CN104316704A - 一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法，该芯片包括捕获单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜、生物素标记多克隆抗体、大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素以及大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液，其中，捕获单克隆抗体和生物素标记多克隆抗体均可以同待测抗原特异性结合。本发明使用大豆过氧化氢酶代替现有技术中的辣根过氧化氢酶作为标记酶制备生物芯片，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。

Description

一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法。 

背景技术

生物芯片是生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、高通量的检测，它具有体积小、试剂和能量消耗少、样品分析速度快、通量高等优点。可以利用生物芯片高通量的优点，实现对多种血清学标志物的同时筛查，将生物芯片技术应用于产前筛查领域，突破了临床筛查唐氏综合症单次只能测定一项指标的界限。在产前血清学筛查中，利用生命分析化学新技术，结合纳米科学、临床医学等领域的新技术新方法，发展产前筛查标志物临床检验新技术，开发唐氏综合征产前筛查标志物临床检测芯片，分析检测结果与常用检测方法的差异和相关性，评价各项检测指标对胎儿出生缺陷的评估价值，对于降低产前筛查检测费用、提高群体的筛查普及率，具有重要的意义。 

大豆过氧化氢酶（Soybean peroxidase, SBP）是一类具有很高活性的酸性同功酶，是从大豆皮中提取出来的，提取原料来源充足、价廉易得。具有耐热性能高，底物作用范围广，酸碱稳定性好，pH适用范围宽等优点。辣根过氧化氢酶（Horseradish peroxidase，HRP）是一个阳离子酶，当用它来催化鲁米诺-过氧化氢反应时，即使是在发光体系中加入了对碘苯酚后，仅仅是在开始的几分钟化学发光强度明显增强，并且达到峰值，后来因HRP与底物氧化自由基产物相互作用而使酶的失活，导致化学发光强度迅速衰减。而作为阴离子的SBP，其不会因为氧化反应产物作用失活，发光信号的衰退没有HRP迅速，即会产生一个较长时间的化学发光信号，使用该种酶代替常用的辣根过氧化氢酶作为标记酶用于生物芯片系统检测，具有更高的稳定性。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是： 

提供一种大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，采用大豆过氧化物酶为标记酶，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定的问题。本发明所提供了酶标记生物芯片可以同时检测多种蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是： 

提供一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，该生物芯片包括捕获单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜、生物素标记多克隆抗体、大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素以及大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液，其中，捕获单克隆抗体和生物素标记多克隆抗体均可以同待测抗原特异性结合。 

所述的一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片中的捕获单克隆抗体可以是针对不同待测抗原的多种捕获单克隆抗体；上述生物芯片中所用的发光底物液可以是1.2 mM 3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐、0.6 mM 4-马琳吡啶、0.4 mM 鲁米诺、0.4 mM H2O2以及50 mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。 

优选的，一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其中，硝酸纤维素膜由甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素β亚基（β-HCG）、游离雌三醇（uE3）、抑制素A(InhibinA)四种蛋白抗原所对应的捕获单克隆抗体包被，生物素标记多克隆抗体为生物素标记的AFP多克隆抗体、β-HCG多克隆抗体 、 uE3多克隆抗体、InhibinA多克隆抗体，该生物芯片用于检测孕中期唐氏综合症筛查中的四项血清学标志物。 

一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片的制备方法，包括以下步骤: 

a.采用大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素；

b.使用捕获抗体包被硝酸纤维素膜；

c.封闭硝酸纤维素膜上的非特异性活性位点；

d.生物素标记可与待测抗原特异性结合的多克隆抗体；

e.配制大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液。

上述制备大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素的步骤a采用改良过碘酸钠法制备，其具体步骤如下： 

步骤一、取1 mg 大豆过氧化氢酶溶于100 μL PBS中，加入12 mg/mL NaIO₄溶液100 μL，混匀，置室温避光反应15 min；

步骤二、 取出步骤一得到的溶液，后加入100μL, 1%乙二醇室温反应30min；

步骤三、向步骤二得到的溶液中加入100ul, 5mg/ml 链酶亲和素，混匀，装入透析袋，于50 mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24 h，使大豆过氧化氢酶和链酶亲和素结合；

步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5 mg/ml NaBH₄溶液80 μL，混匀，置4℃还原反应2 h；

步骤五、加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5 h，132000 g离心15 min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；

步骤六、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化氢酶-链酶亲和素结合物，加PBS 500 μL复溶；

步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的优点如下： 

本发明使用大豆过氧化氢酶代替现有技术中的辣根过氧化氢酶（HRP）作为标记酶制备生物芯片，一方面此酶的热稳定性比HRP高，发光信号比HRP强，可以持续较长时间的强化学发光，检测灵敏度能够获得大大提高。其次，本发明酶标记生物芯片可实现高通量，可同时快速检测多项蛋白，突破了现有的单次只能筛查一项指标的瓶颈，减少了检测次数，同时对样品的需求量减少了，其操作步骤简单，检测仪器使用CCD即可，因此其产业化研究具有广泛的应用前景和重要的意义。

  

附图说明

图1是本发明中生物芯片的实施过程示意图。 

具体实施方式

下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。 

下面结合附图和实施例对本发明做更进一步的解释。 

本发明提供一种酶标记的生物芯片，包括经过捕获抗体预包被的NC膜、生物素标记抗体、大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素和发光底物液， NC膜同时包被多种捕获抗体，用于同时检测多种待测抗原。 

实施例

采用本发明所提供的生物芯片检测孕中期唐氏综合症筛查中的四项血清学标志物，其实施过程如图1所示。 

本实施例涉及的PBS为10 mM pH 7.4，Tween20/TBS溶液(Tween20/TBS，TTBS),为含有100 mM pH 7.5 Tris-HCL配制的0.3% Tween20；使用的大豆过氧化氢酶购自美国Bio-Research Products公司；生物素标记抗体购自上海瑞齐生物科技有限公司；链酶亲和素购自生工生物。 

第一步，酶标记链酶亲和素的制备 

采用改良过碘酸钠法：1、取1 mg 大豆过氧化氢酶溶于100 μL PBS中，加入新配制的12 mg/mL NaIO₄溶液100 μL，混匀，置室温避光反应15 min；2、在1得到的溶液中加入100μL, 1%乙二醇室温反应30min；3、在2得到的溶液中加入100ul, 5mg/ml 链酶亲和素，混匀，装入透析袋，于50 mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24 h，使大豆过氧化氢酶和链酶亲和素结合；4、在上述步骤3得到的溶液中加入5 mg/ml NaBH₄溶液80 μL，混匀，置4℃还原反应2 h；5、缓慢加入和上述步骤4得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，轻摇盐析0.5 h，132000 g离心15 min，去上清，沉淀以少许PBS溶解，装入透析袋，于大量PBS中4℃透析过夜，重复次步操作两次；6、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化氢酶-链酶亲和素结合物，加PBS 500 μL复溶；7、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶，低温保存；

第二步，NC膜上捕获单克隆抗体的修饰

选用孔径为0.45um白色的NC膜，捕获单克隆抗体点样缓冲液为0.1mM PBS与6%蔗糖的混合液，将80μL浓度为 0.1mg/ml 的四种捕获单克隆抗体（即：甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、游离雌三醇、抑制素A ）分别加入至96孔板中，采用Biodot AD6000点样仪控制温度22-24℃，湿度50%进行点样，4℃包被过夜后，置于恒温恒湿箱中干燥1-2h；

第三步，封闭非特异性活性位点

用150 μL 5% BSA加入到步骤二制备得到的固定有四种捕获抗体的NC膜上，室温封闭2 h。 

第四步，血清中四种蛋白标志物的检测 

待测血清的检测：将100 μL待测血清加入上述封闭好的NC膜上，同时设置阴性对照（加入的血清种不含待测物），阳性对照（血清中同时含有已知浓度的四种待测物），室温孵育30min，TTBS震荡洗涤四次，每次8min, 转速设置250rpm, 最后拍干。

第五步，生物素标记多克隆抗体的捕获 

生物素标记抗体的捕获：加入100μL 一定稀释度（2500×）的生物素标记多克隆抗体（该抗体可与待测抗原特异性结合）于上述NC膜上，室温孵育30min，TTBS震荡洗涤四次，每次8min, 转速设置250rpm, 最后拍干。

第六步，酶标记链酶亲和素的捕获 

加入100μL 一定稀释度（2000×）的大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素于上述NC膜上，室温孵育30min，TTBS震荡洗涤四次，每次8min, 转速设置250rpm。

第七步，发光底物液加入，发光信号检测 

在NC膜上加入发光底物液：1.2 mM 3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐、0.6 mM 4-马琳吡啶、0.4 mM 鲁米诺和0.4 mM H₂O₂于50 mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。因每个点对应的是血清检验中的各个指标，因而，同时可以检测出同一血清中四项指标含量。且测定四种标志物的浓度为：抑制素A 0.3 ng/ml、雌三醇1.4 ng/ml、甲胎蛋白50 ng/ml 、人绒毛膜促性腺激素42.84 pg/ml。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。 

Claims (6)

1.一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其特征在于该生物芯片包括捕获单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜、生物素标记多克隆抗体、大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素以及大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液，其中，捕获单克隆抗体和生物素标记多克隆抗体均可以同待测抗原特异性结合。

2.   根据权利要求1所述的一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其特征在于所述捕获单克隆抗体的种类为两种或两种以上。

3.   根据权利要求1所述的一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其特征在于上述生物芯片中所用的发光底物液为1.2 mM 3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐、0.6 mM 4-马琳吡啶、0.4 mM鲁米诺、0.4 mM H₂O₂以及50 mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。

4.   根据权利要求1所述一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其特征在于该生物芯片的硝酸纤维素膜由甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素β亚基、游离雌三醇、抑制素A四种蛋白抗原所对应的捕获单克隆抗体包被，生物素标记抗体为生物素标记的甲胎蛋白多克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素多克隆抗体 、游离雌三醇多克隆抗体、抑制素A多克隆抗体。

5.   一种如权利要求1所述采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤:

采用大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素；

使用捕获单克隆抗体包被硝酸纤维素膜；

封闭硝酸纤维素膜上的非特异性活性位点；

生物素标记可与待测抗原特异性结合的多克隆抗体；

配制大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液。

6.   根据权利要求5所述一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片的制备方法，其特征在于：所述制备大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素的步骤a采用改良过碘酸钠法制备，其具体步骤如下：

步骤一、取1 mg 大豆过氧化氢酶溶于100 μL PBS中，加入12 mg/mL NaIO₄溶液100 μL，混匀，置室温避光反应15 min；

步骤二、 取出步骤一得到的溶液，后加入100μL, 1%乙二醇室温反应30min；

步骤三、向步骤二得到的溶液中加入100ul, 5mg/ml 链酶亲和素，混匀，装入透析袋，于50 mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24 h，使大豆过氧化氢酶和链酶亲和素结合；

步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5 mg/ml NaBH₄溶液80 μL，混匀，置4℃还原反应2 h；

步骤五、加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5 h，132000 g离心15 min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；

步骤六、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化氢酶-链酶亲和素结合物，加PBS 500 μL复溶；

步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。