reihenfolge:

a) Bestimmen der Menge an IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Antikörpern gegen das von G. vaginalis erzeugte Gvh-Toxin in einer Probe von Körperflüssigkeit;
b) Vergleich dieser Menge an IgA- und/oder IgG- und/oder IgM mit bestimmten Mengen an IgA- und/oder IgG- und/oder IgM, respektive;
c) Bestimmung des Risikofaktors.

Das Verfahren umfasst einen ersten Schritt zur Bestimmung biochemischer Daten und einen zweiten Schritt zum Vergleichen solcher Daten. Der erste Schritt besteht in der Bestimmung der Mengen an Antikörpern gegen das hämolytische Toxin Gvh, das vom Bakterium G. vaginalis produziert und in der Vaginalschleimhaut ausgeschieden wird.
Die Bestimmung der Mengen an anti-Gvh IgA wird nach irgendeiner geeigneten Immunenzymanalyse vorgenommen, wie zum Beispiel ELISA, RIA, Western-Blot-Analyse, Dotblot, Spottest, Dipstick, Immunicard, Quick Card.
Bevorzugt wurde bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ein ELISA-Test verwendet, wie er in Cauci et al., Am J Obstet Gynecol 1996; 175: 1601–5 beschrieben ist.
Dieser Test besteht im allgemeinen in der Inkubation in Tüpfelmulden mit einer festgelegten Quantität an gereinigtem Toxin, das in einem geeigneten Puffer bei Raumtemperatur gelöst wird. Die Mulden werden dann sauber gewaschen und erneut mit einer Substanz inkubiert, die in der Lage ist, die freien Bindungsstellen zu blockieren, die nach dem Beschichten mit dem Toxin verblieben sind. Danach wird ein festes Volumen einer in geeigneter Weise vorbereiteten Vaginalfluidprobe hinzugefügt und bei 37 °C inkubiert. Die Mulden werden dann erneut gewaschen und mit geeigneten anti-human IgA-Antikörpern inkubiert. Schließlich wird die quantitative Bestimmung durch Messung einer Farbentwicklung erhalten. Die Ergebnisse sind als millioptische Dichteeinheiten (mOD) angegeben.
Die Farbentwicklung wurde mittels des Paranitrophenylphosphatsubstrats erhalten, das nach Hydrolyse durch alkalische Phosphatase konjugiert mit anti-human IgA-Antikörper Paranitrophenol freisetzt.
Der zweite Schritt umfasst die Bestimmung des bei der Bewertung des Risikos zu berücksichtigenden Wertes.
Insbesondere wurde ein Cutoff-Wert von 390 mOD-Einheiten aus dem Mittelwert plus einer Standardabweichung berechnet in einer Referenzkontrollgruppe von gesunden Frauen bestimmt. Es wird angenommen, dass unter diesem Cutoff keine spezifische Immunantwort anti-Gvh IgA erfolgte, während Werte über oder gleich 390 mOD und unter 780 mOD (zweimal der erste Cutoff) als schwache Immunantwort betrachtet werden. Schließlich werden Werte über oder gleich 780 mOD als starke Immunantwort betrachtet.
Es ist damit ersichtlich, dass wenn eine Vaginalfluidprobe IgA-Werte über 780 mOD zeigt, bedeutet das, dass das Risiko für Schwangerschaftskomplikationen gering ist oder fehlt, ungeachtet des Vorhandenseins bestimmter Bakterien oder pathologischer Zustände bakterieller Vaginose, wie zuvor dargestellt.
Alternativ ist es möglich, andere Substanzen zu verwenden, um den Cutoff-Wert zu bestimmen, zum Beispiel 2-Nitrophenylphosphat oder die Kombination BCIP/NBT (5-Brom-4-chlor-3-inolylphosphat/Nitroblautetrazolium), das ein blau-violettes Hydrolyseprodukt entwickelt, oder 4-Methylumbelliferylphosphat, das ein blau fluoreszierendes Hydrolyseprodukt ergibt.
Außerdem kann alternativ das mit dem anti-human Ig-Antikörper konjugierte Enzym ein anderes sein als alkalische Phosphatase, wie zum Beispiel Peroxidase oder beta-Galactosidase und die Enzymaktivität wird mit einem geeigneten Substrat bestimmt.
Schließlich kann der anti-human Ig-Antikörper mit Biotin konjugiert werden, das durch Avidin konjugiert mit alkalischer Phosphatase oder Peroxidase oder beta-Galactosidase erfasst werden kann.
Bei allen diesen alternativen Verfahrensweisen wird der Cutoff durch Berechnung des Mittelwerts plus einer Standardabweichung berechnet, die aus einer gesunden Kontrollpopulation erhalten wurde, wobei der Wert, der eine hohe Antikörperantwort definiert, ein Wert vom zweifachen des ersten Cutoff ist.
Aus dem bisher beschriebenen ist ersichtlich, dass das Verfahren gemäß dieser Erfindung es ermöglicht, das Risiko für Pathologien aus der Identifizierung geringer oder fehlender Mengen an anti-Gvh IgA qualitativ zu bestimmen.
Mit Vorteil erlaubt das Verfahren dieser Erfindung ferner eine quantitative Bestimmung des Risikos. Diese Bestimmung beruht auf einer präzisen Risikobewertung, die die Proben berücksichtigt, bei denen geringe oder keine anti-Gvh IgA-Werte gefunden wurden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren einen Schritt zur pH-Bestimmung in Vaginalfluid umfassen. Der pH wird mittels bekannter Verfahren berechnet, wie zum Beispiel pH-Meter oder pH-Papierstreifen mit einem Umschlagsbereich von 4 bis 7.
Das Verfahren dieser Erfindung kann so nach der Phase b) die Bestimmung des pH der Probe und einen anschließenden Vergleich des erhaltenen Wertes mit einem festgelegten pH beinhalten.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, liegt der OR-Wert für einen pH-Wert gleich oder über 4,7 und geringe anti-Gvh IgA-Werte liegen im Bereich von 1 bis 2 sowohl für LBW wie PTD.
Als Folge davon ist, wenn die IgA-Werte unter 780 mOD liegen und der pH-Wert in der Vaginalfluidprobe gleich oder über 4,7 ist, gemäß dem Verfahren dieser Erfindung, das bewertete Risiko für PTD und für LBW mittel.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren unter Verwendung von Vaginalfluidproben von Frauen mit der Diagnose einer bakteriellen Vaginose (BV) durchgeführt werden.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, liegt der OR-Wert, entsprechend dem Fehlen oder geringen Werten an anti-Gvh IgA im Bereich von 2 bis 4 (2,1) für LBW und im Bereich von 1 bis 2 (1,0) für PTD.
Daraus folgt, dass das Verfahren der Erfindung nach Schritt b) die Bestimmung von Proben von Frauen mit BV umfassen kann.
Folglich ergibt sich gemäß dem Verfahren dieser Erfindung, wenn die von Frauen mit BV gewonnenen Vaginalfluidproben und wenn geringe oder keine IgA-Werte gefunden werden, ist das Komplikationsrisiko für PTD mittel und für LBW hoch.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren einen Schritt zur Bestimmung der Bakterienflora in Vaginalfluidproben von schwangeren Frauen mittels einer unter Verwendung von Routineverfahren durchgeführten mikrobiologischen Kultur umfassen, wie es den Fachleuten bekannt ist.
Die Bewertung des Risikos wird durch das Vorhandensein von anaeroben Bakterien allgemein und insbesondere der Bacteroides-Gruppe oder der unspezifischen anaeroben Bakteriengruppe durchgeführt.
Die unterschiedlichen Gruppen von Bakterien werden nach bekannten Verfahrensweisen isoliert (Thorsen et al., Am J Obstet Gynecol 1998; 178: 580–7 – Lautrop et al. FADL's forlag, Copenhagen, Dänemark, 1979).
Insbesondere werden Stämme von anaeroben Bakterien identifiziert und isoliert, und dann werden sie in die Gruppe der Bacteroides und unspezifischen anaeroben Bakterien gruppiert, wie oben beschrieben.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, liegt unter Berücksichtigung von Vaginalfluidproben mit geringen oder fehlenden Werten an anti-Gvh IgA und entnommen bei Frauen mit Besiedelung mit anaeroben Bakterien oder der Bacteroides Bakteriengruppe, das OR für Frühgeburt (PTD) im Bereich von 1 bis 2 (1,7 bzw. 1,3), während der OR-Wert für geringes Geburtsgewicht (LBW) im Bereich von 2 bis 4 (2,0 bzw. 2,9 liegt).
Wenn hingegen in den Vaginalfluidproben unspezifische anaerobe Bakterien gefunden wurden, liegt das OR für geringes Geburtsgewicht (LBW) bei über 4 (4,4), während das OR für Frühgeburt (PTD) im Bereich von 2 bis 4 (2,2) liegt.
Das Verfahren im Sinne dieser Erfindung kann nach der Phase b) die Bakterienflorabestimmung in der Probe beinhalten.
Aus dem soeben beschriebenen ergibt sich, dass:

– wenn anaerobe Bakterien oder Bakterien der Bacteroides-Gruppe in der analysierte Probe identifiziert wurden, ist das Risiko für LBW hoch, während das Risiko für PTD mittel ist;
– wenn unspezifische anaerobe Bakterien in der analysierten Probe identifiziert wurden, ist das Risiko für LBW sehr hoch, während das Risiko für PTD hoch ist.

Damit ist festzustellen, dass in jedem betrachteten Fall die Bewertung der anti-Gvh IgA-Antwort erlaubt, eine präzisere Bewertung des Risikos vorzunehmen, da es ermöglicht, Frauen mit einem sehr hohen Risiko und Frauen ohne Risiko sehr sorgfältig herauszulesen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, stellt das Verfahren einen weiteren Schritt zur Verfügung, der in der Bestimmung der Sialidase- und Prolidaseaktivitätsbestimmung in diesen Proben besteht.
Sialidasen sind Enzyme, die von Bakterien produziert werden und bei der Pathogenese verschiedener Krankhaften beteiligt sind. Diese Enzyme rufen die Hydrolyse von Sialinsäure aus verschiedenen Proteinen hervor, darunter IgA, was die Immunantwort verändert.
Prolidasen sind proteolytische Enzyme, die von Bakterien produziert werden, um die Zellinfiltration zu fördern. Diese Enzyme sind in der Lage, Cytokine und andere Immunmediatoren zu aktivieren.
Die Sialidaseaktivität wurde durch Inkubation von 50 μl der Vaginalfluidprobe mit 50 μl eines Substrats bei pH 5,0 bestimmt, nach einer Verfahrensweise, die von Cauci et al. beschrieben ist in: Am J Obstet Gynecol 1998; 178:511–5. Die spezifische Aktivität wurde als Nanomol Methoxyphenol gebildet durch die Umsetzung des Substrats und berechnet durch Vergleich mit einer Standardkurve von reinem Methoxyphenol ausgedrückt. Die Sialidaseaktivitätswerte sind definiert als: keine Aktivität für Werte unter 0,19 nmol Methoxyphenol; +1 Cutoff für Werte gleich oder über 0,19 nmol Methoxyphenol; +2 Cutoff für Werte gleich oder über 0,38 nmol Methoxyphenol; +3 Cutoff für Werte gleich oder über 2,50 nmol Methoxyphenol und +4 Cutoff für Werte gleich oder über 5,0 nmol Methoxyphenol.
Die Prolidaseaktivität wurde wie bei Cauci et al. beschrieben in: J Infect Dis 1998; 178:1698–706 bestimmt. Die Prolidaseaktivitätswerte sind definiert als: keine Aktivität für Werte unter 22 mOD; +1 Cutoff für Werte gleich oder über 22 mOD; +2 Cutoff für Werte gleich oder über 44 mOD; +3 Cutoff für Werte gleich oder über 1000 mOD und +4 Cutoff für Werte gleich oder über 2000 mOD.
Alle +1 Cutoffs der Enzymaktivität beruhen auf dem Mittelwert plus einer Standardabweichung gemessen in einer gesunden Kontrollpopulation. Der +2 Cutoff wurde durch verdoppeln des +1 Cutoff erhalten.
Insbesondere wird gemäß dem Verfahren der Erfindung zur Bestimmung des Risikos von Pathologien bei Frauen mit einer Besiedlung mit G. vaginalis die Kombination der fehlenden oder geringen anti-Gvh IgA-Antwort mit hohen Werten der Sialidase- oder Prolidaseaktivität (+4) mit geringem Geburtsgewicht oder Frühgeburt bei Frauen mit veränderter Vaginalflora in Zusammenhang gestellt.
Diese Gruppen von Frauen wurden bezüglich des Vorhandenseins von bakterieller Vaginose oder unspezifischer anaerober Bakterien unterteilt.
Die folgende Tabelle 2 zeigt Daten analysiert als Prozentsatz von Frauen, die Babies mit geringem Geburtsgewicht (LBW), Frühgeburt (PTD) oder Geburten zum normalen Geburtstermin (NTD) hatten, während Daten in Fettdruck das Verhältnis (OR) zwischen Prozentsatz von Frauen mit LBW, PTD bzw. dem Prozentsatz an Frauen mit NTD zeigt.
Dieser Wert wird mit einem Standardfaktor durch das Computerstatistikprogramm SPSS berechnet und korrigiert.
Das OR-Verhältnis gibt in diesem Bild das Risiko für LBW oder PTD an.
Tabelle 2
Der selbe Ansatz, der zur Abschätzung der Werte in Tabelle 1 verwendet wurde, kann für die Werte in Tabelle 2 eingesetzt werden.
Als Folge davon wurde gefunden, dass hohe Werte an Sialidaseaktivität und geringe oder keine anti-Gvh IgA-Werte in Vaginalfluidproben von Frauen mit bakterieller Vaginose oder in Vaginalfluidproben von Frauen, bei denen G. vaginalis gefunden wurde, ein hohes Risiko für LBW und PTD anzeigen. Während für die selben Werte der Sialidaseaktivität in den Vaginalfluidproben, bei denen ein pH-Wert gleich oder höher als 4,7 gemessen wurde, der OR-Wert für LBW höher ist als 4 (4,5) und der OR-Wert für PTD zwischen 2 und 4 (3,5) liegt, so dass das Risiko für LBW sehr hoch und das Risiko für PTD hoch ist.
In Tabelle 2 wurde das Symbol (↑↑↑) entsprechend dem OR-Wert verwendet, der unspezifischen Anaeroben zugeordnet ist und keiner oder geringer anti-Gvh IgA und sehr hoher Sialidaseaktivität, weil der Prozentsatz an Frauen mit NTD dieser Art null ist und das Verhältnis OR unendlich wäre.
Daraus folgt, dass die Zuordnung unspezifischer Anaerober und fehlender oder geringer anti-Gvh IgA und sehr hoher Sialidaseaktivität ein 100 % spezifischer Test für LBW und PTD ist.
Fehlender oder geringe anti-Gvh IgA-Antwort und sehr hohe Werte an Prolidaseaktivität bei Frauen mit BV oder Besiedelung mit G. vaginalis sind mit einem sehr hohen Risiko für LBW und PTD verbunden.
Bei Frauen mit einem vaginalen pH gleich oder über 4,7 und sehr hohen Werten an Prolidaseaktivität ist der OR-Wert für LBW höher als 4 (4,5), während der OR-Wert für PTD im Bereich von 2 bis 4 (3,5) liegt, so dass das Risiko für LBW sehr hoch und das Risiko für PTD hoch ist.
Schließlich entspricht das Auffinden unspezifischer anaerober Bakterien und fehlender oder geringer Werte an anti-Gvh IgA und sehr hoher Werte an Prolidaseaktivität einem sehr hohen Risiko für LBW und PTD.
Im allgemeinen stehen geringe anti-Gvh IgA-Werte kombiniert mit einer sehr hohen Prolidaseaktivität mit sehr hohen Risikowerten in Verbindung.
Gemäß diesen Ergebnissen umfasst das Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Komplikationen zusätzlich nach Schritt b) die Bestimmung der Sialidase- und/oder Prolidaseaktivität in der Probe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Mengen an IgG oder IgM in Beziehung zu LBW oder PTD analysiert und die entsprechenden Werte sind in den Tabellen 3 bis 6 angegeben, wie es später beschrieben wird.
Die IgG-Werte werden auf die selbe Weise berechnet wie die IgA-Werte berechnet wurden, der einzige Unterschied ist, dass der anti-human IgG-Antikörper eingesetzt wurde, um den ELISA-Test durchzuführen.
Der Cutoff-Wert zur Definition des Fehlens einer IgG-Antikörperantwort betrug 370 mOD (Mittelwert plus eine Standardabweichung ermittelt in der gesunden Kontrollpopulation). Ein Wert zwischen 370 und 740 mOD gibt das Auftreten einer geringen IgG-Antikörperantwort an. Ein Wert über 740 mOD (das Doppelte des ersten Cutoff berechnet aus dem Mittelwert plus einer Standardabweichung in der gesunden Kontrollpopulation) entspricht einer starken IgG-Antikörperantwort.
Es ist festzustellen, dass die Ergebnisse sehr ähnlich denen sind, die durch Messen von IgA erhalten wurden, so dass die selben Bewertungen und Betrachtungen wie zuvor angegeben vorgenommen werden können.
IgM-Werte wurden nach einer Behandlung der Probe vor dem ELISA-Test berechnet. Durch diese Behandlung wurden die IgG mittels „Ziege anti-human-Absorptionsmittel" (ProSorb G) aus der Probe eliminiert, das ist ein Harz gekoppelt mit anti-human IgG-Antikörpern, die den Fachleuten bekannt sind. Dann wurde die Probe mit Mikrozentrifugenfiltereinheiten von 5- auf 10-fach aufkonzentriert. Dieses Konzentrierungsverfahren wurde durch Zentrifugieren unter Verwendung einer Polysulfonmembran durchgeführt, die Proteine mit einem Molekulargewicht über 100000 Dalton aufkonzentriert.
Schließlich wird ein ELISA-Test wie oben beschrieben durchgeführt, aber unter Verwendung eines anti-human IgM-Antikörpers.
Der Cutoff-Wert für das Fehlen einer IgM-Antikörperantwort betrug 300 mOD (Mittelwert plus eine Standardabweichung berechnet für die gesunde Kontrollpopulation). Ein Wert zwischen 300 mOD und 600 mOD bedeutet, dass eine geringe IgM-Antikörperantwort hervorgerufen wurde. Schließlich definiert der Wert von 600 mOD (das Doppelte des Mittelwerts plus eine Standardabweichung berechnet für die gesunde Kontrollpopulation) eine starke IgM-Antwort.
Die Bewertung des Verfahrens ist parallel zum Verfahren, das für die IgA-Bewertung verwendet wurde, so dass die folgenden Tabellen nicht kommentiert werden.
Tabelle 3
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
Wie im einführenden Teil der vorliegenden Beschreibung erwähnt, erlaubt das Verfahren gemäß der Erfindung mit Vorteil das Risiko von Pathologien wie Ansteckung mit HIV-Virusinfektionen, HPV-Virusinfektionen, Infektionen des oberen Genitaltrakts (PID), Infektionen post partum oder nach gynäkologischen Eingriffen, Spontanabort, Endometritis zu bestimmen.
Im folgenden Teil wird ein Beispiel bezüglich einer Untersuchung zum Auftreten der HIV-Virusinfektion beschrieben.
Zum Aufstellen des Verfahrens wurde zunächst eine Gruppe von 50 Frauen mit Besiedelung mit G. vaginalis und mit hohem Risiko für sexuell übertragbare HIV-Infektion aufgestellt. Drei Jahre später war bei diesen Frauen eine Untergruppe von 42 Frauen noch immer HIV seronegativ (Kontrollen) und eine Untergruppe von 8 Frauen war HIV seropositiv.
Diese Gruppen wurden entsprechend dem Vorhandensein von G. vaginalis allein oder G. vaginalis und einem pH gleich oder höher als 4,7 oder G. vaginalis und Diagnose einer bakteriellen Vaginose (BV) unterteilt.
Tabelle 7 zeigt die Zuordnung der anti-Gvh IgA-Antwort zur Untergruppe der 42 HIV seronegativen Frauen (Kontrollen) oder der 8 Frauen, die HIV seropositiv wurden.
Tabelle 7
Die angegebenen Werte haben bezüglich LBW und PTD die selbe Bedeutung wie in den Tabellen beschrieben, aus diesem Grund werden sie hier nicht ausführlich beschrieben.
Jedenfalls stellt Tabelle 7 heraus, dass wiederum hohe Werte an anti-Gvh IgA einen Schutzeffekt bezüglich des Risikos einer HIV-Infektion anzeigen.
Außerdem liegt das OR-Verhältnis im Falle eines pH gleich oder höher als 4,7 und keiner oder geringer Anti-Gvh IgA-Antwort in der Körperflüssigkeit im Bereich von 1 bis 2 (1,8). Dies bedeutet, dass das Risiko einer HIV-Ansteckung mittel ist.
Das OR-Verhältnis bei Frauen mit BV und ohne oder mit wenig anti-Gvh IgA in der Körperflüssigkeit liegt im Bereich von 2 bis 4 (2,1). Dies bedeutet, dass das Risiko für HIV-Ansteckung hoch ist.
Als Folge davon stellt das Verfahren der Erfindung die selben nachfolgenden Schritte zur Verfügung, wie es für die Bestimmung des Risikos für LBW und PTD beschrieben ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren zur Bestimmung des Risikos einer HIV-Infektion einen Schritt zur Bestimmung der Sialidase- und/oder Prolidaseaktivität beinhalten, wie es für LBW oder PTD beschrieben ist.
Die folgende Tabelle 8 beschreibt Werte entsprechend hoher Sialidase- oder Prolidaseaktivitätswerte gemessen in Fluidproben von Frauen mit bakterieller Vaginose oder mit pH ≥ 4,7 oder einfach mit Besiedelung mit G. vaginalis. Wie angegeben wurden in allen betrachteten Fällen kein oder wenig IgA erfasst.
Tabelle 8
Insbesondere bei hohen Werten der Sialidaseaktivität liegt das OR im Bereich von 2 bis 4 bei Frauen mit BV oder Frauen mit einem vaginalen pH ≥ 4,7, während das OR bei Frauen mit einer Besiedelung mit G. vaginalis höher als 4 ist.
Außerdem standen bei allen in Tabelle 8 gezeigten Untergruppierungen hohe Werte an Prolidaseaktivität mit OR immer höher als 4 in Zusammenhang.
Aus den in Tabelle 8 angegebenen Werten ist klar, dass, wenn die Werte an anti-Gvh IgA gering sind oder fehlen, und wenn die Sialidaseaktivität höher ist als 5,0 nmol Methoxyphenol (hohe Werte, +4 Cutoff), ist das Risiko hoch; wenn die Werte an anti-Gvh IgA gering sind oder fehlen und wenn die Prolidaseaktivität höher ist als 2000 mOD (hohe Werte, +4 Cutoff), ist das Risiko sehr hoch.
Das von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellte Verfahren zum Bestimmen des Risikos von Pathologien bei Frauen mit einer Besiedelung mit dem Bakterium G. vaginalis erlaubt eine sehr akkurate und zuverlässige Bewertung des Risikos.
Umeine solche Bestimmung zu erhalten, wurde ein neues Verfahren für die Isolierung des als Antigen verwendeten Gvh-Toxins ausgearbeitet. Dieses Verfahren besteht in einer speziellen Technik, die nachfolgend beschrieben wird, die eine weitre Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.
Das vom Bakterium G. vaginalis produzierte hämolytische Toxin Gvh wird aus einer geeigneten Kulturbrühe isoliert, wie zum Beispiel Trypto-Casein-Soja-Brühe (vertrieben von Diagnostic Pasteur) oder der Mueller Hinton Brühe (vertrieben von Oxoid).
Bevorzugt wird eine Brühe ohne Serum und/oder Plasma verwendet.
Insbesondere umfasst diese Brühe eine Grundkomponente, das ist Hirn-Herz-Infusionslösung vertrieben von Oxoid, eine Glycogenkomponente, die von 0,5 bis 10 % des endgültigen Brühevolumens schwankt und ein Salz MgSO₄ oder MgCl₂ in einer Konzentration von 0,05 mM bis 20 mM.
Bevorzugt schwankt Glycogen von 0,1 bis 1 % und MgSO₄ und MgCl₂ schwankt von 0,2 bis 10 mM, besonders bevorzugt beträgt Glycogen 0,3 und MgSO₄ und MgCl₂ beträgt 1 mM.
Überraschend wurde gefunden, dass diese Art von Brühe ohne Serum und/oder Plasma und mit Magnesium und Glycogen statt Stärke und Glucose, die üblicherweise in bekannten Brühen eingesetzt werden, es erlaubt, ein optimales Wachstum des Bakteriums G. vaginalis zu erreichen und außerdem eine starke Zunahme der Produktion an Gvh-Toxin.
Außerdem wurde gefunden, dass das Fehlen des Tensids Tween, das üblicherweise in der Kulturbrühe eingesetzt wird, und das Fehlen von Plasmaproteinen zu einer beträchtlichen Zunahme der Aktivität des hämolytischen Toxins führt.
Die Isolierung des Proteins kann direkt aus einer Menge der Kulturbrühe oder aus dem vom Überstand der Brühe nach Bearbeitung in Normalchromatographieverfahren eluierten Toxin erreicht werden.
Diese Menge an Brühe oder Toxineluat wird bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 8 °C gehalten und dann mit einer festgelegten menge an Fällungsmittel mit chaotropischen Eigenschaften vermischt, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton und Ammoniumsulfat.
Bevorzugt wird vorgekühltes Methanol in einer Konzentration verwendet, die von 5 bis 70 % des Endvolumens, bevorzugt 33 % beträgt.
Diese Mischung wird über einen Zeitrahmen von 30 bis 60 Minuten auf Eis gestellt.
Anschließend wird die Mischung bei einer Temperatur zwischen 0 und 8 °C bei 2500–5000 Upm über einen Zeitrahmen von 20 bis 60 Minuten zentrifugiert.
Am Ende des Zentrifugierens wird ein Pellet erhalten, das aus dem Toxin besteht, das direkt aus dem Kulturbrühenüberstand oder aus dem Eluat ausgefällt ist, das durch chromatographische Reinigung der Brühe erhalten wurde.
Anschließend wird zunächst der Überstand und dann das eventuell verbleibende Methanol vom Pellet eliminiert.
Schließlich wird das Pellet in deionisiertem Wasser oder Ammoniumacetatlösung erneut suspendiert.
Wenn die Toxinisolierung direkt aus der Kulturbrühe von G. vaginalis durchgeführt wird, muss die Menge an für die Ausfällung abgezogener Brühe in einem Glas oder Polypropylenbehälter aufbewahrt werden, um einen Verlust an Toxin aufgrund von hydrophoben Effekten zu vermeiden.
Wenn das so erhaltene Toxin nicht unmittelbar für einen Immunenzymtest verwendet wird, wird nach Zentrifugieren das Pellet mit AcNH₄ oder NaCl oder NaClO₄ oder (NH)₂SO₄ oder NH₄Cl bei einer Konzentration zwischen 1 und 100 mM aufgenommen unter Zusatz eines Tensids wie Tween 20 oder Tween 80 oder Nonidet P-40 (NP-40 vertrieben von Calbiochem, und vertrieben von Sigma unter dem Namen CA-630 oder Brij^® 35 (Calbiochem) oder Lubrol^® oder n-Octylglucosid von 0,001 bis 1 %, bevorzugt 50 mM AcNH₄ und 0,05 % Tween 20. Das so erhaltene Präparat wird dann in einem Glasbehälter bei –80 °C über lange Zeit oder –20 °C für kurze Zeit gelagert.
Die hämolytische Aktivität des Proteins wird erhalten, wenn das Pellet lyophilisiert wird.
Wenn das Toxin direkt aus der Kulturbrühe isoliert wird, ist es besser, eine zweite Ausfällung unter den selben Bedingungen wie für die erste Fällung beschrieben vorzunehmen.
Nach der zweiten Fällung wird ein neues Pellet mit Gvh-Toxin erhalten, dieses wird mit deionisiertem sterilen Wasser aufgenommen und eingefroren oder lyophilisiert bei –80 °C über lange Zeit oder –20 °C für kurze Zeit gelagert.
Der Vorteil dieser Ausführungsform liegt in der Tatsache, dass die Vorgehensweise zum Isolieren des hämolytischen Gvh-Toxins leichter und schneller durchzuführen ist, weil der Chromatographieschritt durch eine einfache Ausfällung ersetzt ist.
Wie zuvor erwähnt kann das Gvh-Toxin verwendet werden, um die sekretorischen Antikörper anti-Gvh IgA oder IgG oder IgM durch einen Immunenzymtest zu bestimmen.
Zum Beispiel wurde ein ELISA-Test ähnlich dem hier verwendeten von Cauci et al. Am J Obstet Gynecol 1996; 175: 1601–5 beschrieben, wie zuvor angegeben. Es ist anzumerken, dass das nach dem eben beschriebenen Verfahren isolierte Gvh-Toxin ermöglicht, den Inkubationsschritt des ELISA-Test bei Raumtemperatur durchzuführen, ohne dass es erforderlich ist, die Inkubationsplatten der geprüften Proben anzuwärmen.
Das bisher Beschriebene erlaubt, objektiv bestimmbare Marker zu erhalten, um Frauen, die Therapie benötigen sorgfältig auszuwählen, um aufgelistete schwere pathologische Komplikationen zu vermeiden, außerdem ermöglicht es, die Wirksamkeit einer vorgenommenen Therapie zu bewerten. Außerdem ergeben sowohl die Aspekte des Verfahrens als auch des isolierten Toxins der vorliegenden Erfindung wichtige Schlüssel für die künftige Herstellung von Impfstoffen, die gegen die genannten Pathologien wirksam sind, und gleichzeitig ohne die starken Nachteile, die durch die Nebenwirkungen der derzeit verwendeten Arzneistoffe verursacht werden.
Hier wird ein erläuterndes und nicht einschränkendes Beispiel der Herstellung des Gvh-Antigens beschrieben, das zum Durchführen eines ELISA-Tests gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Bakteriumkultur mit Gardnerella vaginalis
G. vaginalis wird in einer Kulturbrühe ohne Zusatz von Serum oder Plasma kultiviert.
Der G. vaginalis Stamm kann einer der bei der ATCC hinterlegten mit der Nummer 14018 oder 14019 sein, kann ansonsten wie in der vorliegenden Ausführungsform von Patientinnen isoliert werden, bei denen bakterielle Vaginose diagnostiziert ist.
Das in der Brühe zu kultivierende Bakterium kann von einem in Glycerol konservierten Stamm abgezogen werden, zum Beispiel können 200 μl des Stammes in eine Flasche mit 50 ml Brühe gegeben werden.
Alternativ wird der Stamm, der zunächst auf einer Agarplatte in einem festen Medium mit menschlichem Blut unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C kultiviert wurde, zum Beispiel mit einer sterilen Spritze abgezogen, um damit eine Flasche mit 50 bis 100 ml Brühe zu beimpfen.
Nach Erhalt eine signifikanten Kultur mit einem A₆₂₀ = 0,5–1,5 OD, wobei A₆₂₀ die Absorption bei 620 Nanometern angibt, werden 10 bis 25 ml Kulturbrühe verwendet, um eine neue 1 Literflasche Brühe zu beimpfen.
Insbesondere wird die von Oxoid unter dem Namen Hirn-Herz-Infusionslösung (BHI) vertriebene Brühe verwendet. Alternativ können Fleischbrühmedium, Mueller-Hinton-Brühe, Leberbrühe, Nährstoffbrühe, Schaedler anaerobe Brühe, Todd-Hewitt-Brühe, Trypton-Soja-Brühe, Tryptosephosphatbrühe, Wilkins-Chalgren anaerobe Brühe (alle Brühen von Oxoid vertrieben) und analoge verwendet werden. Es werden dieser Brühe 0,3 % Glycogen von Austern vertrieben von Sigma und 1 mM MgSO₄ oder MgCl₂ zugesetzt.
Alle Beimpfungen werden in einer anaeroben Atmosphäre durchgeführt (in einem Kabinett mit 5–10 % CO₂ Atmosphäre oder in einem Gefäß mit AnaeroGen Beuteln vertrieben von Oxoid) bei einer Temperatur von 37 °C für durchschnittlich 24 Stunden. Wenn der Stamm gerade aufgetaut ist, können 48 Stunden nötig sein, während für den zweiten Brüheschritt üblicherweise 16 Stunden ausreichend sind.
Eine gut kultivierte Brühe weist eine flokkulente Trübe auf, einen pH von 4,7 bis 6,2 und hämolytische Aktivität gleich mindestens 1HU₅₀ = 1 μl Brühe.
Am Ende der Bakterienkultur wird die Brühe bei 3500 Upm über 30 Minuten bei 4 °C zentrifugiert und schließlich durch eine Membran von 0,45 Mikrometern zur Sterilisierung filtriert.
Wenn die Brühe nicht unmittelbar verarbeitet wird, wird ihr ein Tensid Tween 20 in einer Endkonzentration von 0,1 % zugesetzt und sie dann bei –20 °C eingefroren.
Wenn hingegen die Brühe unmittelbar verarbeitet wird, wird sie auf Eis gekühlt und ausgefällt.
Ausfällung des hämolytischen Toxins Gvh
Zur Ausfällung des Gvh-Toxins wird Methanol in HPLC-Chromatographiereinheit verwendet.
Methanol wird bei –80 °C vorgekühlt und dann eine Menge gleich ½ des Brühevolumens zugesetzt, was zu einer Endkonzentration von 33 führt.
Die Brühe muss in einem Glas oder Polypropylenbehälter vorliegen und über 1 Stunde auf Eis liegen.
Nach dem Zusetzen von Methanol zur Brühe, wird die Mischung über 30–60 Minuten stehen gelassen und dann über 30 Minuten bei 4000 Upm zentrifugiert.
Am Ende der Zentrifugierung wird der Überstand aus dem Behälter entfernt und das im Pellet verbleibende Methanol verdampft. Insbesondere wird die Verdampfung des Restmethanols unter Vakuum über 1 Stunde durchgeführt.
Später wird das Pellet mit sterilem deionisierten Wasser oder mit 50 m; AcNH₄ und 0,05 % Tween 20 suspendiert. Dieses Präparate muss in einem Glasbehälter aufbewahrt werden, eingefroren bei –80 °C für lange Zeit oder bei –20 °C für kurze Zeit.
Die erste Ausfällung führt zu einer ungefähr 15–20-fachen Aufkonzentrierung des Ausgangsvolumens der Brühe (50–70 ml aus 1 Liter Brühe) und ungefähr 5-facher Aufkonzentrierung der hämolytischen Aktivität des Toxins.
Anschließend wird eine zweite Ausfällung unter den selben Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt, wobei nur Glasgefäße verwendet werden.
Nach der Ausfällung muss das ausgefällte Toxin in sterilem deionisiertem Wasser suspendiert werden und gefroren oder lyophilisiert bei –80 °C oder –20 °C aufbewahrt werden.
Nach dieser zweiten Ausfällung werden 5 bis 10 ml Toxin mit ausreichender hämolytischer Aktivität für 2500 bis 5000 Versuche aus 1 Liter Brühe erhalten.
Vorbereitung für den ELISA-Test
Das wie oben beschrieben isolierte Toxin wird zur Verwendung im ELISA-Test 1:50 In ELISA-Puffer verdünnt. Der Puffer besteht aus 0,1 M Natriumcarbonat bei pH 9,6.
Insbesondere werden 1 ml des isolierten Toxins benötigt, um 50 ml Lösung zu erhalten, die nötig ist, um 5 Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung von 100 μl pro Mulde vorzubereiten.
Der ELISA-Test wird dann mit normalen Vorgehensweisen durchgeführt, die den Fachleuten bekannt sind. Es ist anzumerken, dass nach dem oben beschriebenen Isolierungsverfahren ein solcher Test bei Raumtemperatur ausgeführt werden kann.
ELISA-Test
Für die ELISA-Analyse wird eine flache Tüpfelplatte verwendet (zum Beispiel Typ I, Costar). In jede Vertiefung werden 0,100 ml gereinigtes Antigen (Gvh) in 0,1 M Carbonatpuffer bei pH = 9,6 entsprechend 100 HU₅₀ der hämolytischen Aktivität zugegeben. Die Inkubation wird bei Raumtemperatur über 16 Stunden durchgeführt. Dann wird das nicht gut adsorbierte Antigen durch Absaugen der Lösung und 3 anschließende Wäschen der Vertiefung mit 0,300 ml PBS-Lösung, die 0,05 % Tween 20 enthält, entfernt. Zum Blockieren der aspezifischen Bindungsstellen wird eine Inkubation unter Verwendung von 0,300 ml PBS-Lösung, die 0,05 % Tween 20 und 2 % BSA enthält, über 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Parallel wird eine analoge Blockierung in Vertiefungen durchgeführt, die nicht mit dem Antigen überzogen sind, die für die Hintergrundbestimmung notwendig sind. Nach Absaugen der Blockierlösung werden 0,100 ml biologische Fluidprobe (eventuell gepuffert bei pH = 7,2 mit einem 25 mM Phosphatpuffer) sowohl zu der mit Antigen beschichteten wie der unbeschichteten Platte hinzugegeben (als Hintergrundkontrolle). Die Inkubation wird über 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Dann wird die biologische Fluidprobe entfernt und 3 Waschungen wie oben beschrieben durchgeführt. 0,100 ml Pufferlösung von pH 7,4, die 1:5000 verdünnte F(ab')₂ anti-human IgA-Antikörper konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Sigma) hinzugefügt. Die Mulden wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann 3-mal wie oben beschrieben gewaschen. Dann wurden 0,100 ml 1 g/l para-Nitrophenylphosphatsubstrat in einer Pufferlösung aus 0,1 M Glycin, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM Zn Cl₂ bei pH = 10,6 zugegeben. Die nach Hydrolyse des Substrats und Freisetzung des para-Nitrophenols entwickelte Farbe wurde von 30–60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur mit einem ELISA-Lesegerät bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als mOD-Wert abgelesen aus der Vertiefung mit dem Antigen minus dem mOD-Wert abgelesen in der Vertiefung ohne Antigen und mit der selben biologischen Fluidprobe inkubiert. Die beiden Vertiefungen werden mit einer negativen Kontrolle inkubiert (das heißt ohne anti-Gvh lg) und zwei Vertiefungen werden mit zwei positiven Kontrollen inkubiert.
Es können einige verschiedene Ausführungsformen des eben beschriebenen Tests durchgeführt werden. Insbesondere kann das para-Nitrophenol durch ein anderes Substrat ersetzt sein, das in der Lage ist, die Aktivität der alkalischen Phosphatase darzustellen, wie zum Beispiel 2-Nitrophenylphosphat, das 4-Nitrophenylphosphat ersetzen kann oder ein chromogenes Substrat, das einen unlöslichen farbigen Niederschlag entwickelt (notwendig für den Streifentest). Das Substrat kann die Kombination BCIP/NBT sein (5-Brom-4-chlor-3-inolylphosphat/Nitroblautetrasolium), das eine blau/indigofarbenes Hydrolyseprodukt bildet. Ein weiteres Substrat ist 4-Methylumbelliferylphosphat, das stattdessen ein fluoreszierendes Hydrolyseprodukt ergibt, das in Lösung oder als Spot erfasst werden kann.
Der anti-human Ig-Antikörper kann ferner mit anderen Enzymen als alkalischer Phosphatase konjugiert werden, die bekannteren sind: 1) Meerrettichperoxidase, mit diesem Substrat können verschiedene Substrate eingesetzt werden, das bekannteste ist Tetramethylbenzidin (TMB), das unter Zusatz von Wasserstoffperoxid eine blaue Farbe ergibt, die Farbentwicklung wird dann mit Schwefelsäure gestoppt und am Ende wird eine gelbe Farbe in Lösung bei 450 nm abgelesen; 2)beta-Galactosidase, auch mit diesem Substrat können verschiedene Substrate verwendet werden, insbesondere ist eine solche Enzymaktivität für einen Streifentest geeignet, weil es verschiedene unlösliche Substrate gibt, die Niederschläge in vielen verschiedenen Farben ergeben: das 5-Brom-4-chlor-3-indolylgalactosid (X-Gal) ergibt eine indigoblaue Farbe, 5-Brom-6-chlor-3-indolylgalactosid ergibt eine Magentafarbe, das 6-Chlor-3-indolylgalactosid ergibt eine rosa Farbe, das 5-Iod-3-indolylgalactosid ergibt eine Purpurfarbe, das N-Methyl-3-indolylgalactosid ergibt eine grüne Farbe und schließlich ergibt das 3-Hydroxylindol-beta-D-galactosid eine blaue Farbe (alle angeführten Substrate werden von Molecular Probes vertrieben, einige von Calbiochem und einige von Sigma). Substrate für die beta-Galactosidase, die lösliche Produkte mit Absorption im UV-Bereich ergeben, die für ELISA verwendet werden können, wie zum Beispiel 2-Nitrophenyl-beta-D-galactosid (ONPG), das 4-Nitrophenyl-beta-D-galactosid. Außerdem gibt es einige verschiedene Substrate, die fluoreszierende Hydrolyseprodukte ergeben.
Um eine Signalverstärkung zu erhalten, ist es üblich, ein mit Biotin konjugiertes anti-human Ig zu verwenden, die Erfassung wird dann mit Avidin (oder Strepavidin) durchgeführt, das mit einem Erfassungsenzym konjugiert ist (als alkalische Phosphatase, Peroxidase, beta-Galactosidase) und dem geeigneten chromogenen oder fluorogenen Substrat, das löslich (für den ELISA-Test) oder unlöslich sein kann (für Streifen, Dotblot, Western-Blot oder Gelanalyse).
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zum Bestimmen von anti-Gvh IgA und/oder IgG und/oder IgM in einer Köperfluidprobe von Frauen, die eine Besiedelung mit Bakterium G. vaginalis aufweisen, umfassend die Verwendung des gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren isolierten Gvh-Toxins. Bevorzugt umfasst der Kit das Gvh-Toxin in einer Menge von 2 μl äquivalent zu 0,02–0,04 μg Protein oder zu 100 HU₅₀ hämolytischer Aktivität.
Zum Beispiel kann der Kit eine ELISA-Platte aufweisen, deren Vertiefungen nicht mit dem Antigen beschichtet sind, um den aspezifischen Hintergrund zu eliminieren, eine Lösung, die 250 mM Phosphatpuffer bei pH = 7,2 enthält, die vor der Inkubation der Körperfluidprobe zugesetzt wird, eine negative Kontrolle des biologischen Fluids ohne anti-Gvh Immunglobuline, eine positive Kontrolle des biologischen Fluids mit anti-Gvh Immunoglobulinen, eine konzentrierte Lösung, die einen Ig-Antikörper konjugiert mit einem Erfassungsenzym enthält, eine Lösung geeignet zum Verdünnen der konzentrierten Antikörperlösung unmittelbar vor dem Zusetzen in der Vertiefung, ein Substrat geeignet für die quantitative Erfassung der Enzymaktivität konjugiert mit dem anti-Ig-Antikörper, eine Lösung geeignet zum Verdünnen einer konzentrierten Lösung oder einer Tablette des Substrats unmittelbar vor dem Zusetzen in der Vertiefung, ein Mittel zum Stoppen der Farbentwicklung, eine konzentrierte Lösung zum Waschen der Vertiefungen, die 5-fach bis 10-fach vor Verwendung zu verdünnen ist, ein Betriebsanleitung mit Erläuterungen für die richtige Verwendung des Assays und mit der Erläuterung des Risikos von Komplikationen (fehlend oder gering (–), mittel (+), hoch (++), sehr hoch (+++)) auf Basis der Ableseergebnisse.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung kann der Kit einen pH-Indikator und einen Test zum Bestimmen von IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Antikörpern umfassen.
Bevorzugt ist der ph-Indikator ein pH-Papier mit einem Umschlagsintervall im Bereich zwischen 4 und 7, während der Antikörpertest ein ELISA-Test ist wie er zuvor beschrieben wurde.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Kit auch einen Sialidase- und/oder Prolidaseaktivitätstest in Lösung umfassen, mit einem Behälter, der ein farbloses Substrat in Lösung enthält, dem die biologische Probe eingeimpft wird, einen Behälter mit einem Dispensionsmittel zum Hinzufügen der Entwickungslösung; eine Referenzskala zum Bewerten der gesamten Enzymaktivität durch Vergleich mit der Intensität der entwickelten Farbe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Kit auch einen Sialidase- und/oder Prolidaseaktivitätstest auf einer Platte umfassen, umfassend zwei Membranen auf einem festen Rahmen und mit einem Enzymsubstrat und einem Mittel für die Entwicklung der Farbe, durch das die biologische Probe geführt wird; und eine Referenzskala, zum Bewerten der gesamten Enzymaktivität durch Vergleich mit der Intensität der entwickelten Farbe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Kit auch einen Sialidase- und/oder Prolidaseaktivitätstest auf einem festen Träger umfassen, umfassend eine Membran, die mit einem chromogenen oder fluorogenen Substrat des Enzyms imprägniert ist und eventuell einem Mittel für die Farbentwicklung, auf einem inerten Streifen, womit die biologische Probe berührt wird. Dieser Kit ist mit einer Referenzskala versehen zum Bewerten der gesamten Enzymaktivität durch Vergleich mit der Intensität der entwickelten Farbe.
In dem Kit kann das Gvh-Toxin auf einem Stück Nitrocellulose oder Cellulose oder Celluloseacetat oder Dacron^® oder Polysulfon oder PVDF oder Mylar^® getragen sein, das den reaktiven Streifen bildet.
Außerdem kann das Toxin in einem lyophilisierten Zustand oder gefroren vorhanden sein und auf den Fachleuten bekannte Weise erhältlich sein.
Alternativ kann der Kit gemäß der vorliegenden Erfindung eine Quick Card umfassen, die den Fachleuten bekannt ist. Insbesondere weist die Quick-Card eine mit Gvh-Toxin funktionalisierte Membran auf, eine nicht mit dem Gvh-Antigen funktionalisierte Membran als negative Kontrolle, beide fixiert auf einem Träger und für die Bedienungsperson durch ein offenes Fenster auf dem festen Träger sichtbar ist. Das zu analysierende biologische Fluid wird durch die Membran geführt, so dass die anti-Gvh-Antikörper an den Testspot binden. Nach Zusatz eines Entwicklungsmittels, das mit den anti-Gvh-Immunglobulinen reagiert, wird eine Farbe entwickelt und mit einer Referenzskala verglichen.
Es ist zu berücksichtigen, dass der Kit gemäß der Erfindung mit Vorteil ein Kombinationskit sein kann. In der Tat kann der Kit zum Beispiel eine ELISa-Platte und einen pH-Trägerindikator mit einer Empfindlichkeit im Bereich von pH 4 bis pH 7 oder einen Test in Lösung zum Bestimmen der Sialidaseaktivität und/oder Prolidaseaktivität oder eine ELISA-Platte, einen pH-Indikator und eine Test auf festem Träger zum Bestimmen der Sialidaseaktivität und/oder Prolidaseaktivität umfassen. Bevorzugt kann der feste Träger eine Platte sein, wie es zuvor beschrieben wurde, oder ein Reaktionsstreifen, der routinemäßig für diese Art oder ähnliche Bestimmungen verwendet wird.
Analog können diese Kombinationen unter Ersetzen der ELISA-Platte zum Beispiel durch eine Quick Card durchgeführt werden.
Es stellt sich nun heraus, dass mit Bezug zu den Betrachtungen in den zuvor gezeigten Tabellen und den Bewertungen um den gezeigten oder erhältlichen analytischen Test, ein Kit, der ein schnelles Verfahren zum Bestimmen des Risikos der zuvor beschriebenen Pathologien bereitstellen kann, von großer Bedeutung ist, mit dem Ziel, dem Klinikpersonal effiziente Werkzeuge zur Entscheidung über eine pharmakologische Behandlung zu geben, die der Patientin zu verabreichen ist.
Wie aus dem oben Beschriebenen zu erkennen ist, ermöglicht das Verfahren für die Bestimmung des Risikos von Komplikationen gemäß dieser Erfindung, die in der Einführung der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Anforderungen zu erfüllen.
Offensichtlich kann ein Fachmann auf diesem Gebiet zur Erfüllung spezieller und spezifischer Bedürfnisse, einige Modifikationen und Ausführungsformen am oben beschriebenen Verfahren vornehmen, die aber alle von der Erfindung umfasst sind, wie sie durch die folgenden Ansprüche beschrieben ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Risikos von Pathologien in Zusammenhang mit Schwangerschaftskomplikationen und mit Empfindlichkeit auf sexuell übertragene Krankheiten bei Frauen, die eine Besiedelung mit Bakterium Gardnerella vaginalis aufweisen, umfassend die folgenden Schritte in der Reihenfolge: a) Bestimmen der Menge an IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Antikörpern gegen das von G. vaginalis ausgeschiedene Gvh-Toxin in einer Probe von Körperflüssigkeit; b) Bereitstellen eines Wertes, der das Risiko anzeigt; c) Vergleich der Mengen an IgA und/oder IgG und/oder IgM erhalten in Schritt a) mit dem Wert, der das in Schritt b) vorgesehene Risiko anzeigt; d) Bestimmen eines Risikofaktors, worin der Wert, der das Risiko anzeigt, nach einem Verfahren erhältlich ist, das die Schritte umfasst: i) Bereitstellen einer Gruppe von Frauen, die eine Besiedelung mit G. vaginalis aufweisen; ii) Bestimmen der Mengen an anti-Gvh IgA und/oder IgG und/oder IgM in einer solchen Gruppe; iii) Berechnen des Prozentsatzes an Frauen der Gruppe, die diese Komplikation oder diese Krankheiten aufweisen und die keine Komplikation oder Krankheiten aufweisen; iv) Berechnen eines Wertes und seine Korrektur mit einem Standardfaktor mittels eines Computerstatistikprogramms auf Basis des in Schritt iii) erhaltenen Prozentsatzes, um den Wert zu ermitteln, der das Risiko anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend nach Schritt c): – Bestimmen des pH der Probe; – Vergleich des gemessenen pH-Werts mit einem festgelegten Wert.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend nach Schritt c): – Bestimmen von Proben, die von Frauen gewonnen sind, die an BV leiden.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend nach Schritt c): – Bestimmen der Bakterienflora in Vaginalfluidproben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend nach Schritt b): – Bestimmen der Sialidaseaktivität in der Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend nach Schritt c): – Bestimmen der Prolidaseaktivität in der Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend nach Schritt c): – Bestimmen der Sialidase- und Prolidaseaktivität in der Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in dem die mit der Besiedelung mit Bakterium Gardnerella vaginalis in Zusammenhang stehenden Pathologien unerwünschte Wirkungen bei Schwangerschaft umfassen wie geringes Geburtsgewicht oder Frühgeburt, vorzeitiger Membransprung, Spontanabort, Infektionen des Fruchtwassers, Endometritis post partum, Übertragung einer HIV-Infektion von der Mutter aufs Kind, Erwerb einer HIV-Virusinfektion und HPV-Virusinfektion, Infektionen des oberen Genitaltrakts, Infektionen nach geburtshilflichen oder gynäkologischen Eingriffen, Endometritis, Cervitis.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem der Wert, der das Risiko anzeigt, 780 mOD für IgA, 740 mOD für IgG, 600 mOD für IgM und der festgelegte pH-Wert 4,7 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem der festgelegte IgA- oder IgG- oder IgM-Wert zweifach der bei gesunder Population gemessene Richtwert ist und aus dem Mittelwert plus einer Standardabweichung berechnet, und der festgelegte pH gleich oder größer 4,7 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in dem das Verfahren an einer Körperflüssigkeitsprobe von Frauen im ersten bis zweiten Trimester der Schwangerschaft durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, in dem das Verfahren an einer Körperflüssigkeitsprobe von Frauen in der siebten bis vierundzwanzigsten Schwangerschaftswoche durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, in dem das Verfahren an einer Vaginalfluidprobe von Frauen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, in dem das Verfahren an einer Vaginalfluidprobe von schwangeren Frauen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in dem die Population von Frauen mit Besiedelung mit G. vaginalis von schwangeren Frauen gebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in dem die Population von Frauen mit Besiedelung mit G. vaginalis von Frauen im fruchtbaren Alter gebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, in dem die Population von Frauen mit Besiedelung mit G. vaginalis von Frauen nach der Menopause gebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, in dem die Bestimmung der IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Mengen mit einer geeigneten Immunenzymanalyse vorgenommen wird, die die Verfügbarkeit des Gvh-Toxins als Antigen isoliert aus einer geeigneten Kulturbrühe von G. vaginalis durch Ausfällung umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: 1) Abziehen einer bestimmten Menge an G. vaginalis Kulturbrühe oder des Toxins gereinigt durch Chromatographie des Überstands von G. vaginalis Kulturbrühe, Kühlen und Lagern der Menge bei einer Temperatur von 0 bis +8 °C für ungefähr 1 Stunde; 2) Hinzufügen einer bestimmten Menge an Ausfällmittel auf eine Endkonzentration, die von 5 bis 70 % des Endvolumens schwankt, zu dieser Menge; 3) Lagern auf Eis für 30–60 Minuten; 4) Zentrifugieren bei einer Temperatur von 0 bis +8 °C bei 2500–5000 Upm über ungefähr 30–60 Minuten, so dass ein Überstand und ein Pellet erhalten werden; 5) Eliminieren des Überstands und dann des auf dem Pellet verbliebenen Ausfällmittels; 6) erneutes Suspendieren des Pellets mit sterilem deionisiertem Wasser.
Verfahren nach Anspruch 18, in dem das Ausfällmittel aus einer Gruppe umfassend Methanol, Ethanol, Aceton, Ammoniumsulfat, Propanol, Isopropanol gewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, in dem das Ausfällmittel Methanol in einer Konzentration von 33 % des Endvolumens ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, in dem, wenn die Phase der IgA- und/oder IgG- und/oder IgM-Bestimmung Abziehen einer bestimmten Menge an Brühe direkt aus der Kultur umfasst, dann dem Schritt f) eine weitere Ausfällung folgt, die die Schritte von b) bis f) wiederholt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, in dem am Ende des Schritts f) das Pellet mit AcNH₄ bei einer Konzentration, die von 1 bis 100 mM schwankt, und einem Tensid bei einer Konzentration, die von 0,01 bis 1 % schwankt, erneut suspendiert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, in dem das Pellet mit 50 mM AcNH₄ und 0,05 % Tween 20 erneut suspendiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, in dem das Bakterium G. vaginalis in einer Brühe gezüchtet wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend Hirn-Herz-Infusionslösung (BHI), Fleischbrühmedium, Mueller-Hinton-Brühe, Leberbrühe, Nährstoffbrühe, Schaedler anaerobe Brühe, Todd-Hewitt-Brühe, Trypton-Soja-Brühe, Tryptosephosphatbrühe, Wilkins-Chalgren anaerobe Brühe, wobei dieser Brühe Glycogen von 0,5 bis 10 % und MgSO₄ oder MgCl₂ von 0,05 bis 20 mM zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, in dem die Brühe BHI-Brühe ist umfassend 0,3 % Glycogen und 1 mM MgSO₄ oder MgCl₂.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, in dem die Immunenzymanalyse in einem ELISA-Test besteht.
Verfahren nach Anspruch 26, in dem der ELISA-Test bei Raumtemperatur durchgeführt wird.