CN101603963A - 一种高通量斑点酶联免疫阵列检测方法 - Google Patents

Abstract

一种高通量斑点酶联免疫阵列检测方法，用于检测药物滥用，属于免疫分析测定领域。本方法将膜相材质制成适当大小的膜片，根据实际检测需要排布膜相阵列，粘覆于固体支持物上，在同一膜片上点入不同的药物抗原，通过多种药物的混合抗体进行高通量筛选。与传统检测试剂盒的单人份测定方式相比，本方法不仅可对测试样品多种非相关性分析物测试，还可对一组关系紧密的分析物进行测试比较，从而挖掘复杂数据间的具体信息，有效解决了目前对于药物滥用的测试通常一次只能针对一种药物，而对于大规模人群以及滥用者可能在一段时间内同时吸食几种药物，进行多种药物排查时费时费力和需要大量检测用品的问题。

Description

一种高通量斑点酶联免疫阵列检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速、高通量的斑点酶联免疫阵列检测方法，用于检测药物滥用，属于免疫分析测定领域。

背景技术

药物滥用一般是指违背了公认的医疗用途和社会规范而使用不当药物，药物滥用问题现已成为全世界面临的重大社会问题之一。随着滥用药物的使用范围蔓延，对检测技术的要求也随之增加，检测领域也逐渐广泛，如在军队、工作场所、学校、法医学鉴定以及兴奋剂检测等处均有涉及，而且部分检测领域需要同时对大量人员进行筛选排查。研究开发出灵敏、高效的检测方法，特别是适合较大规模排查使用的高通量的检测方法，既是社会的需要，也对控制药物滥用起到重要的作用。基于免疫学方法而产生的检测法操作简单，易于自动化和高通量，能快速准确地给出结果，而且无需繁琐的样品前处理过程，比较适合于对大量样本进行初查和筛选，适合现场快速检测，在进行药物滥用领域具备很大优势。

另外，目前药物滥用呈现多元化趋势，而由于吸食药物在体内的代谢特性和相伴杂质的情况，我们有必要将相关因素一起考虑，从而得出精确的药物滥用信息。例如在分析海洛因(3，6-二乙酰吗啡)的滥用情况时，就需要充分了解其代谢情况。海洛因的代谢物主要有吗啡和6-单乙酰吗啡(6-MAM)。其中，6-单乙酰吗啡是海洛因的一种特异性水解代谢物，可以在海洛因滥用者的血液、尿液或头发等检材中检测到。可待因是一种在海洛因滥用者体内与6-单乙酰吗啡相伴随的杂质物，也可以作为海洛因滥用的信息。单一的吗啡阳性测试结果不易说明问题，无法确定滥用者是吸食了吗啡还是海洛因。另一方面，美沙酮经常作为一种海洛因戒毒过程的替代药物使用，它的代谢物也可能同时被检测到。

目前，用于药物滥用检测的免疫分析技术主要有放射免疫分析、酶免疫分析、荧光偏振免疫分析等。放射免疫分析由于其自身的放射性危害而难于普及使用。同时，荧光偏振免疫分析等方法，由于需要借助大型设备，不利于现场大规模检测。酶免疫分析技术是使用具有催化活性的生物酶作为免疫反应标志的一种技术，是各种抗原、抗体检测的常规方法，适合于多种用途。酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和后来发展起来的金标试纸检测以其性能的优越性在毒品分析中展现出了广阔的应用前景。但是，传统方法也同样存在检测指标单一、分析能力不足等缺陷，而且实验结果无法长期保存，不宜长期留存备份。

斑点酶联免疫吸附试验(Dot Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，Dot-ELISA)是一种传统ELISA法的修饰形式，最早见于1982年Hawkes等人研究的Dot-ImmunobindingAssay，其特点为将NC膜作为固相反应界面进行免疫反应。Dot-ELISA法常用于血清学诊断，如蛋白质、病毒的抗原抗体检测，人类和动物的疾病诊断、感染分析等范围。与传统ELISA法相比，Dot-ELISA法主要在于使用的基质材料不同。采用NC膜(或PVDF膜)较酶标板具有一定优势：1)对蛋白质的吸附能力较强，可高效包被抗原；2)所需待测物体积少，仅需一个斑点的范围即可鉴定出结果，适用于微量待测物的测试情况；3)背景为不透光的白背景，可通过如DAB显色等化学显色反应肉眼鉴别，无需酶标仪等分光光度测量装置；4)反应快速，检测时间短等。虽然Dot-ELISA方法不适合定量化检测，但在进行定性检测方面较之传统ELISA方法有其特有的优势。

发明内容

本发明采用在同一膜片上点入不同的药物抗原，通过多种药物的混合抗体进行高通量筛选，以补充现有药物滥用检测技术，为实现快速现场检测，提供一种高效便捷的药物检测方法。此方法可应用到实际检测中去，现场对大量样品进行定性分析，找出多种分析物的滥用情况。

本方法的特征在于，将膜相材质制成适当大小的膜片，根据实际检测需要排布膜相阵列，粘覆于固体支持物上，每份膜片上分区点入1微升的不同待测药物抗原，待其充分结合后，向膜片上加入封闭液(2％牛血清白蛋白)，进行孵育；在这个过程中将待测药物的混合抗体与待检物(尿样、血样等)预反应一段时间；冲掉封闭液，向膜片上加入预反应的上述混合物(一张膜片对应一种待检物)，再次进行孵育；用PBST清洗测试板；再向膜面加入酶标第二抗体工作液，进行孵育；用PBST重复清洗，最后使用化学显色试剂(作为酶的底物)显示结果，可通过肉眼辨别测试结果。

膜相材质使用的是NC膜(硝酸纤维素膜)或PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)，膜面吸附蛋白的能力强，NC膜无需预处理即可高效吸附，PVDF膜经甲醇活化后的吸附能力也很强，使抗原物质包被充分。

膜片经切割制成，直径介于5mm到100mm之间。

加入被测试样品后，通过膜上的特异性抗原-抗体反应和酶标记的第二抗体进行检测。选择可以呈现出颜色反应的底物(如二氨基联苯胺，DAB)或化学发光的底物(如鲁米诺试剂)，显色或曝光后直接通过肉眼辨别。定性判断药物的滥用为通过观察膜上斑点的有无鉴定出测试结果的阴、阳性，即体液中待测药物及其代谢物的存在与否。通过竞争抑制法，测试结果显示出有斑点的情况为阴性结果，无斑点的为阳性结果。

本方法与传统检测试剂盒的单人份测定方式相比，有如下优点：

1、使用微量移液器在每份膜片上分区点上不同样品，同时由于每份膜片面积很小，将多张膜片固定于单块固体支持物上形成阵列的方式，大大提高检测通量，缩短检测时间。无论在检测项目或者检测量上均具有的高通量分析的特点，表现出此免疫检测阵列更经济，从而可进行大批量人员测试样品的筛选。

2、膜相具有白色背景，同时膜板结果可以保存较长时间，方便进行日后数据的调取与比较。

3、有效解决了目前对于药物滥用的测试通常一次只能针对一种药物，对于大规模人群以及滥用者可能在一段时间内同时吸食几种药物而言，进行多种药物的排查工作费时费力，更需要大量检测用品的问题。

4、通过多种药物的混合抗体进行高通量筛选。不仅可对测试样品多种非相关性分析物测试，还可对一组关系紧密的分析物进行测试比较，从而挖掘复杂数据间的具体信息。

附图说明

图1为本斑点酶联免疫阵列检测法通过竞争抑制原理对戒毒所病人尿样的实际检测结果。

具体实施方式

对44例戒毒所病人尿样同时进行4种药物滥用筛选，实现高通量(多药多尿)检测。

随着毒品药品滥用范围的蔓延，滥用者可能会同时吸食几种药物，使得以往的逐个逐项排查费时费力。因此研究开发出能同时检测多种指标的新技术、新方法并应用于实际的查毒过程十分必要。

测试前需通过药物标准物质对抗原、抗体的工作浓度及检测限进行标准化，找到最优的测试条件。实验具体操作步骤同前描述：1)将打孔器裁剪的NC膜圆片粘覆在塑料板上；2)用微量移液器点上四种待测药物抗原(药物-BSA)；3)用2％BSA封闭膜片1小时；4)孵育抗四种药物的混合抗体与待测尿样的混合液(1∶1混合)1小时，终浓度为各抗体的工作浓度；5)孵育HRP标记的第二抗体30分钟；6)DAB显色(用PBST洗涤步骤省略)。

实例是对四种常见毒品进行的测试，分别为：吗啡、美沙酮、甲基苯丙胺和巴比妥。如图1所示，在一张板上放置48个膜片，一张膜片对应一个待测尿样。其中前五排及第六排的前四个膜片为1-44的44例尿样的测试结果；最后四个膜片依次为阴性尿样对照、阴性对照(磷酸盐缓冲液)、阳性对照和空白对照。每个膜片上的四个点依次对应所检测的四种常见毒品：左上角为吗啡，右上角为甲基苯丙胺，左下角为美沙酮，右下角为巴比妥。由于测试小分子药物采用的是竞争性抑制原理，所以观察到的结果为阴性结果有斑点，阳性结果无斑点。所测试的44种尿样基本上为吗啡阳性或甲基苯丙胺阳性，也有双阳性的情况，还有一例样品检出为双阴性；结果中没有美沙酮或巴比妥阳性的情况。由于所有尿样都是经过商品化金标记试纸条测试过的，其结果可作为此方法的验证对照。验证结果表明，Dot-ELISA检测板的测试结果和商品化试纸条是一致的，从而确定了此方法的实用性。

Claims (3)

1、一种高通量斑点酶联免疫阵列检测方法，其特征在于，将膜相材质制成适当大小的膜片，根据实际检测需要排布膜相阵列，粘覆于固体支持物上，每份膜片上分区点入1微升的不同待测药物抗原，待其充分结合后，向膜片上加入封闭液，进行孵育；冲掉封闭液，向膜片上加入预反应的待测药物的混合抗体与待检物混合物，一张膜片对应一种待检物，再次进行孵育；用PBST清洗测试板；再向膜面加入酶标第二抗体工作液，进行孵育；用PBST重复清洗，最后使用化学显色试剂显示结果。

2、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，膜相材质使用的是硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜。

3、如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，膜片经切割制成，直径介于5mm到100mm之间。

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